基于納米壓痕技術研究藥物對胃腸道間質瘤細胞機械特性的影響

王文思，員瑜，王佳敏，施佳林，蹇林格，趙瀅，張?zhí)毂?/p>

（1.中國醫(yī)科大學生命科學學院生物化學與分子生物學教研室，沈陽 110122；2.中國科學院沈陽自動化研究所機器人研究室，沈陽 110016；3.四川大學華西臨床醫(yī)學院，成都 610041；4.中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院胃腸營養(yǎng)外科，沈陽 110004）

胃腸道間質瘤（gastrointestinal stromal tumor，GIST）是胃腸道最常見的間葉源性惡性腫瘤［1］。1983年，美國病理學家MAZUR和CLARK首先提出了GIST的概念［2］。GIST每年發(fā)病率約為10/100萬～20/100萬［3］，常發(fā)生在50歲以上人群。在約80%的GIST中發(fā)現致癌的c-kit突變，其11號外顯子突變是GIST中最常見的致癌突變（67%）［4］，這些突變包括點突變、框內缺失或插入，其余的突變?yōu)?號外顯子編碼突變（10%），13和17號外顯子中有較小程度的激活突變（＜2%）。約15%的GIST由血小板源性生長因子受體α（platelet-derived growth factor receptor α，PDGFRα）多肽激活驅動，12、14和18號外顯子顯示致癌突變。野生型GIST占GIST的5%～10%，不含c-kit或PDGFRα突變。由于受體酪氨酸激酶信號依賴，GIST可以用酪氨酸激酶抑制劑有效治療，如伊馬替尼、舒尼替尼和索拉非尼。盡管大多數患者的初始反應良好，但隨著時間的推移，異質性耐藥機制的發(fā)展，大多數患者的病情都有所進展。目前進行的研究旨在評估具有其他作用機制的藥物，單獨或與伊馬替尼或其他酪氨酸激酶抑制劑聯(lián)合使用，以避免高耐藥率。有研究［5］顯示，靶向蛋白激酶B抑制劑MK-2206似乎不足以抑制GIST細胞的生長和存活，然而將MK-2206與伊馬替尼聯(lián)合使用可顯著提高療效。目前的數據表明，在GIST中靶向多個分子靶點比單一治療更有效，未來可嘗試在臨床中實踐應用。

原子力顯微鏡利用探針接觸分子水平和細胞水平的樣品，可對生物體在近生理環(huán)境下進行納米級成像及力學特性研究［6］。原子力顯微鏡由微懸臂、檢測系統(tǒng)、施加力和距離的反饋控制系統(tǒng)、壓電陶瓷控制的移動系統(tǒng)、獲取數據與分析系統(tǒng)組成。許多疾病的起源可以從細胞的力學性質來考慮，如細胞黏彈性的改變和楊氏模量的改變與癌癥轉移和惡性轉化有關。原子力顯微鏡的力學測量提供了一種潛在的、基于單細胞尺度進行疾病診斷的新方法，探究其檢測過程中力學性質的轉變與人類疾病進展的關聯(lián)性，進而挖掘出力學檢測方法在藥效評估中的潛在價值［7］。

從患者體內分離的原代細胞比已經建立的來源相似的細胞系更適合于實驗研究，可能更準確地模擬患者情況，為體外藥物敏感性試驗和設計個體化治療方案提供更好的工具。本研究成功建立原代GIST細胞，將伊馬替尼與舒尼替尼聯(lián)合用藥作為GIST新的治療方案，分析二者聯(lián)合有無協(xié)同增效作用，并利用原子力顯微鏡對原代培養(yǎng)的GIST細胞進行藥物作用后機械特性測量，初步探討二者聯(lián)合作用的價值。

1 材料與方法

1.1 材料

甲磺酸伊馬替尼片購自瑞士Novartis Pharma Schweiz AG公司，蘋果酸舒尼替尼膠囊購自意大利Pfizer公司，胎牛血清購自中國Gibco公司，RPMI-1640、胰酶、雙抗購自以色列BI公司，CCK-8試劑盒購自美國Invigentech公司，膠原酶購自美國Sigma公司，PCR引物的合成和序列測定由上海生工生物公司完成，QIAamp RNA Mini Kit、QIAGEN OneStep RTPCR Kit購自德國QIAGEN公司。伊馬替尼和舒尼替尼分別配制成2 000 μmol/L的母液，-80 ℃保存，使用時倍比稀釋至3.91、7.81、15.63、31.25、62.50、125.00 μmol/L濃度的工作液。

