液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豆芽中2種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑

崔 敏

（榮成市檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東榮成 264300）

豆芽是餐桌上常見的美食，含有蛋白質(zhì)、維生素和粗纖維等豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有補(bǔ)充人體所需氨基酸、降低膽固醇、促進(jìn)腸胃蠕動(dòng)和消腫利尿等作用，深受人們喜愛[1-3]。近年來，不法商販為了縮短豆芽的生長(zhǎng)周期和增加產(chǎn)量，在加工過程中使用了植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，促進(jìn)植物細(xì)胞分裂、生長(zhǎng)以及豆芽下胚軸增粗，抑制軸長(zhǎng)和根部萌發(fā)，以達(dá)到加粗豆芽頸部生長(zhǎng)的目的[4-6]。人們食用后，能引起惡心、嘔吐等胃部不良反應(yīng)，損害人體皮膚、食道、胃黏膜等，給人們的身體健康造成巨大危害[7-9]。市場(chǎng)監(jiān)督管理局、農(nóng)業(yè)部、國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)發(fā)布了《關(guān)于豆芽生產(chǎn)過程中禁止使用6-芐基腺嘌呤等物質(zhì)的公告》（2015年第11號(hào)），明確規(guī)定在豆芽生產(chǎn)過程中禁止使用4-氯苯氧乙酸和6-芐基腺嘌呤等物質(zhì)[10]，并將其列為食品監(jiān)管領(lǐng)域重點(diǎn)工作，在每年的國(guó)家食品安全監(jiān)督抽檢實(shí)施細(xì)則中均有體現(xiàn)?；诙寡恐兄参锷L(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的測(cè)定（BJS 201703）方法[11]，采用QuEChERS離心管凈化樣品時(shí)，會(huì)損失部分樣品提取液，影響試驗(yàn)準(zhǔn)確度，因此本研究建立了LC-C18固相萃取柱凈化法，凈化提取液時(shí)抽干萃取柱，損失極少，且操作簡(jiǎn)單快速，能夠準(zhǔn)確測(cè)定豆芽中4-CPA和6-BAP的含量。

1 試驗(yàn)部分

1.1 試劑與藥品

4-CPA和6-BAP為有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（北京壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司）；甲醇、乙腈（歐普森（Oceanpak）色譜純）；甲酸、乙酸銨、無水硫酸鎂、無水乙酸鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司）；實(shí)驗(yàn)室用水符合GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水。

1.2 儀器與設(shè)備

三重四級(jí)桿液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：TSQ Quantum Ultra EMR System，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；電子分析天平：AR224CN，±0.000 1 g，上海天平儀器廠；高速冷凍離心機(jī)：CF16RXⅡ，日本日立；全自動(dòng)均質(zhì)器：AH-40，?？疲粶u旋混合器：Vortex I，IKA；氮吹儀：MTN-5800，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；超純水系統(tǒng)：重慶摩爾水處理設(shè)備有限公司的MOL PW500EDI；C18色譜柱：thermo，hypersil gold（C18） 100 mm×2.1 mm，1.9 μm；LC-C18固相萃取柱：CNW，6 mL/500 mg。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 溶液的配制

（1）混合標(biāo)準(zhǔn)中間液的配制。4-CPA標(biāo)準(zhǔn)溶液和6-BAP標(biāo)準(zhǔn)溶液，含量均為100 μg/mL，準(zhǔn)確吸取1 mL 2種標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，甲醇稀釋定容，配制成10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液；準(zhǔn)確吸取10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液1 mL，于10 mL容量瓶中，甲醇稀釋定容，將其變成質(zhì)量濃度為1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。

（2）含1%甲酸的乙腈溶液配制。量取10 mL甲酸，加入乙腈稀釋至1 000 mL，混勻。

（3）含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨溶液配制。稱取0.385 4 g乙酸銨，用水溶解并稀釋至1 000 mL，加入1 mL甲酸，混勻。

1.3.2 樣品前處理

（1）提取。準(zhǔn)確稱取均質(zhì)試樣10.0 g（精確到0.1 g）置于50 mL的聚丙烯離心管中，加入20 mL含1%甲酸的乙腈溶液，高速勻漿提取2 min，加入4 g無水硫酸鎂和1 g無水硫酸鈉，立即渦旋混合1 min，以10 000 r/min離心5 min使乙腈和水相分層。

