干擾素λ聯(lián)合順鉑介導(dǎo)STAT信號(hào)通路對(duì)乳腺癌細(xì)胞抗增殖作用的研究

彭鑫宇，劉佳妮，楊 陽，李小龍

0 引言

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率約占全球女性癌癥的24.2%，嚴(yán)重威脅女性的生命健康[1]。目前，化療仍是乳腺癌的重要治療方法。順鉑是臨床應(yīng)用最為廣泛的化療藥物，其通過抑制DNA復(fù)制、RNA及蛋白質(zhì)的合成，破壞腫瘤細(xì)胞膜，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡，抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[2]。臨床研究顯示，晚期乳腺癌患者身體基礎(chǔ)差，且順鉑等化療藥物對(duì)患者機(jī)體影響較大[3]。因此，尋找有效且不良反應(yīng)較小的治療手段是目前臨床研究的關(guān)鍵。干擾素-λ(Interferon-λ,IFN-λ)是Ⅲ型干擾素，其成員包括IFN-λ1、IFN-λ2與IFN-λ3，具有抗病毒、抗增殖、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等功能。李剛等[4]研究發(fā)現(xiàn)，IFN-λ與肝癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)；Lasfar等[5]研究顯示，過表達(dá)IFN-λ可抑制黑色素瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。這些研究表明，IFN-λ具有抑癌因子作用。IFN-λ通過激發(fā)多級(jí)磷酸化并激活酪氨酸激酶2(Tyrosine kinase 2,TYK2)和JAK激酶1(Janus Kinase 1,JAK1)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，使信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子1與2(Signal transducer and activator of transcription 1/2,STAT1/2)的酪氨酸殘基磷酸化，而啟動(dòng)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促使干擾素刺激基因3的形成，進(jìn)入細(xì)胞核啟動(dòng)相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄，從而抑制病毒復(fù)制與細(xì)胞分裂增殖、產(chǎn)生抗病毒、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等[6]。研究發(fā)現(xiàn)，IFN-λ通過激活STAT信號(hào)通路發(fā)揮其抗腫瘤生物學(xué)功能[7-8]，提示IFN-λ的抗腫瘤機(jī)制與STAT信號(hào)通路相關(guān)。IFN-λ協(xié)同順鉑可抑制食管癌細(xì)胞的增殖，提示IFN-λ聯(lián)合順鉑可能具有調(diào)控腫瘤惡性生物學(xué)行為的功能[9]。因此，本研究通過探究IFN-λ聯(lián)合順鉑(Cisplatin，CDDP)對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡及周期的影響，闡明IFN-λ聯(lián)合CDDP的抗腫瘤機(jī)制，以期為IFN-λ在乳腺癌的治療研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231購自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)基、胰酶與胎牛血清購自中國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；CDDP與干擾素-λ購自美國(guó) R&D 公司，BCA蛋白定量試劑盒、蛋白提取試劑盒購自中國(guó)康維世紀(jì)生物科技有限公司；CCK8試劑盒購自武漢默沙克生物科技有限公司；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自碧云天生物科技有限公司；p-STAT1、p-STAT2、STAT1、STAT2及山羊抗鼠二抗購自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；STAT信號(hào)通路抑制劑HY-B0069購自美國(guó)MCE公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 MDA-MB-231細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為5組：①對(duì)照組：DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；②干擾素-λ組(IFN-λ組)：含干擾素-λ(30 ng/ml)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；③CDDP組：含CDDP(0.3 μM)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；④干擾素-λ+CDDP組(IFN-λ+CDDP組)：含干擾素-λ(30 ng/ml)與含CDDP(0.3 μM)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h;⑤干擾素-λ+CDDP+HY-B0069組(IFN-λ+CDDP+HY-B0069組):含干擾素-λ(30 ng/ml)、CDDP(0.3 μM)及5 μM的STAT信號(hào)通路抑制劑HY-B0069的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。