1.2 原代細胞培養(yǎng)

仔細剔除GIST組織外周可能污染和壞死的組織，標本用D-Hanks液洗2次，再用含雙抗的無血清RPMI-1640沖洗5～6次。在培養(yǎng)皿中用無菌眼科剪將GIST組織中心剪成數個小組織塊（盡量避開血管），盡量剪碎。將剪碎的組織塊移到離心管中再次洗滌3次。加入2倍體積的1 mg/mL胰酶和1 mg/mL膠原酶，37 ℃培養(yǎng)箱內消化60 min。收集單個和小塊組織的瘤細胞，1 000 r/min離心5 min，洗滌3次，接種于細胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)條件為含15%胎牛血清的RPMI-1640，置入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內。第2天輕輕吸棄上清液，換新鮮培養(yǎng)液，此后每隔5 d換液或傳代1次。

1.3 PCR實驗

采用QIAGEN RNeasy Mini Kit進行GIST細胞總RNA進行提取?；蛞镄蛄校篶-kit8號外顯子，上游引物5’-CAGCAGTCTGACCTATGGC-3’，下游引物5’-GCTCAGCTCCTGGACAGAAA-3’；c-kit9號 外顯子，上游引物5’-GATTGATTGATTGATTTTCCTAG-3’，下游引物5’-GCAGGCAGAGCCTAAACATC-3’；c-kit11號外顯子，上游引物5’-CCAGAGTGCTCTAAT GACTGAGA-3’，下游引物5’-AAACAAAGGAAGCC ACTGGA-3’；c-kit13號外顯子，上游引物5’-TACTG CATGCGCTTGACATC-3’，下游引物5’-TAATCTAG CATTGCCAAAATCA-3’；c-kit17號外顯子，上游引物5’-CATCATTCAAGGCGTACTTTTG-3’，下游引物5’-TGCAGGACTGTCAAGCAGAG-3’；PDGFRα12號外顯子，上游引物5’-TCCAGTCACTGTGCTGCTTC-3’，下游引物5’-AAGACTCCCTTTTCCCTTGC-3’；PDGFRα14號外顯子，上游引物5’-ACTGGTTTTGGTTCCCAC AG-3’，下游引物5’-CAATGATTCGCAGCAACG-3’；PDGFRα18號外顯子，上游引物5’-ACCATGGATCA GCCAGTCTT-3’，下游引物5’-GGTCAGGCTCATCC TCCTTCA-3’。按照QIAGEN OneStep RT-PCR Kit說明書進行PCR擴增體系配制及PCR擴增。

1.4 CCK-8法測定GIST細胞體外藥物敏感性

將生長處于對數期的貼壁GIST細胞消化后轉移至離心管，1 000 r/min低速離心離心5 min，進行細胞計數。實驗分為空白對照組、伊馬替尼組、舒尼替尼組和聯(lián)合用藥組，每組設置5個復孔，每孔加入稀釋好的細胞懸液。接種48 h，細胞貼壁生長良好后吸出各孔培養(yǎng)基。分別加入31.25 μmol/L伊馬替尼、15.63 μmol/L舒尼替尼以及31.25 μmol/L伊馬替尼和15.63 μmol/L舒尼替尼聯(lián)合處理的細胞生長液，放入孵箱分別培養(yǎng)24、48和72 h。藥物處理相應時間后，加入10% CCK-8溶液，放入孵箱繼續(xù)培養(yǎng)3 h，待培養(yǎng)基液體變?yōu)槌壬纯煞湃朊笜藘x檢測。酶標儀波長設定為450 nm，測定吸光度值，分析數據。

1.5 原子力顯微鏡檢測GIST細胞楊氏模量

應用Icon 原子力顯微鏡（美國Veeco）和MLCT探針（彈性系數為0.01 N/m），以2 μm/s的速率在近生理條件下，測定藥物作用前后原代培養(yǎng)的GIST細胞的楊氏模量，即細胞機械彈性。逼近曲線記錄了探針在逼近接觸細胞并在細胞表面產生壓痕的過程，回退曲線記錄了探針從細胞表面回退到原始位置的過程。分析逼近曲線，計算不同藥物處理后GIST細胞的楊氏模量值。每個實驗組測量5個GIST細胞，每個細胞壓10條以上力曲線。

