基于數(shù)字PCR的質(zhì)粒核酸標準物質(zhì)合作定值研究

牛春艷，張永卓，楊佳怡，董蓮華，傅博強，王 晶

(中國計量科學研究院，北京100029)

1 引 言

標準物質(zhì)是具有足夠均勻和穩(wěn)定的特定特性的物質(zhì)，其特性被證實適用于測量中或標稱特性檢查中的預期用途。有證標準物質(zhì)則是附有權威機構發(fā)布的文件，提供使用有效程序獲得的具有不確定度和溯源性的一個或多個特性量值的標準物質(zhì)[1]。有證標準物質(zhì)是量值溯源和傳遞過程中的計量標準，用于儀器設備校準、檢測方法評價、產(chǎn)品質(zhì)量控制等方面。

豬繁殖與綜合癥是一種對養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)造成嚴重經(jīng)濟損失的高度傳染性疾病。豬繁殖與綜合癥病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)的核酸檢測技術目前被廣泛應用于豬繁殖與綜合癥的診斷和預防控制、流行病學研究等過程中[2～5]。研制豬繁殖與綜合癥病毒核酸標準物質(zhì)，將為不同檢測產(chǎn)品質(zhì)量控制和評價、不同實驗室間檢測結果比對提供標尺。

數(shù)字PCR方法是一種不依賴于外標對核酸分子進行核酸定量的技術，通過直接計數(shù)再根據(jù)泊松分布計算樣本原始核酸拷貝數(shù)，可以實現(xiàn)對核酸絕對定量[6～8]。按照獨立單元的實現(xiàn)方式，數(shù)字PCR可分為基于芯片式微流控的微陣列芯片式數(shù)字PCR和基于液滴微流控的微滴數(shù)字PCR[9]。

質(zhì)粒DNA標準物質(zhì)是含有外源基因的線性或環(huán)狀質(zhì)粒分子，易于保存與運輸，使用方便。中國計量科學研究院研制了多種轉基因定量檢測用質(zhì)粒分子標準物質(zhì)[10]，并對質(zhì)粒DNA與基因組DNA的可替代性做了比較研究，驗證了質(zhì)粒分子的適用性。本研究針對制備的豬繁殖與綜合癥病毒質(zhì)粒核酸標準物質(zhì)候選物，建立數(shù)字PCR定量方法，聯(lián)合多家實驗室利用數(shù)字PCR方法對標準物質(zhì)進行合作定值研究，并評定了標準物質(zhì)不確定度，獲得了豬繁殖與綜合癥病毒美洲經(jīng)典株(PRRSV CH-1a)及美洲變異株(PRRSV HuN4)兩種質(zhì)粒核酸標準物質(zhì)。

2 實驗部分

2.1 儀器及試劑

微滴數(shù)字PCR系統(tǒng)(QX200，美國伯樂公司)；普通PCR儀(Veriti，美國Applied Biosystems公司)；芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)(Bio-Mark，美國富魯達公司)。

Tagman基因表達預混液(美國Applied Biosystems公司)；37k集成微流體芯片(Sample loading reagent，美國富魯達公司)；微滴式數(shù)字PCR反應液(SuperMix for Probes，美國伯樂公司)：微滴發(fā)生專用油、微滴分析專用油。

實驗中豬繁殖與呼吸綜合癥病毒美洲經(jīng)典株(PRRSV CH-1a)與豬繁殖與呼吸綜合癥病毒株美洲變異株(PRRSV HuN4)為中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。

2.2 標準物質(zhì)候選物制備

選擇PRRSV HuN4及CH-1a兩種毒株，將基因組cDNA中包含M基因及N基因的一段保守序列克隆至質(zhì)粒中，經(jīng)過EcoRⅠ單酶切線性化，得到線性化質(zhì)粒標準物質(zhì)候選物，模擬病毒基因組cDNA?？寺∮脭U增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列為：

PRRSV-C-F：

(5′-CGGGATCCAAGGTGCTTTTGGCGTT-3′)

PRRSV-C-R：

(5′-AACTGCAGCGCATGGTTCTCGCCAAT-3′)。

2.3 微滴式數(shù)字PCR

微滴式數(shù)字PCR反應體系為：SuperMix for Probes 10 μL，上、下游引物各0.8 μL(終濃度400 nmol/L)，探針0.8 μL(終濃度240 nmol/L)，cDNA模板4 μL，加ddH2O補足終體積至20 μL。實驗擴增條件為：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性30 s，54 ℃退火 1 min，40個循環(huán)；98 ℃變性10 min。

