非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤微環(huán)境中TAMs及PD-1表達(dá)水平及與臨床預(yù)后的關(guān)系

張佳秀 鄧林鋒 石建邦 吳健衛(wèi)▲

1.江西省九江市第一人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江西九江 332000；2.江西省九江市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西九江 332000

目前，肺癌嚴(yán)重威脅我國(guó)國(guó)民健康，仍是我國(guó)現(xiàn)階段發(fā)病率和致死率最高的惡性腫瘤[1]。肺癌分小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）兩種，其中NSCLC約占肺癌的85%，預(yù)后差，5年生存率不足15%[2]。隨著研究的深入，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移與腫瘤微環(huán)境中非腫瘤細(xì)胞成分密切相關(guān)[3]。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophage，TAMs）占腫瘤微環(huán)境中炎癥細(xì)胞總數(shù)的30%～50%，巨噬細(xì)胞在不同的微環(huán)境中表現(xiàn)出不同的活化狀態(tài)（M1 與 M2）[4]。程序性死亡受體 1（programmed death receptor-1，PD-1）能有效抑制T、B細(xì)胞的功能和增殖，參與腫瘤微環(huán)境形成[5]。本研究以NSCLC患者為研究對(duì)象，檢測(cè)患者肺癌組織、癌旁組織標(biāo)本中M1型、M2型TAMs及PD-1的表達(dá)水平，旨在觀察不同臨床預(yù)后因素及1年生存狀態(tài)下TAMs表型和PD-1表達(dá)水平分布特征。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月至12月于九江市第一人民醫(yī)院胸外科初次確診且擇期手術(shù)的76例NSCLC患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者病理性組織為NSCLC；②依據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）第八版肺癌分期標(biāo)準(zhǔn)[6]術(shù)后病理分期為Ⅰ～Ⅲa期；③擇期行根治手術(shù)；④術(shù)前未行放療或者化療治療；⑤首發(fā)病例，臨床病理資料較為齊全；⑥癌旁正常組織采自同一位患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者合并自身免疫性疾病或者感染性疾病；②患者病例資料不完整者；③患者合并其他任何系統(tǒng)腫瘤；④凝血功能異常者；⑤嚴(yán)重慢性病史者；⑥失訪者。本研究經(jīng)九江市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，研究對(duì)象均了解研究方案并簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 記錄患者的一般情況 包括年齡、性別、腫瘤分期、腫瘤類(lèi)型、分化程度，所有患者完善相關(guān)檢查后進(jìn)行擇期手術(shù)，術(shù)中采集腫瘤組織和癌旁正常組織，送快速病理與免疫組化檢測(cè)，對(duì)所有患者進(jìn)行為期1年的隨訪，記錄患者1年內(nèi)生存率。

1.2.2 組織樣本處理 腫瘤組織離體后半小時(shí)內(nèi)于腫瘤組織縱切面的非壞死區(qū)域采集標(biāo)本，充分采集體積大小為0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的癌組織，于腫瘤組織的邊緣5 cm處采集以上正常的肺部黏膜相應(yīng)癌旁組織樣本，離體后均經(jīng)過(guò)DEPC水進(jìn)行清洗，送快速病理與免疫組化檢測(cè)。

