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    石仙桃總黃酮提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性分析

    2021-12-30 01:28:30鞠玉旋謝倩陳清西
    園藝與種苗 2021年11期
    關(guān)鍵詞:仙桃提取液光度

    鞠玉旋,謝倩,陳清西

    (福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院,福建福州 350002)

    石仙桃(Pholidota chinensisL indl),蘭科石仙桃屬多年生附生草本植物,俗稱石上蓮、石橄欖、石穿盤等,主要分布于我國云南、廣東、廣西、福建等省份,常以附生方式生長于海拔100~2700 m的山區(qū)林下、樹上及巖石縫隙中[1-3]。研究表明,石仙桃主要化學(xué)成分為萜類、酚類、黃酮類、多糖、菲類、生物堿等,因其具有養(yǎng)陰潤肺、清熱解毒、利濕消瘀等功效,常用全草或假鱗莖入藥治療頭疼、頭暈及咳血等疾病[4-5]。目前對石仙桃的研究主要集中在其化學(xué)成分的研究上,包括多糖、菲類、總酚以及總黃酮等的研究,對石仙桃繁殖以及栽培研究較少[6-10]。

    石仙桃跟鐵皮石斛、金線蓮等蘭科植物一樣含有黃酮類成分,黃酮類成分具有局部麻醉、鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗驚厥等多種藥用療效,可廣泛應(yīng)用于醫(yī)療研究[11-13]。目前總黃酮提取主要有乙醇回流法、熱浸提法、超聲波提取法、微波提取法等方法[14-16]。該研究以乙醇-水作為提取體系,采用超聲輔助法作為石仙桃總黃酮提取方法,并通過響應(yīng)面法優(yōu)化石仙桃總黃酮的提取率,為石仙桃總黃酮提取提供優(yōu)化工藝。通過研究石仙桃總黃酮對DPP H自由基和羥自由基的清除能力,探討其是否具有體外抗氧化活性。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 試驗材料。石仙桃全草采集于福建省泉州市南安市向陽鄉(xiāng)都山農(nóng)林專業(yè)合作社林下中草藥種植基地。

    1.1.2 主要儀器與試劑。①儀器:LG J-25C型真空冷凍干燥機(jī),北京四環(huán)科學(xué)儀器廠;AT Y124型電子天平,島津(中國)有限公司;K Q-300DE數(shù)據(jù)超聲清洗儀,昆山超聲儀器有限公司;X M TD-8222恒溫鼓風(fēng)干燥箱,上海精宏實驗設(shè)備有限公司;S L-250型高速中藥多功能粉碎機(jī),浙江松青儀器廠;Tecan Infinite F200/M200型多功能酶標(biāo)儀,瑞士Tecan集團(tuán)公司。②試劑:蘆丁,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;V C,上海生工工程股份有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼,東京化工株式會社;無水乙醇、水楊酸、A l(NO3)3、N a NO2、N a O H、F eS O4·7H2O、30%H2O2均為國產(chǎn)分析純。

    1.2 方法

    1.2.1 石仙桃樣品預(yù)處理。挑選從基地采摘的生長較好的石仙桃植株,摘除枯葉及干癟假鱗莖,挑選成熟飽滿的假鱗莖,用清水清洗后,經(jīng)雙蒸水浸泡沖洗后自然晾干,放置-40℃冰箱進(jìn)行預(yù)處理,冷凍后采用真空冷凍干燥機(jī)于-40℃,100 pa條件下,凍干至恒重,干燥樣品用中藥粉碎機(jī)磨碎,過60目篩,粉末裝入50 mL凍存管放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。精確稱取蘆丁20 mg,溶于80%乙醇,定容至100 mL,配成0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液,分別取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL至10 mL刻度試管中,補(bǔ)充80%乙醇至5 mL加5%亞硝酸鈉0.5 mL,搖勻靜置5 min,加10%硝酸鋁0.5 mL,搖勻靜置5 min,加4%氫氧化鈉3.0 mL,加80%乙醇定容至刻度,搖勻靜置15 min。依次吸取反應(yīng)液300μL,使用酶標(biāo)儀測定波長510 nm處反應(yīng)液吸光值。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度x為橫坐標(biāo),吸光度y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.2.3 石仙桃總黃酮提取。精確稱取石仙桃粉末1.000 g,置于100 mL三角瓶內(nèi),設(shè)定超聲溫度為60℃,超聲時間30 min,在不同的超聲輔助提取條件下超聲提取,抽濾后多次洗滌合并濾液,定容到100 mL,即得石仙桃總黃酮提取液。