根據計算公式（1）和（2）可知需要測量得到懸臂梁的偏轉量x和壓痕深度δ，其余的參量為已知的或是通過實驗測量得到的［8］。應用Nanoscope ⅣAFM系統(tǒng)和商用Nanoscope軟件進行數據分析。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 GIST細胞原代培養(yǎng)

取瘤組織消化后進行培養(yǎng)，于倒置顯微鏡下觀察，原代培養(yǎng)的GIST細胞呈梭型、多角形、核大，互不重疊，呈單層生長。見圖1。

圖1 GIST細胞倒置顯微鏡下圖像Fig.1 Inverted microscopic image of gastrointestinal stromal tumor cells

2.2 外顯子測序分析

對原代培養(yǎng)的GIST細胞進行總RNA的提取，并對c-kit和PDGFRα基因的8個外顯子進行核酸擴增和正向、反向測序比對，見圖2。得到的序列與NCBI中Blast庫的序列進行比對，發(fā)現c-kit基因11號外顯子發(fā)生點突變，胸腺嘧啶突變?yōu)橄汆堰?，為雜合性突變。此點突變致使GIST細胞11號外顯子的第559位氨基酸由由纈氨酸（GTT）突變?yōu)樘於彼幔℅AT），導致了GIST的發(fā)生，見圖3。其余外顯子無突變。本研究中，原代培養(yǎng)的GIST細胞已經傳30余代，在傳至30代時進行以上測序，未發(fā)現二次突變。

圖2 c-kit基因11號外顯子發(fā)生點突變Fig.2 Point mutation in exon 11 of the c-kit gene

圖3 第559位點纈氨酸突變?yōu)樘於彼酕ig.3 Mutation of valine to aspartic acid at site 559

2.3 藥物敏感性結果

CCK-8實驗結果顯示，伊馬替尼單獨作用于GIST細胞24 h時，7.81 μmol/L濃度組與對照組比較，細胞抑制率的差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05，圖4A）。舒尼替尼單獨作用于GIST細胞24 h時，15.63 μmol/L濃度組與對照組比較，細胞抑制率的差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05，圖4B）。2種藥物對GIST細胞的作用均呈時間與濃度依賴性。聯(lián)合用藥組為等濃度聯(lián)合作用，抑制效果更顯著（圖4C）。

圖4 伊馬替尼和舒尼替尼單獨和聯(lián)合作用于GIST細胞時細胞增殖率的變化Fig.4 Changes in proliferation rate of GIST cells treated with imatinib and sunitinib alone or in combination

藥物作用48 h時，伊馬替尼組的IC50值為34.23±0.37，舒尼替尼組為28.85±0.52，同濃度聯(lián)合用藥組為11.97±0.18。CompuSyn是一款根據Chou-Talalay數學模型建立的應用軟件，通過計算聯(lián)合指數（combination index，CI）分析兩藥聯(lián)合作用效果：CI＜1時，兩藥為協(xié)同作用效果；CI=1時，兩藥為疊加作用效果；CI＞1時，兩藥為拮抗作用效果。本研究結果顯示，當生長抑制率Fa＜1時，大部分CI＜1，且Fa值越小CI值越小。當Fa值介于0.1～0.7之間時，CI值介于0.90～0.98之間，說明兩藥聯(lián)合作用效果較好。因此，本研究后續(xù)實驗單獨用藥組選擇31.25 μmol/L伊馬替尼和15.63 μmol/L舒尼替尼（此時兩藥抑制率均在80%左右），聯(lián)合用藥組選用同濃度藥物處理細胞，此濃度下聯(lián)合作用為協(xié)同作用。

2.4 楊氏模量測量結果

采用Icon 原子力顯微鏡和MLCT探針對GIST細胞測量楊氏模量（圖5），藥物作用48 h后，空白對照組楊氏模量為（8.26±1.06）kPa，伊馬替尼組為（4.90±0.54）kPa，舒尼替尼組為（5.51±0.79）kPa，聯(lián)合用藥組為（2.66±1.08）kPa。高斯擬合結果（圖6）顯示，伊馬替尼和舒尼替尼均可引起細胞楊氏模量減小，聯(lián)合用藥效果更顯著（P＜ 0.01）。

圖5 MLCT針尖圖像和探針測量細胞楊氏模量Fig.5 Image of MLCT tip and measurement of Young's modulus by probe

圖6 GIST細胞楊氏模量高斯擬合函數分布Fig.6 Gaussian fitting function distribution of Young’s modulus of gastrointestinal stromal tumor cells

