一株高產(chǎn)胞外多糖的乳酸芽孢桿菌的篩選及功能鑒定

丁 濤， 靳寶林， 楊曉宇, 白林含

(四川大學生命科學學院生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室， 成都610064)

芽孢桿菌作為益生菌用于生產(chǎn)發(fā)酵食品和保存食品已有很多年的歷史.因其具有分泌蛋白酶、抗菌物質(zhì)的能力以及在胃腸道環(huán)境下較強的生存能力，得到越來越多的關(guān)注[1].芽孢桿菌是一種外源性的芽孢形成細菌，通常不能定植于胃腸道中，但可保持胃腸道微生物的良好平衡以及改善動物的生產(chǎn)性能[2].已有研究表明益生芽孢桿菌可以在胃腸道的生理損傷條件下起預防作用[3],同時因產(chǎn)生胞外多糖而具有體外清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化的能力和體內(nèi)提高抗氧化酶的活性、抗脂質(zhì)過氧化的能力，還可調(diào)節(jié)內(nèi)源性抗氧化劑的活性[4].大量從天然發(fā)酵食物中分離出具有益生菌特性的芽孢桿菌，正以多種形式商業(yè)化[5].

微生物胞外多糖是具有糖苷鍵的高分子量聚合物的大分子.多種微生物包括細菌、真菌、藻類均能在其生長過程中分泌胞外多糖，相比而言細菌產(chǎn)生能力較強.胞外多糖不僅具有抗氧化活性，還具有特殊的生理活性，如降低膽固醇、抗腫瘤和調(diào)節(jié)機體免疫能力等，是功能性保健產(chǎn)品和醫(yī)藥產(chǎn)品的重要成分[6].微生物胞外多糖還可能在調(diào)節(jié)腸道菌群中起重要作用，如雙歧桿菌的應用[7].

本實驗室從四川懷遠發(fā)酵米糕作坊環(huán)境中分離純化了多株芽孢桿菌，對其中高產(chǎn)胞外多糖和乳酸的XQ進行分子鑒定、功能鑒定及模擬胃腸道的耐受性試驗以及菌株安全性方面探究，為開發(fā)益生菌提供新的資源菌株.

2 材料與方法

2.1 材 料

菌株(XQ)，由本實驗室分離保存；L-乳酸，購自成都市科隆化學品有限公司；血瓊脂平板，購自鄭州安圖生物工程股份有限公司；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌由四川大學王紅寧教授實驗室提供；OXOID藥敏紙片購自Thermo Scientific公司.貨號分別為CT0024B、CT0041B、CT0425B、CT0020B、CT0058B、CT0013B、CT0264B、 CT0052B、 CT1754B.

2.2 實驗方法

2.2.1 16S rDNA鑒定 采用M13的通用引物：M13F: 5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′；M13R: 5′-CAGGAAACAGCTATGACC-3′.進行菌液PCR驗證，由成都擎科公司進行測序.將測序序列在NCBI數(shù)據(jù)庫Blast上進行序列比對分析，在MEGA 6.06軟件中采用Likelihood方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹.

2.2.2 產(chǎn)乳酸檢測 將XQ接種至50 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)48 h.發(fā)酵液中乳酸含量的測定參照付衛(wèi)明等人的反相高效液相色譜法[8].色譜條件：柱子為C-18反相柱子；流動相為pH2.5磷酸緩沖液；柱溫為室溫；流速為1 mL/min；波長為210 nm；進樣量為20 μL；L-乳酸為內(nèi)標.

2.2.3 胞外多糖的粗提取 將XQ接種至100 mL產(chǎn)胞外多糖液體培養(yǎng)基中，接種量為3%，37 ℃ 200 r/min發(fā)酵3 d.參照王輯[9]的方法對發(fā)酵液中的胞外多糖進行粗提取，并采用苯酚-硫酸法[10]測定粗胞外多糖的含量.

2.2.4 胞外多糖的純化 取粗胞外多糖溶液在純水中透析(透析袋MWCO為3 000～7 000)，上樣DEAE(GE XK16)中，離子水、0.1 mol/mL、0.3 mol/mL、0.5 mol/mL NaCl溶液分階段洗脫，每階段洗脫3個柱體積，流速為1 mL/min，分體積收集洗脫液(3 mL/管)，用苯酚-硫酸法檢測多糖洗脫液含量，以各管在490 nm的吸光光度測定對應管數(shù)作圖，繪制其洗脫曲線.合并各個洗脫峰的洗脫液，利用超濾管(MWCO3000)濃縮，在純水中透析.