    1.3 單因素試驗

    選擇提取次數(shù)、乙醇濃度、超聲功率和料液比進(jìn)行單因素試驗,考察各因素對石仙桃總黃酮提取率的影響。

    1.3.1 提取次數(shù)對總黃酮提取率的影響。精確稱取石仙桃粉末1.00 g,加入濃度為80%的乙醇溶液,超聲功率420 W,料液比1∶40(g/mL),提取溫度60℃,提取1~4次分別合并提取液并定濃縮容至100 mL待測。

    1.3.2 乙醇濃度對總黃酮提取率的影響。精確稱取石仙桃粉末1.00 g,提取3次,超聲功率420 W,料液比1∶40(g/mL),提取溫度60℃,加入50%~90%濃度乙醇溶液對石仙桃總黃酮進(jìn)行提取,分別濾過提取液合并濃縮定容到100 mL待測。

    1.3.3 超聲功率對總黃酮提取率的影響。精確稱取石仙桃粉末1.00 g,提取3次,加入濃度為80%的乙醇溶液,料液比1∶40(g/mL),提取溫度60℃,設(shè)定300~540 W的超聲功率對石仙桃總黃酮進(jìn)行提取,分別合并提取液并濃縮定容到100 mL待測。

    1.3.4 料液比對總黃酮提取率的影響。精確稱取石仙桃粉末1.00 g,提取3次,加入濃度為80%的乙醇溶液,提取溫度60℃,超聲功率420 W,料液比1∶30~1∶50(g/mL)對石仙桃總黃酮進(jìn)行提取,分別合并提取液并濃縮定容到100 mL待測。

    1.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計

    以單因素試驗的結(jié)果為基礎(chǔ),選擇對石仙桃總黃酮提取影響大的因素為考察條件,設(shè)定超聲溫度為60℃,超聲時間為30 min,提取3次,以液料比(A)、超聲功率(B)、乙醇濃度(C)為考察因素,以總黃酮提取率為響應(yīng)值,根據(jù)響應(yīng)面Box-Behnken試驗設(shè)計原理,進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面試驗(表1)。

    表1 響應(yīng)面法實驗因素水平

    1.5 總黃酮提取率測定

    精密吸取樣品液1 mL至10 mL刻度試管中,加入80%乙醇補(bǔ)充至5 mL,按照標(biāo)曲測定方法中自“加5%亞硝酸鈉0.5 mL”方法開始,每個處理重復(fù)3次,在510 nm波長測定吸光度,根據(jù)標(biāo)曲計算總黃酮的質(zhì)量濃度,代入公式(1)計算總黃酮提取率,公式如下。

    式中:C為標(biāo)曲內(nèi)計算得總黃酮質(zhì)量(mg);VT為提取液體積(mL);VS為測定液吸取體積(mL);n為稀釋倍數(shù);m為樣品質(zhì)量濃度(g)。