1.2.3 PD-1、CD86、CD206熒光染色 ①固定：室溫下4%的多聚甲醛固定細(xì)胞，充分孵育10 min，PBS清洗3次，每次15 min。②抗原修復(fù)：將玻片置于提前加熱好的抗原修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)，溫度保持95℃，繼續(xù)加熱10 min，過(guò)程中防止煮沸，完成后PBS溶液清洗3次，每次5 min。③通透：PBS溶液孵育10 min，采用Triton X-100進(jìn)行透膜處理，室溫下20 min，完成后PBS溶液清洗3次，每次5 min。④封閉與免疫染色：含有1%的BSA的甘氨酸進(jìn)行封閉，37℃ 30 min，完畢后進(jìn)行抗體染色，一抗 PD-1（1∶200）和一抗 CD8（1∶200）、一抗 CD86（1∶1500）以及一抗 CD206 抗體（1∶100）按比例稀釋后室溫下濕盒中孵育1 h，完畢后PBS溶液洗滌3次，每次5 min。常溫下，二抗GAR AF488抗體（綠色熒光，1∶200）按比例采用1%的BSA稀釋，避光條件下室溫孵育1 h。完成后PBS溶液洗滌3次，每次5 min。⑤復(fù)染：采用0.1 μg/ml的DAPI染色液染核15 min，完畢后PBS溶液清洗3次，每次5 min。⑥封片：采用抗熒光淬滅劑進(jìn)行封片，完成后4℃保存待檢。⑦熒光顯色與分析：采用OLYMPUS VS-ASW 2.9系統(tǒng)20倍物鏡下進(jìn)行拍照，Image-pro Plus 6.0軟件進(jìn)行定量分析，根據(jù)HIS選色方案判定面積，篩除小于50像素的非特異性雜點(diǎn)，對(duì)PD-1、CD86、CD206標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行記錄。

1.3 觀察指標(biāo)

①觀察被納入NSCLC患者腫瘤組織與癌旁組織PD-1、CD86、CD206熒光染色陽(yáng)性表達(dá)；②NSCLC患者腫瘤組織與癌旁組織PD-1、CD86、CD206表達(dá)的相關(guān)性；③不同臨床預(yù)后因素下TAMs表型和PD-1表達(dá)水平分布特征；④NSCLC患者1年生存率的影響因素。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析；采用COX回歸分析NSCLC患者1年生存率的影響因素，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PD-1、CD86、CD206在NSCLC腫瘤組織中的表達(dá)

NSCLC患者癌組織PD-1、CD206陽(yáng)性表達(dá)高于癌旁組織，CD86陽(yáng)性表達(dá)低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表 1，圖 1，封三）。

表1 NSCLC患者癌旁組織和癌組織PD-1、CD86、CD206免疫熒光染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的比較

圖1 NSCLC患者癌旁組織和癌組織PD-1、CD86、CD206免疫熒光染色圖（200×）（見(jiàn)內(nèi)文第6頁(yè)）

2.2 NSCLC患者腫瘤組織與癌旁組織PD-1、CD86、CD206表達(dá)的相關(guān)性分析

NSCLC患者癌旁組織 PD-1、CD86、CD206陽(yáng)性表達(dá)兩兩間均無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）。癌組織PD-1和CD206陽(yáng)性表達(dá)成正相關(guān)（P＜0.05），癌組織PD-1和CD86、CD86 和 CD206 無(wú)明顯相關(guān)性（P＞0.05）（表 2～3）。

表2 NSCLC患者癌旁組織PD-1、CD86、CD206表達(dá)的相關(guān)性分析（r值/P值）

表3 NSCLC患者腫瘤組織PD-1、CD86、CD206表達(dá)的相關(guān)性分析（r值/P值）

2.3 NSCLC患者不同臨床預(yù)后因素下PD-1、CD86、CD206表達(dá)分布

不同性別和年齡 NSCLC患者的 PD-1、CD86、CD206表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。腺癌PD-1陽(yáng)性表達(dá)水平高于鱗癌，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。高分化CD86表達(dá)水平高于低分化和中分化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；高分化和中分化CD206表達(dá)水平低于低分化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。臨床Ⅲ期和Ⅱ期PD-1陽(yáng)性表達(dá)水平高于Ⅰ期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；臨床Ⅲ期和Ⅱ期CD86陽(yáng)性表達(dá)水平低于Ⅰ期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。浸潤(rùn)性生長(zhǎng)患者的CD206表達(dá)水平高于非浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表 4）。