反應引物及探針序列：

上游引物：5′-CTAGGCCGCAAGTACATTCT-3′

下游引物：5′-GACGACAAATGCGTGGTTATC-3′

探針：

5′-FAM-ATTTGCCGCAATCGGATGAAAGCC-BHQ1-3′

引物及探針由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2.4 芯片式數(shù)字PCR

芯片式數(shù)字PCR反應體系為：Tagman基因表達預混液2 μL，Sample loading reagent 0.2 μL，上、下游引物各0.16 μL(終濃度200 nmol/L)，探針0.16 μL(終濃度400 nmol/L)，模板0.8 μL，加ddH2O補足終體積至4 μL。實驗擴增條件為：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火1 min，45個循環(huán)。反應引物及探針序列與微滴式數(shù)字PCR相同。

2.5 合作定值過程

選擇在核酸檢測領域具備較強能力的實驗室，最終選擇8家實驗室參加兩種標準物質(zhì)的定值。將參加定值的實驗室(包括組織單位)編號為A,B,C,D,E,F,G,H,I，其中CH-1a由8家單位(A,B,C,D,E,F,G,H)定值，HuN4由8家單位(A,B,C,D,E,F,G,I)定值。每個實驗室測定4管樣品，每管樣品重復測量3次。

2.6 定值數(shù)據(jù)統(tǒng)計

根據(jù)JJF 1343-2012《標準物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計學原理》，對原始數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析與處理。利用夏皮羅-威爾克法檢驗定值數(shù)據(jù)的正態(tài)性，利用狄克遜法及格拉布斯法兩種方法分別檢驗實驗室測量結果的可疑值，利用科克倫法檢驗各組數(shù)據(jù)是否等精度，用各組平均值表示定值結果。

3 結果與討論

3.1 微滴式數(shù)字PCR方法

前期通過參數(shù)優(yōu)化建立了微滴式數(shù)字PCR方法[11]，首先對引物及探針濃度進行了梯度設置，選擇的體系為引物濃度400 nmol/L，探針濃度240 nmol/L；其次對退火溫度進行了優(yōu)化，根據(jù)陰性擴增信號與陽性擴增信號差異最大的原則，選擇54 ℃作為退火條件。利用建立的方法檢測質(zhì)粒核酸標準物質(zhì)。以線性化質(zhì)粒為模板，進行梯度稀釋，檢驗方法線性關系及重復性, 結果見圖1。圖1中X為稀釋系數(shù);Y為核酸拷貝數(shù)濃度,copy/μL?？梢钥闯鏊⒌奈⒌问綌?shù)字PCR方法檢測質(zhì)粒線性關系良好(R2為0.999 8)，最小相對標準偏差為1.53%。

圖1 微滴式數(shù)字PCR反應線性關系Fig.1 Linearity of ddPCR

3.2 芯片式數(shù)字PCR方法

優(yōu)化建立了芯片式數(shù)字PCR方法。由于37 k芯片反應室個數(shù)為770，實驗時需將陽性反應count個數(shù)控制在200～700，因此未進行芯片式數(shù)字PCR反應線性關系比較，而是以兩個不同濃度的線性化質(zhì)粒為模板(4倍稀釋)，檢驗了方法的重復性。如表1所示。

表1 芯片式數(shù)字PCR方法的重復性Tab.1 Repeatability of cdPCR

在濃度水平1相對標準偏差為3.09%，在濃度水平2相對標準偏差為3.23%，表明在兩個濃度下，方法的重復性良好。對利用兩種不同濃度模板進行擴增得到的原始樣品的定量結果進行了統(tǒng)計性檢驗，結果表明在兩個不同濃度下，方法的定量結果無顯著差異(p=0.49)。因此可選擇在此濃度范圍內(nèi)對模板進行定量檢測。

3.3 兩種不同平臺定量結果比較

本研究利用兩種數(shù)字PCR平臺建立了微滴式數(shù)字PCR及芯片式數(shù)字PCR的方法，對方法的特異性、線性及重復性進行了檢驗，并進一步對這兩種不同平臺對線性化質(zhì)粒模板的定量結果進行統(tǒng)計學檢驗，驗證了不同平臺數(shù)字PCR方法之間的一致性。

以HuN4，CH-1a兩種線性化質(zhì)粒為模板，分別利用微滴式數(shù)字PCR(ddPCR)及芯片式數(shù)字PCR(cdPCR)兩個不同平臺的方法進行定量，將定量結果進行t檢驗，如圖2所示，結果表明兩種模板不同方法間p>0.05，表明無顯著差異，兩種方法定量結果一致性良好。

圖2 兩種不同平臺定量結果比較Fig.2 Comparison of two dPCR methods

3.4 合作定值結果

兩種標準物質(zhì)的合作實驗室檢測結果見表2及表3。利用夏皮羅-威爾克法檢驗定值數(shù)據(jù)的正態(tài)性，結果表明CH-1a及HuN4兩種樣品的8組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布。

表2 CH-1a實驗室定值結果統(tǒng)計分析Tab.2 Aanalysis of the results of collaborative labs for CH-1a 108 copy·μL-1

表3 HuN4實驗室定值結果統(tǒng)計分析Tab.3 Analysis of the results of collaborative labs for HuN4 108 copy·μL-1