2.2.5 體外抑菌實驗[11]將XQ接種至50 mL LB液體培養(yǎng)基中，接種量為2%，30 ℃ 200 r/min培養(yǎng)3 d.將發(fā)酵液上清液冷凍干燥后，稀釋20倍后過濾，得到濃縮的無菌發(fā)酵濾液，吸取50 μL浸潤空白濾紙片；粗胞外多糖吸取50 μL浸潤空白濾紙片.

將大腸桿菌、腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌活化12 h均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上；后將上述濾紙片放置于LB平板上.其中，無菌LB培養(yǎng)液的濾紙片為空白對照，氯霉素(30 μg)藥敏紙片為陽性對照.每個實驗重復3次，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，觀察濾紙片周圍的抑菌圈.

2.2.6 羥自由基清除活性 羥自由基清除活性的測定參照金鳴等人[12]的方法.

羥自由基清除活性=(A1-A0)/

(A-A0)×100%

式中，A0是對照試驗的吸光光度值(即以水代替樣品)；A1是樣品試驗的吸光光度值；A是以水替代反應體系中的H2O2和樣品的吸光度值.

2.2.7 DPPH自由基清除活性DPPH自由基清除活性的測定參照Shimada等人[13]的方法測定.

羥自由基清除活性=[1-(A1-A)]/

A0×100%

式中，A0是對照試驗的吸光光度值(即以水代替樣品);A1是樣品試驗的吸光光度值;A是以水替代反應體系中的DPPH溶液的吸光度值.

2.2.8 抗腫瘤活性測定 采用 Ramamoorthy等人[14]的方法測定胞外多糖的抗腫瘤活性.選擇A549和HepG2細胞作實驗對象，細胞在37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培育24 h后，在A549、HepG2中分別加入終濃度為4和6 mg/mL的胞外多糖，在空白對照中加入等體積的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后；采用CCK-8法[15]體外檢測細胞活性.

生長抑制率=(1-A1/A0)×100%

式中，A0是對照試驗的吸光光度值(即以培養(yǎng)基代替樣品)；A1是樣品試驗的吸光光度值.

2.2.9 耐受性實驗 采用Maragkoudakis等人[16]的方法進行人工模擬胃腸道耐受性和膽鹽耐受性實驗.

相對存活率=A1/A0×100%

式中，A0是未處理(0 h)的活菌數(shù)的對數(shù)值；A1是處理后的活菌數(shù)的對數(shù)值.

2.2.10 藥敏實驗 將XQ用棉簽均勻涂布于MH瓊脂表面，將涂布后的平板在室溫下干燥3～5 min，用無菌鑷子將藥敏紙片貼于MH瓊脂表面，使紙片與瓊脂完全接觸.每種藥敏紙片設(shè)置3個重復.將平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)16 h.實驗結(jié)果根據(jù)CLSL分析[17].

2.2.11 溶血實驗 將XQ均勻涂布到血瓊脂平板上，37 ℃孵育24 h，檢測溶血情況[18].

2.2.12 數(shù)據(jù)分析 使用EXCEL統(tǒng)計數(shù)據(jù)并利用Prism 6進行作圖.試驗數(shù)據(jù)SPSS進行數(shù)據(jù)處理，采用Ducan法進行單因素方差分析.

3 結(jié)果與分析

3.1 分子鑒定

將XQ的16S rDNA序列分別與NCBI中的GenBank中收錄的序列進行BLAST分析，利用MEGA 6軟件的Likelihood方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖1.XQ與短小芽孢桿菌Bacilluspumilusstrain BDH8(序列登錄號：KF933629.1)相似性為99.62%.

圖1 XQ 16 S rDNA聚類分析Fig.1 16 S rDNA cluster analysis of XQ

3.2 HPLC檢測乳酸含量

根據(jù)乳酸HPLC檢測標準曲線，乳酸的保留時間為10.6 min，以乳酸濃度為橫坐標(X軸)，峰面積為縱坐標(Y軸)，繪制標準曲線，得到方程為y=350 038.700 7x+1 056 828.801 1,R2=0.99,在0～35 g/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(見圖2).