    1.6 石仙桃總黃酮體外抗氧化活性測定

    1.6.1 對DPP H自由基清除能力測定。參照陳建福、楊美蓮等[17-18]的方法并略做修改。取2 mL不同濃度的石仙桃總黃酮提取液于10 mL刻度試管中,加入2 mL 0.2 mmo L/L的DPP H-乙醇溶液,充分混勻,放置陰暗處避光條件下反應(yīng)30 min,酶標(biāo)儀波長517 nm處測得吸光度為A1;取同樣體積95%乙醇代替DPP H-乙醇溶液與石仙桃總黃酮提取液反應(yīng),混勻后陰暗處避光處理30 min,在波長517 nm處測得吸光度為A2;以95%乙醇代替總黃酮提取液與DPP H-乙醇溶液充分混勻作為空白對照組,避光條件下反應(yīng)30 min,在波長517 nm處測得吸光度為A0。以相同體積分?jǐn)?shù)VC作為陽性對照,按照公式(2)計算總黃酮對DPP H自由基的清除率。

    式中:A1測定組吸光度;A2對照組吸光度;A0空白組吸光度。

    1.6.2 對羥自由基清除能力測定。參照唐靜月等[19]的方法并略作修改。取1 mL不同濃度的石仙桃總黃酮提取液于10 mL刻度試管中,依次加入9 mmoL/L的水楊酸-乙醇溶液和9 mmo L/L的F eS O4溶液各1 mL,充分混勻后加入0.01%H2O2溶液1 mL,用95%乙醇定容至刻度,混勻后在37℃恒溫水浴鍋反應(yīng)30 min,在波長510 nm處測定吸光度為A1;以單蒸水代替H2O2按照相同處理加入以上試劑在波長510 nm處測得吸光度為A2;以單蒸水代替樣品溶液按照相同處理加入以上試劑測定510 nm處吸光度記為A0。以相同體積分?jǐn)?shù)VC作為陽性對照,按照公式(3)計算總黃酮對羥自由基的清除率。

    式中:A1測定組吸光度;A2對照組吸光度;A0空白組吸光度。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

    以蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)品,在510 nm測定吸光度,吸光度(y)作為縱坐標(biāo),質(zhì)量濃度(x)作為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算得線性回歸方程:y=0.926x+0.0141,R2=0.9967。

    2.2 單因素結(jié)果分析

    2.2.1 提取次數(shù)對總黃酮提取率的影響。從圖1可以看出,石仙桃總黃酮提取率受提取次數(shù)影響的變化幅度較小,在提取次數(shù)增加時總黃酮的提取也會小幅上升,在設(shè)置提取次數(shù)為4次時,提取次數(shù)達(dá)3次時,提取率達(dá)到最高,超過3次提取率下降,故提取3次為提取總黃酮的最優(yōu)次數(shù)。

    圖1 提取次數(shù)對總黃酮提取的影響

    2.2.2 乙醇濃度對總黃酮提取率的影響。從圖2可以看出,石仙桃總黃酮提取率隨著乙醇濃度的提高呈先增大后減小的趨勢,且當(dāng)加入濃度為70%乙醇溶液時,石仙桃總黃酮提取率達(dá)到最高,隨后提取率開始下降,故濃度為70%乙醇對總黃酮提取的最佳濃度。

    圖2 乙醇濃度對總黃酮提取的影響

    2.2.3 超聲功率對總黃酮提取率的影響。從圖3可以看出,石仙桃總黃酮提取率隨著超聲功率的變大而呈現(xiàn)出先增長后下降的趨勢,且超聲功率對總黃酮提取影響較大,當(dāng)功率在420 W時提取率最高,當(dāng)超聲功率大于420 W時總黃酮提取率逐漸下降,提取率下降較小,故420 W是對石仙桃總黃酮提取的最佳功率。

    圖3 超聲功率對總黃酮提取的影響

    2.2.4 料液比對總黃酮提取率的影響。從圖4可以看出,石仙桃總黃酮提取率隨著料液比的變大而呈現(xiàn)先增長后下降趨勢,當(dāng)料液比在1∶40(g/mL)時,總黃酮提取率達(dá)到最高,后呈現(xiàn)下降趨勢,故以1∶40(g/mL)對石仙桃總黃酮進(jìn)行提取。