用狄克遜法及格拉布斯法兩種方法分別檢驗8家實驗室測量結果的可疑值。經(jīng)狄克遜檢驗，查得f(0.05,8)=0.608。對于CH-1a，r1=0.168，rn=0.150；對于HuN4，r1=0.042，rn=0.325。r1值和rn值均小于f(α,n)，因此所有數(shù)據(jù)保留。經(jīng)格拉布斯法檢驗，查得λ(0.05,8)=2.126。對于CH-1a，標準偏差s=3.18×107；對于HuN4，標準偏差s=2.98×107。經(jīng)計算，所有殘差均小于λ(0.05,8)·s，因此所有數(shù)據(jù)均保留。

用科克倫法檢驗，m=8,n=4,α=0.01,查得臨界值C(0.01,8,4)=0.520 9,經(jīng)計算得CCH-1a=0.264 1，CHuN4=0.519 8，因此，CCH-1a

CH-1a及HuN4的測試結果均以8組數(shù)據(jù)的算術平均值表示。

3.5 不確定度評定

標準物質(zhì)的不確定度uCRM來源由3個部分組成：第1部分是標準物質(zhì)合作定值引入的不確定度uchar；第2部分是標準物質(zhì)均勻性引入的不確定度ubb；第3部分是標準物質(zhì)穩(wěn)定性引入的不確定度ustab。

其中合作定值引入的不確定度考慮了重復性引入的不確定度，反應室體積引入的不確定度[12]以及稀釋過程引入的不確定度。

重復性引入的不確定度采用A類評定，按如下公式計算：

CH-1a重復性引入不確定度為：

uA=1.12×107copy/μL，urel(A)=0.012

HuN4重復性引入不確定度為：

uA=1.05×107copy/μL，urel(A)=0.014

單反應室體積引入的不確定度采用文獻[12]的結果0.8%。

稀釋過程引入的不確定度包括移液器引入的不確定度以及溫度變化引入的不確定度。移液器引入的不確定度根據(jù)移液器校準證書上給出的校準點容量相對誤差計算，溫度變化引入的不確定度根據(jù)水的膨脹系數(shù)2.1×10-4℃-1，按均勻分布來計算。稀釋過程的相對合成標準不確定CH-1a為0.020，HuN4為0.022。

定值過程的相對合成標準不確定度CH-1a為0.025，HuN4為0.027。

根據(jù)以下公式計算標準物質(zhì)的合成標準不確定度：

在置信概率95%條件下，計算擴展不確定度U=kuCRM(k=2)。結果如表4所示。

表4 兩種標準物質(zhì)不確定度Tab.4 Uncertainty of the two reference materials

3.6 標準物質(zhì)定值結果表達

本研究得到的兩種標準物質(zhì)結果表達如下：豬繁殖與呼吸綜合癥病毒美洲經(jīng)典株(PRRSV CH-1a)質(zhì)粒核酸標準物質(zhì)標準值為 9.40×108copy/μL，擴展不確定度U(k=2)為 0.9×108copy/μL；豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲變異株(PRRSV HuN4)質(zhì)粒核酸標準物質(zhì)標準值為7.78×108copy/μL，擴展不確定度U(k=2)為1.0×108copy/μL。

4 結 論

本研究選擇將豬繁殖與呼吸綜合癥病毒基因組cDNA中保守序列克隆至質(zhì)粒中，經(jīng)過單酶切線性化，模擬病毒基因組cDNA，以數(shù)字PCR作為定值方法為其準確定值，制備了線性化質(zhì)粒標準物質(zhì)。優(yōu)化建立了質(zhì)粒核酸的數(shù)字PCR方法，并對微滴式數(shù)字PCR及芯片式PCR方法的檢測結果一致性進行了檢驗。多家實驗室采用一種或多種準確性確認的方法進行合作定值是保證標準物質(zhì)量值準確性的定值方式之一[13～15]。

利用建立的數(shù)字PCR方法組織8家實驗室對制備的兩種豬繁殖與呼吸綜合癥病毒質(zhì)粒核酸標準物質(zhì)進行了合作定值。在合作定值過程中發(fā)現(xiàn)，高濃度樣本在進行數(shù)字PCR檢測時，需要將樣本提前進行稀釋，而稀釋過程的控制對結果的準確性保證至關重要，包括移液器的計量校準，稀釋用耗材的性能評價，稀釋的方法等方面。另外，由于生物樣本的特殊性，在經(jīng)過稀釋處理后的樣本應盡快進行檢測，防止樣品發(fā)生變化。

本項目研制的豬繁殖與綜合癥病毒質(zhì)粒標準物質(zhì)可直接用于方法建立、產(chǎn)品研發(fā)中標準曲線的繪制，也可用于工作標準的賦值、方法評價、產(chǎn)品質(zhì)量控制等諸多方面?？蔀樯唐坊《竞怂釞z測試劑盒中質(zhì)控品或校準品提供質(zhì)量控制和量值溯源標準，保證檢測結果的準確、可比。