圖3(a)，乳酸溶液出峰時間為10.632 min，圖3(b)發(fā)酵液中的乳酸出峰時間10.616 min，圖3(c) 6 mg/mL乳酸溶液與發(fā)酵液混合液中的出峰時間為10.119 min，在發(fā)酵液中添加乳酸發(fā)現(xiàn)其峰升高(相較于發(fā)酵液)，說明XQ產(chǎn)乳酸.檢測其發(fā)酵液中乳酸，計算得到其峰面積為3 859 147，帶入公式，其發(fā)酵液中乳酸含量為8 mg/mL.

圖2 乳酸標準曲線Fig.2 Standard curve of lactic acid

圖3 HPLC 檢測乳酸

3.3 胞外多糖含量測定

以葡萄糖濃度做橫坐標(X軸)，吸光度A490 nm做縱坐標(Y軸)繪制標準曲線，標準曲線為y=1.913x+0.013 6，R2=0.99，在0～1.4 mg/mL范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系(見圖4).利用苯酚-硫酸法測定發(fā)酵液中粗胞外多糖，將其稀釋40倍，重復3次測定平均吸光光度值為0.356，則帶入公式XQ產(chǎn)粗胞外多糖的濃度為7.16 mg/mL.

圖4 葡萄糖標準曲線Fig.4 Standard curve of glucose

流速為1 mL/min時，僅有去離子水、0.1 mol/L NaCl水溶液中有多糖存在.其洗脫峰為圖5，DEAE將粗胞外多糖分為E1和E2兩個峰.由于DEAE是通過多糖組分中帶有的電荷來篩分多糖，因酸性多糖比中性多糖所帶電荷多，所以采用NaCl濃度梯度梯度增大的方式進行洗脫進而分離酸性多糖[10].E1組分不與DEAE結(jié)合，推測為中性多糖；E2與DEAE結(jié)合，可通過NaCl洗脫，帶有電荷，推測為酸性多糖.

圖5 胞外多糖DEAE層析洗脫曲線

3.5 體外抑菌實驗

圖6可以看出，XQ發(fā)酵液僅對腸炎沙門氏菌有抑制效果，粗胞外多糖對腸炎沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌均有抑制效果，且對大腸桿菌抑制效果最強，對腸炎沙門氏菌抑制作用最弱.

圖6 抑菌實驗

3.6 胞外多糖的抗氧化活性

3.6.1 羥自由基清除活性 胞外多糖E1、E2的羥自由基清除活性結(jié)果見圖7(a).羥自由基清除活性隨著濃度升高而增加，且E2顯著高于E1；在濃度為10 mg/mL時，E1和E2其羥自由基清除率為3.24%和84.58%.

3.6.2 DPPH自由基清除活性 胞外多糖E1、E2的DPPH自由基的清除活性的結(jié)果見圖7(b).清除活性隨著濃度的增加而增加.在濃度為10 mg/mL時，E1和E2的DPPH自由基的清除率為26.07%和47.03%，具有中等的DPPH自由基清除活性.

圖7 胞外多糖的抗氧化性

3.7 抗腫瘤活性

在本試驗中，通過CCK-8的方法測定了胞外多糖對A549和HepG2細胞系的體外細胞毒性試驗.加入胞外多糖濃度為4 mg/mL時，E2對A549細胞的生長抑制率為81.30%，培養(yǎng)HepG2細胞時加入胞外多糖濃度為6 mg/mL，E2對HepG2細胞的生長抑制率為53.40%.胞外多糖E2對癌細胞系A(chǔ)549和HepG2細胞具有潛在的細胞毒性試驗.E1未顯示抑制腫瘤細胞生長的作用.

3.8 耐受性實驗

XQ具有良好的耐受性，在酸性、胃蛋白酶、胰蛋白酶和膽鹽特定條件下3 h相對存活率分別為82.51%、82.6%、89.15%和72.09%.

圖9 XQ耐受性實驗Fig.9 Tolerance experiment of XQ

3.9 藥敏實驗

根據(jù)抑菌圈直徑的大小判斷敏感性高低.由表1可知XQ作為格蘭氏陽性菌對常見的革蘭氏陽性菌抗生素(慶大霉素、四環(huán)素、萬古霉素、環(huán)丙沙星、紅霉素、氯霉素)均敏感；對革蘭氏陰性菌抗生素氨曲南不敏感.說明XQ幾乎沒有潛在的藥物抗性基因，在應用于生產(chǎn)中具有安全性.