（2）凈化。LC-C18固相萃取柱，使用前用水和甲醇各6 mL活化，精確量取上層乙腈溶液4 mL于LC-C18固相萃取柱中，氮吹管接收凈化液，并抽干萃取柱，于45 ℃氮?dú)獯蹈?，甲醇定容? mL，過0.22 μm有機(jī)濾膜上機(jī)測(cè)定。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取空白試樣10.0 g（準(zhǔn)確到0.1 g）置于50 mL的聚丙烯離心管中，進(jìn)行前處理，作為空白基質(zhì)提取液。分別精確量取混合標(biāo)準(zhǔn)中間液（1 μg/mL）0 μL、10 μL、20 μL 和 40 μL，及標(biāo)準(zhǔn)混合中間液（10 μg/mL）10 μL、15 μL 和 20 μL，用空白基質(zhì)提取液定容至1.0 mL，作為混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，濃度依次為0 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、100 ng/mL、150 ng/mL和200 ng/mL，臨用時(shí)現(xiàn)配[11]。

1.3.4 儀器條件

色譜條件：C18色譜柱柱溫：30 ℃，流動(dòng)相：溶劑A（含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨溶液），溶劑B（甲醇）；流速：0.25 mL/min；梯度洗脫條件：0～1 min 5%B，1～ 3 min 5% ～ 95%B，3～ 7.1 min 95%B，7.1～8 min 95%B，8～10 min 5%B。

質(zhì)譜條件：ESI源，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），氬氣為碰撞氣；毛細(xì)管溫度（℃）：350，鞘氣（Arb）：45，輔助氣（Arb）：10，噴霧電壓（V）：3 000，離子掃描模式：負(fù)離子掃描模式。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

取1 μg/mL的4-CPA和6-BAP混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，在液相質(zhì)譜聯(lián)用儀ESI-模式下掃描，優(yōu)化質(zhì)譜條件，選擇信號(hào)強(qiáng)度理想的母離子和子離子作為定性定量離子，篩選結(jié)果見表1。取100 ng/mL的4-CPA和6-BAP混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，上機(jī)驗(yàn)證目標(biāo)物出峰效果，4-CPA和6-BAP的總離子流圖結(jié)果見圖1，出峰時(shí)間分別為5.78 min和5.66 min，離子豐度比分別為34.1%和49.0%。

圖1 4-CPA和6-BAP的總離子流圖

表1 4-CPA和6-BAP的質(zhì)譜條件

2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液曲線

4-CPA和6-BAP的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液均為0 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL，40 ng/mL、100 ng/mL、150 ng/mL和200 ng/mL，上機(jī)檢測(cè)，外標(biāo)法定量。結(jié)果數(shù)據(jù)分析，出現(xiàn)3個(gè)母離子，分別是質(zhì)核比（m/z）為 184.905的 4-CPA、 質(zhì) 核 比（m/z）為 187.000的4-CPA和質(zhì)核比（m/z）為224.070的6-BAP，線性回歸方程分別為：Y=729.645+769.358X、Y=3 779.49+2 249.89X和Y=1 991.1+5 621.12X，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 9、0.999 4和0.997 5，呈現(xiàn)線性良好，見圖2。

圖2 4-CPA和6-BAP的線性曲線

2.3 回收率和精密度

豆芽樣品中，加入4-CPA和6-BAP混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，選擇在 10 μg/kg，20 μg/kg，100 μg/kg 進(jìn)行 3 水平回收試驗(yàn)，每個(gè)水平6個(gè)平行，回收率和精密度結(jié)果如表2所示，平均回收率為84.3%～94.6%，RSD為2.6%～10.3%。

表2 樣品平均回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.4 檢出限和定量限

空白基質(zhì)中加入4-CPA和6-BAP標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行前處理，上機(jī)測(cè)定，扣除基線后，以信噪比S/N=3時(shí)對(duì)應(yīng)的含量為檢出限，信噪比S/N=10時(shí)對(duì)應(yīng)的含量為定量限，結(jié)果顯示4-CPA的檢出限和定量限分別為 1.54 μg/kg和 4.28 μg/kg，6-BAP 的檢出限和定量限分別為 0.237 μg/kg 和 0.459 μg/kg。

3 結(jié)論

本文對(duì)豆芽中4-CPA和6-BAP的液相質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)法的前處理過程、液相色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，選擇甲醇活化后的LC-C18固相萃取柱凈化樣品，操作簡(jiǎn)單、快速且準(zhǔn)確度高。質(zhì)譜條件優(yōu)化后，篩選出了4-CPA和6-BAP響應(yīng)強(qiáng)度較高的離子作為定量定性離子，其離子豐度比為分別為34.1%和49.0%，允許的相對(duì)偏差范圍為±25%[12]，可以有效提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。結(jié)果顯示該方法前處理簡(jiǎn)單快速、線性良好，回收率和精密度高，可以準(zhǔn)確測(cè)定豆芽中4-CPA和6-BAP的含量，滿足國(guó)內(nèi)外豆芽中對(duì)4-CPA和6-BAP限量的檢測(cè)需求。