1.3 CCK8法檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞的存活率 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1.5×103個(gè)/100 μl，接種于96孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h。根據(jù)上述分組加入對(duì)應(yīng)藥物，作用于MDA-MB-231細(xì)胞，每組均設(shè)置3個(gè)平行孔，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取出96孔板，每孔加入 10 μl的CCK-8，37 ℃孵育2 h，于460 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值(OD值)，以不予任何處理的空白對(duì)照組的活力為100%，計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡與周期變化 將各組MDA-MB-231細(xì)胞利用胰酶消化，離心收集于離心管內(nèi)，將細(xì)胞在預(yù)冷磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中洗滌2次，避光下加入5 μl FITC annexin V和5 μl碘化丙鈉(PI)，靜置15 min，加入400 μl Binding Buffer，混勻后放置于冰上，樣品在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。收集各組MDA-MB-231細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)目調(diào)整為1×106個(gè)/ml，PBS洗滌2次，2 500 r/min離心5 min，盡可能去除上清，逐滴加入-20 ℃預(yù)冷的70%乙醇1 ml固定細(xì)胞，邊加邊振蕩，4 ℃固定30 min以上。使用PBS洗滌2次，2 000 r/min離心5 min，棄上清，加入50 μl 100 μg/ml的RNase，37 ℃孵育30 min，加入200 μl 50 μg/ml的碘化丙啶(PI)，充分振蕩，孵育15 min后，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析細(xì)胞周期。

1.5 Western blot檢測(cè)p-STAT1、p-STAT2、STAT1及STAT2蛋白表達(dá) 采用遇冷的含有蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液提取各組MDA-MB-231細(xì)胞蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，具體操作步驟根據(jù)說明書進(jìn)行。SDS-PAGE凝膠電泳分離等量蛋白，濕轉(zhuǎn)法將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后，于4 ℃下與大鼠抗人抗體p-STAT1、p-STAT2、STAT1及STAT2(1∶1 500)孵育過夜，用TBST洗膜5 min×3次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗鼠二抗(1∶1 000)37 ℃孵育1 h，用TBST洗膜5 min×3次，采用ECL顯影，凝膠成像儀曝光拍照。

2 結(jié)果

2.1 干擾素λ與CDDP對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的協(xié)同抗增殖作用 CCK8法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，IFN-λ組、CDDP組和IFN-λ+CDDP組作用MDA-MB-231細(xì)胞的存活率顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與IFN-λ組和CDDP組相比，IFN-λ+CDDP組MDA-MB-231細(xì)胞存活率顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 干擾素λ與CDDP對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的協(xié)同抗增殖作用

2.2 干擾素λ聯(lián)合CDDP對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，IFN-λ組、CDDP組及IFN-λ+CDDP組的MDA-MB-231細(xì)胞凋亡能力均升高。與IFN-λ組與CDDP組相比，IFN-λ+CDDP組的MDA-MB-231細(xì)胞凋亡能力升高。見圖2。

圖2 干擾素λ聯(lián)合CDDP對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響

2.3 干擾素λ聯(lián)合CDDP對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，IFN-λ組、CDDP組及IFN-λ+CDDP組的MDA-MB-231細(xì)胞G1期占比升高；與IFN-λ組和CDDP組相比，IFN-λ+CDDP組MDA-MB-231細(xì)胞G1期占比升高。見圖3。

圖3 干擾素λ聯(lián)合CDDP對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞周期的影響

2.4 干擾素λ聯(lián)合CDDP對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞STAT信號(hào)通路的影響 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，IFN-λ組、CDDP組及IFN-λ+CDDP組MDA-MB-231細(xì)胞的p-STAT1與p-STAT2蛋白表達(dá)升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與IFN-λ組和CDDP組相比，IFN-λ+CDDP組MDA-MB-231細(xì)胞的p-STAT1與p-STAT2蛋白表達(dá)升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 干擾素λ聯(lián)合CDDP對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞STAT信號(hào)通路的影響

2.5 STAT信號(hào)通路抑制劑HY-B0069對(duì)干擾素λ聯(lián)合CDDP作用MDA-MB-231細(xì)胞的影響 CCK8法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組或HY-B0069組相比，IFN-λ+CDDP組，IFN-λ+CDDP+HY-B0069組的MDA-MB-231細(xì)胞的存活率顯著降低(P<0.05)，前兩組無明顯差異(P>0.05)；而與IFN-λ+CDDP組相比，IFN-λ+CDDP+HY-B0069組細(xì)胞存活率明顯升高(P<0.05)；流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組或HY-B0069組相比，IFN-λ+CDDP組，IFN-λ+CDDP+HY-B0069組的MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡率顯著升高，且G1期細(xì)胞占比增加，前兩組無明顯差異；而與IFN-λ+CDDP組相比，IFN-λ+CDDP+HY-B0069組細(xì)胞凋亡率與G1期細(xì)胞比例均明顯降低。見圖5。