表1 XQ藥敏實驗

3.10 溶血實驗

溶血性是其致病性的一個外在表現(xiàn)形式，是衡量毒力的重要指標.見圖10，XQ不溶血，對照組為粘質(zhì)沙雷氏菌溶血，說明XQ在溶血性方面具有安全性.

圖10 溶血實驗Fig.10 Hemolysis test

在食品相關(guān)領(lǐng)域，益生菌用于食品是全球趨勢，其主要應用于提供一些除傳統(tǒng)營養(yǎng)元素外的其它可促進健康的成分.但如何篩選和評估益生菌的價值是業(yè)內(nèi)學者一直在探索的問題[19].而益生菌在體內(nèi)共生環(huán)境下，通過分泌相關(guān)的代謝產(chǎn)物改變?nèi)梭w局部的條件而產(chǎn)生利好有初步的研究和認識，如有機酸或多糖等物質(zhì).

由于大多數(shù)病原體不能在低pH值下生長[20].有機酸的分泌，如乳酸，可降低胃腸道的pH使其成為不利于病原體生長的環(huán)境，同時有機酸對病原菌的代謝和毒素的產(chǎn)生也有影響，進而起到預防疾病的作用[21].

胞外多糖具有多種生理功能，但天然胞外多糖的產(chǎn)量并不高.與動植物胞外多糖相比微生物胞外多糖具有很多優(yōu)點，其生產(chǎn)周期短，不受季節(jié)、地理和環(huán)境因素的影響，且原料豐富，成本相對較低，可在人工控制的條件下進行大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)，對環(huán)境無污染，其產(chǎn)量也相對較高，因此微生物胞外多糖具有很強的市場競爭力和廣闊的前景發(fā)展[22].

現(xiàn)有研究中大部分乳酸菌胞外多糖的產(chǎn)量偏低(低于1g/L)[23-24]，Lactobacillussp. Ca6產(chǎn)胞外多糖最大產(chǎn)量為2.4 mg/mL[25]，而我們篩選的這株乳酸芽孢桿菌XQ胞外多糖產(chǎn)量為7.16 mg/mL，可節(jié)省高昂純化成本，因此XQ是具有開發(fā)優(yōu)勢的.有報道稱來自不同微生物的胞外多糖混合物具有更好的DPPH清除能力[26-27]，這一點可為今后配制更好的DPPH清除能力胞外多糖混合物提供組分來源.

胞外多糖的抗腫瘤活性也備受關(guān)注.在本研究中，E2對癌細胞系A(chǔ)549和HepG2細胞具有細胞毒性.濃度為4 mg/mL時，對A549細胞的生長抑制率為81.30%，濃度為6 mg/mL，對HepG2細胞的生長抑制率為53.40%.

E1未表現(xiàn)出腫瘤抑制作用，但作為中性多糖依然具有重要價值.Speciale等人[28]發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌雙歧桿菌PRI1可產(chǎn)生四種不同化學結(jié)構(gòu)的中性多糖混合物，同時發(fā)現(xiàn)不同化學結(jié)構(gòu)的中性多糖在調(diào)節(jié)宿主與細菌相互作用中具有不同的作用，推測中性多糖混合物可根據(jù)結(jié)構(gòu)差異調(diào)節(jié)宿主免疫力，從而增強免疫力或誘導免疫耐受.中性多糖可以促進某些乳酸菌的生長.Zeng等人[29]從CistanchedeserticolaYC Ma獲得了中性多糖CDA-0.05，可以顯著促進三種擬桿菌(B.thetaiotaomicron，B.ovatus和B.fragilis)的生長；此外，CDA-0.05還可以促進某些益生菌的生長，例如干酪乳桿菌，植物乳桿菌和路透乳桿菌.中性多糖可能還具有抗病毒的作用.Li等人[30]從DendrobiumnobileLindl分離出的中性多糖DNPE6(4)，具有抗TMV和抗CMV活性.

綜上，從四川懷遠發(fā)酵米糕作坊環(huán)境中分離出的短小芽孢桿菌(XQ)，高產(chǎn)胞外多糖及乳酸.對常見食源性病原菌沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌具有抑制作用；產(chǎn)生的胞外多糖具備羥自由基清除活性和DPPH自由基的清除活性，并能抑制腫瘤生長.在模擬胃腸道耐受性實驗中對胰蛋白酶、胃蛋白酶和膽鹽均具有良好耐受性.對常用抗生素無耐藥性，溶血試驗陰性，具有生物安全性.表明XQ可作為一種潛在的益生菌.