    圖4 料液比對總黃酮提取的影響

    2.3 響應(yīng)面優(yōu)化確定石仙桃總黃酮的提取工藝

    2.3.1 模型的建立及顯著性分析。以單因素試驗的結(jié)果為優(yōu)化基礎(chǔ),采用Design Expert 11軟件,以石仙桃總黃酮提取率為響應(yīng)值,根據(jù)Box-Benhnken試驗設(shè)計原理,對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,分析各因素對總黃酮提取率的影響(表2)。

    從表2可以看出,用Design Expert 11對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,得到石仙桃總黃酮提取率預(yù)測值(Y)與液料比(mL/g)、超聲功率(W)、乙醇濃度(%)的多元回歸模型:Y=1.31+0.013 8A+0.020 0B+0.001 3C-0.007 5A B+0.0100A C+0.0075B C-0.0315A2-0.0240B2-0.0215C2。從表3可以看出,該回歸模型P值為0.0008,P<0.01,表明該二次方程回歸模型擬合極顯著,且失擬項P為0.9264,其值>0.05,表明試驗結(jié)果與擬合值差距不顯著,可用于總黃酮提取的模型分析。由表內(nèi)F值及P值可知各因素的影響效應(yīng)為:提取功率>液料比>乙醇濃度。回歸方程一次項C不顯著(P>0.05),A、B項極顯著(P<0.01),二次項A2、B2、C2極顯著(P<0.01),交互項表現(xiàn)均不顯著(P>0.05),說明各試驗因素與石仙桃總黃酮提取率之間不是簡單的線性關(guān)系,該模型與試驗的擬合度好,可以對石仙桃總黃酮的提取率進(jìn)行預(yù)測與分析。

    表2 響應(yīng)面設(shè)計方案與結(jié)果

    表3 回歸方程方差分析

    2.3.2 模型驗證及工藝確定。通過Desig n Expert 11軟件繪制3個因素之間交互作用對石仙桃總黃酮提取率的影響的曲面圖和等高線分析,從圖5可以看出,3個因素交互作用的響應(yīng)面圖相對較為陡峭且具有一個相交最高點,等高線圖均呈橢圓狀,交互作用對石仙桃總黃酮的提取都具有明顯的影響,會隨著因素條件的優(yōu)化而增加,說明通過調(diào)節(jié)超聲功率、料液比和乙醇濃度3個因素可以提高石仙桃總黃酮的提取率。

    圖5 各工藝條件交互作用對總黃酮提取的影響

    利用響應(yīng)面模型和試驗數(shù)據(jù)得到石仙桃總黃酮提取最佳優(yōu)化方案為液料比38.60∶1(mL/g),超聲功率418.224 W,乙醇濃度76.525%,在此條件下得到總黃酮提取率為1.291%,為了在實際試驗中更好地操作,將各提取條件修正為液料比40∶1(mL/g),超聲功率420 W,乙醇濃度75%,并將此方案進(jìn)行驗證性試驗,重復(fù)3次,獲得試驗平均值為1.30%,與預(yù)估值僅差0.69%,與預(yù)估值差距不顯著,證明此方案可用于石仙桃總黃酮的提取。

    2.4 石仙桃總黃酮體外抗氧化活性分析

    2.4.1 DPP H自由基清除能力測定結(jié)果。從圖6可以看出,在不同提取液濃度下,石仙桃總黃酮與對照品VC對DPP H自由基清除率隨著濃度的增大而逐漸提高,石仙桃總黃酮的清除率低于V c對照品清除率,清除能力最高可達(dá)88.35%,其與V c對照品相差10.25%,在對DPP H自由基的清除上具有差距,但同時說明石仙桃總黃酮對DPP H自由基具有較好的清除能力。

    圖6 DPPH自由基清除能力測定結(jié)果

    2.4.2 羥自由基清除能力測定結(jié)果。從圖7可以看出,石仙桃總黃酮對羥自由基的清除率與對照品V c的清除率呈正相關(guān),石仙桃總黃酮的清除率低于V c對羥自由基的清除率,其清除率可達(dá)93.04%,與V c對照品相差6.24%,其在對羥自由基的清除上具有差距,說明石仙桃總黃酮對羥自由基也具有較高的清除能力。