3 討論

GIST的發(fā)生、發(fā)展由多種腫瘤相關分子突變所致，目前認為c-kit或PDGFRα受體酪氨酸激酶的組成型激活突變是致癌的起始事件。突變的受體蛋白在不依賴配體的情況下持續(xù)自我激活，引起下游信號通路蛋白增多，導致細胞增殖和分化、腫瘤形成。

伊馬替尼作為酪氨酸激酶抑制劑，最初被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準用于治療慢性粒細胞白血病，之后被批準作為轉移性和復發(fā)性GIST的一線藥物。然而，大多數患者會在2年內出現繼發(fā)性耐藥［9］。研究［10］顯示，在具有GIST 11號外顯子密碼子557～558突變的患者中，伊馬替尼治療后患者也存在生存時間減少的趨勢。因此，迫切需要能夠與伊馬替尼聯(lián)合應用的凋亡誘導劑。而舒尼替尼既可抑制血管內皮生長因子受體和轉染過程中的重排，又可以阻斷腫瘤生長所需的血液和營養(yǎng)物質供給，有可能解決GIST患者的伊馬替尼耐藥性問題。

本研究成功培養(yǎng)c-kit基因11號外顯子發(fā)生點突變的GIST細胞，V559D為GIST細胞突變的熱點。為研究舒尼替尼對伊馬替尼處理GIST細胞的增效作用，本研究采用CCK-8實驗檢測兩藥單獨和聯(lián)合用藥對GIST細胞的增殖抑制作用。結果顯示，2種藥物對原代培養(yǎng)的V559D突變的GIST細胞均有明顯的生長抑制作用，呈時間與劑量依賴性，且聯(lián)合用藥的抑制效果大于單獨用藥（P＜ 0.05）。

從生物學角度分析，細胞對外界刺激的機械反應和細胞內部的生物力學反應，對保持細胞的生物活性具有重要意義。細胞通過改變自身行為和重塑微環(huán)境，動態(tài)適應機械因素的刺激，這種動態(tài)適應的結果不僅對胚胎發(fā)育和成人生理具有決定性作用，還與許多疾病密切相關。如在癌癥形成過程中，為了促進與腫瘤轉移相關的微血管生成和建立，癌細胞楊氏模量和黏附力逐漸降低。同樣，侵襲性細胞通常楊氏模量和黏附性更低，但在不同器官和來源于不同器官的癌細胞中可能有不同的結論。這種機械特性的變化可能是由肌動蛋白絲引起的，肌動蛋白骨架的溶解導致楊氏模量顯著降低［11］。因此，機械特性近來被認為是一種新的生物標志物，而細胞表面機械特性研究另外一個最大的優(yōu)勢，在于能夠在保證細胞存活的擬生理條件下，對活細胞進行檢測，進而得到大量有效仿真的生物學數據。

有研究［12］指出，伊馬替尼通過降低鞘氨醇-1-磷酸進而引起肺癌細胞骨架蛋白重新分布，并同時降低了細胞的楊氏模量。LEE等［12］發(fā)現，腫瘤壞死因子-α刺激內皮細胞后，機械剛度增加了50%。KUNG等［13］則指出，順鉑處理的黑色素瘤細胞可以增強細胞骨架的機械拉伸，還可促進細胞骨架的重排，導致細胞楊氏模量降低43%。CAI等［14］采用不同濃度的青蒿琥酯作用細胞24 h后，發(fā)現細胞的楊氏模量下降了近三分之一。WANG等［15］指出，與對照樣品相比，經佛波酯處理的K562細胞的彈性模量增加了近3倍。因此，本研究采用納米壓痕技術，在擬生理狀態(tài)下，對GIST細胞表面機械特性的變化進行檢測，從而探討藥物產生的作用。通過檢測伊馬替尼、舒尼替尼及二者聯(lián)合用藥處理前后GIST細胞機械強度的變化，通過軟件測量分析發(fā)現藥物處理后GIST細胞楊氏模量降低，聯(lián)合用藥效果更明顯。原子力顯微鏡的納米力學檢測技術可實現在近生理條件下測定癌細胞機械強度變化，為藥物研發(fā)早期評估抗癌藥物作用效率方面提供依據。

綜上所述，伊馬替尼和舒尼替尼對GIST細胞有增殖抑制作用，呈作用時間與劑量依賴性，聯(lián)合用藥時表現為協(xié)同作用。本研究基于納米壓痕技術發(fā)現，伊馬替尼和舒尼替尼均降低了GIST細胞的楊氏模量，聯(lián)合用藥時機械性能改變更明顯。