圖5 STAT信號(hào)通路抑制劑HY-B0069對(duì)干擾素λ聯(lián)合CDDP作用MDA-MB-231細(xì)胞的影響

3 討論

乳腺癌作為一種高度異質(zhì)性腫瘤，是女性癌癥相關(guān)死亡的第二大原因[10-11]。近年隨著腫瘤免疫研究的發(fā)展，免疫治療已成為繼手術(shù)、放化療之后的新的治療手段[12]。腫瘤免疫治療主要針對(duì)機(jī)體的免疫系統(tǒng)，借助免疫系統(tǒng)的力量抑制腫瘤進(jìn)展。腫瘤免疫治療包括單克隆抗體與小分子化合物、靶向治療、腫瘤疫苗及細(xì)胞因子治療等[13]。細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞(巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、T細(xì)胞等)和非免疫細(xì)胞(內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞、纖維母細(xì)胞等)經(jīng)刺激而合成分泌的具有廣泛生物學(xué)活性的小分子蛋白[14]。楊媚[15]的研究顯示，干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白3的表達(dá)，進(jìn)而影響乳腺癌細(xì)胞增殖。Lasfar等[5]研究顯示，IFN-λ一方面可誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞表面MHC I類表達(dá)，提高NK/NK T細(xì)胞的殺瘤活性，另一方面可抑制腫瘤在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移，這提示IFN-λ具有抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的功能。

IFN-λ是Ⅱ型細(xì)胞因子家族成員之一，與Ⅰ型IFN的基因及結(jié)構(gòu)不同，IFN-λ由IFN-λ1(IL-29)、IFN-λ2(IL-28A)和IFN-λ3(IL-28B)3個(gè)亞型組成，通過與其受體結(jié)合，調(diào)控STAT信號(hào)通路，形成干擾素刺激調(diào)節(jié)因子進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，影響腫瘤進(jìn)展[16]。近年研究發(fā)現(xiàn)，IFN與化療藥物聯(lián)合影響腫瘤的惡性生物學(xué)行為。Li等[17]研究發(fā)現(xiàn)，IFN-MBP通過激活細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡通路基因p53、p21、CDK2、cyclin A、caspase 9、Bcl-2和Bax，可增強(qiáng)多柔比星乳腺癌化療的療效。Legrier 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ與順鉑聯(lián)合可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。李競(jìng)等[9]研究發(fā)現(xiàn)，IFN-λ聯(lián)合順鉑通過激活凋亡的線粒體通路及死亡受體通路，且下調(diào)凋亡抑制基因Survivin表達(dá)，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑及阿霉素的藥物敏感性。本研究發(fā)現(xiàn)，IFN-λ與CDDP聯(lián)合應(yīng)用，可進(jìn)一步抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞增殖活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞停滯于G1期，表明CDDP可提高IFN-λ對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的抑制。

近年研究顯示，IFN-λ可以在多種腫瘤細(xì)胞中激活信號(hào)通路，例如Burkitt′s淋巴瘤[19]、乳腺癌[20]、肝癌[21]及肺癌[22]。Niwa等[23]研究發(fā)現(xiàn)，IFN-λ可誘導(dǎo)上皮細(xì)胞STAT1/STAT2信號(hào)通路的激活。Li等[24]研究發(fā)現(xiàn)，STAT1激活的程度隨IFN-λ刺激強(qiáng)度的增加而增強(qiáng)。這些研究提示，IFN-λ的抑癌機(jī)制可能與STAT通路相關(guān)。此外，Yamauchi等[25]研究發(fā)現(xiàn)，IFN-λ誘導(dǎo)ISGs表達(dá)，激活Caspase3和Caspase7并促進(jìn)凋亡，可能與STAT通路持續(xù)激活相關(guān)；陳元巖等[26]研究發(fā)現(xiàn)，華蟾素通過抑制STAT通路活化，抑制胃癌腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這說明，STAT信號(hào)通路參與腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡的調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn)，IFN-λ聯(lián)合CDDP可激活MDA-MB-231細(xì)胞的STAT信號(hào)通路，且STAT信號(hào)通路抑制劑可影響IFN-λ聯(lián)合CDDP對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖、凋亡及周期的作用，表明IFN-λ聯(lián)合CDDP影響MDA-MB-231細(xì)胞的抗增殖作用，可能與激活STAT信號(hào)通路相關(guān)。

綜上所述，IFN-λ聯(lián)合CDDP可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞停滯于G1期，這可能與STAT信號(hào)通路相關(guān)。本研究為IFN-λ聯(lián)合化療藥物治療乳腺癌的研究提供新的思路。