    圖7 羥自由基清除能力測定

    3 結(jié)論與討論

    石仙桃具有治療頭疼、眩暈、惡心、痢疾等疾病的功效[20],同時也具有較好的觀賞價值,其主要化學(xué)成分為多糖、黃酮類、多酚類、脂肪類、萜類、菲類等[6,21-24]。該研究以石仙桃總黃酮提取工藝優(yōu)化為研究方向,目前總黃酮的提取方式主要有乙醇回流法、熱浸提法、超聲波提取法、微波提取法等[6,21-24]。劉建新[27]采用乙醇-回流法以正交試驗得到最佳提取條件為提取溫度60℃,料液比1∶50(g/mL),提取時間50 min,石仙桃總黃酮提取達(dá)22.03 mg/g;陳文娟[27]以熱浸提法獲得石仙桃總黃酮最佳工藝參數(shù)為提取溫度66℃,乙醇濃度65%,料液比30 mL/g,提取時間151 min,石橄欖總黃酮提取率達(dá)1.23%;劉建新[29]采用微波輔助提取法獲得石仙桃總黃酮提取工藝為微波功率300 W,提取時間30 min,提取溫度60℃,料液比1∶20(g/mL),石仙桃總黃酮提取達(dá)31.41 mg/g。由此看來,不同提取工藝對石仙桃提取率的影響較大,這可能是因為不同的提取工藝對石仙桃總黃酮的溶出影響較大,在提取過程中不同的黃酮類物質(zhì)溶出的提取條件不同,導(dǎo)致部分黃酮類成分無法溶出或分解失效,因此各提取工藝的提取率不同,若要獲得最佳提取率必須選擇相應(yīng)的提取條件才能夠達(dá)到最佳的提取效果[14,16,30]。

    總黃酮具有較好的體外抗氧化活性[15]。唐靜月[19]等研究鐵皮石斛花總黃酮對DPP H自由基、羥自由基和A B T S自由基的清除能力發(fā)現(xiàn),總黃酮含量與抗氧化活性具有相關(guān)性;李亞軍[31]等研究發(fā)現(xiàn)黑老虎總黃酮具有較好的抗氧化活性,其與VC對照品相比較對自由基的清除率略低;吳巖斌[32]提取金線蓮總黃酮進(jìn)行抗氧化試驗,結(jié)果表明總黃酮的清除能力隨著濃度的升高而增強(qiáng),且有一個最高點,并且不同時期和不同栽培模式對其影響也不同。通過參考他人的結(jié)果顯示,多種中草藥都具有抗氧化活性,該試驗在參照陳建福與唐靜月的試驗方法的基礎(chǔ)上,考察石仙桃總黃酮的抗氧化活性,以VC為陽性對照,結(jié)果表明石仙桃總黃酮對DPP H自由基和羥自由基的清除能力低于VC對照品,但也具有較好的抗氧化活性。

    該研究采用超聲輔助方法,以單因素試驗結(jié)果選擇影響因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗,得到最佳工藝條件為料液比1∶40(g/mL),乙醇濃度75%,超聲功率420 W,在此條件下,得到石仙桃總黃酮最大提取率為1.30%。超聲輔助提取法與其他提取方法相比操作簡單,且提取率較高,并且能夠節(jié)省時間,成本較低。同時考察石仙桃總黃酮的抗氧化活性,以VC為陽性對照,結(jié)果表明石仙桃總黃酮對DPP H自由基和羥自由基均具有較好的清除能力,其清除能力低于VC對照,石仙桃總黃酮具有較好的體外抗氧化活性。此研究以超聲輔助法為提取方法,優(yōu)化了石仙桃總黃酮的提取方法,同時考察了其抗氧化活性,可以為石仙桃化學(xué)成分和抗氧化活性以及藥用價值的研究提供指導(dǎo)。

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