表4 NSCLC患者不同臨床預(yù)后因素下PD-1、CD86、CD206表達(dá)分布（±s）

表4 NSCLC患者不同臨床預(yù)后因素下PD-1、CD86、CD206表達(dá)分布（±s）

與低分化比較，aP＜0.05；與 1 期比較，bP＜0.05

因素 例數(shù) PD-1平均值 t/F值 P值images/BZ_13_1145_372_1166_414.pngCD86平均值 t/F值 P值images/BZ_13_1716_372_1737_414.pngCD206平均值 t/F值 P值性別0.6940.4901.6490.1030.1170.907男女43 33 155.67±33.73 161.58±40.37 106.49±28.88 93.79±38.30 139.88±31.17 140.61±19.51年齡≤50歲＞50歲病理類(lèi)型鱗癌腺癌分化程度高分化中分化低分化臨床分期Ⅰ期Ⅱ期Ⅲ期浸潤(rùn)性生長(zhǎng)12 63 42 34 27 22 27 18 39 19 161.50±32.59 157.63±37.53 145.55±36.32 173.91±30.84 149.96±30.65 167.18±32.61 159.22±43.94 163.56±26.75 144.18±33.33b 182.05±38.89b 0.334 3.618 1.369 8.497 1.390 0.739 0.001 0.261 0.000 0.169 111.67±29.56 98.97±34.21 101.43±34.81 100.41±32.70 132.41±14.67a 80.82±35.41 85.96±20.90 128.83±14.03 89.49±33.17b 98.16±33.80b 1.203 0.130 35.161 10.701 0.417 0.233 0.897 0.000 0.000 0.678 138.33±41.28 140.55±23.30 138.24±30.81 142.62±20.39 134.15±32.97a 124.18±12.61a 159.30±13.76 129.33±38.42 142.61±22.91 145.53±16.80 0.263 0.712 16.467 2.106 9.125 0.793 0.479 0.000 0.129 0.000是否26 50 150.19±40.88 162.42±33.88 98.73±28.12 102.14±36.43 166.85±15.82 126.34±19.52

2.4 NSCLC患者1年生存率的影響因素

所有患者生存隨訪截止時(shí)間為2021年3月，76例NSCLC患者死亡18例，存活58例，1年生存率為76.32%。將納入因子進(jìn)行變量賦值，性別（男=1，女=0）、腫瘤類(lèi)型（鱗癌=0，腺癌=1）、分化程度（高分化=1，中分化=2，低分化=3）、臨床分期（Ⅰ期=1，Ⅱ期=2，Ⅲ期=3）、浸潤(rùn)性生長(zhǎng)（否=0，是=1），年齡、PD-1、CD86、CD206表達(dá)水平均為連續(xù)變量，結(jié)果顯示，PD1和CD206是NSCLC 患者 1年生存率的危險(xiǎn)因素（P＜0.05）（表 5）。

表5 NSCLC患者1年生存率的COX回歸分析

3 討論

NSCLC是臨床常見(jiàn)的惡性腫瘤，患者發(fā)病后病情進(jìn)展早期多隱匿，速度快，多數(shù)病患在確診時(shí)已經(jīng)步入中晚期階段，預(yù)后較差，患者的五年生存率低于15%[2]，國(guó)內(nèi)學(xué)者相關(guān)研究[7]報(bào)道，NSCLC患者1年生存率為50%～80%，本研究納入的76例NSCLC患者1年生存率為76.32%，與上述研究報(bào)道基本一致，可見(jiàn)NSCLC患者1年生存率不容樂(lè)觀。因此NSCLC的臨床治療仍存在諸多難點(diǎn)，患者預(yù)后狀態(tài)的提升仍面臨巨大挑戰(zhàn)，為有效提升患者的治療效果，使其生存時(shí)間及生活質(zhì)量得到提高，有必要探索更加高效的治療模式，對(duì)NSCLC患者的臨床預(yù)后具有十分重要的臨床意義。

現(xiàn)已證實(shí)，PD-1在正常健康機(jī)體組織中，僅在巨噬細(xì)胞中活化表達(dá)，但在多種類(lèi)型癌變組織中能夠檢測(cè)到PD-1蛋白的活化表達(dá)，如乳腺癌[8]、黑色素瘤[9]、腎癌[10]等，這一特征提示其在正常機(jī)體組織中的表達(dá)可能受到非常嚴(yán)格的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，但在惡性腫瘤組織中的調(diào)控機(jī)制出現(xiàn)異常，從而引起PD-1的異常過(guò)表達(dá)現(xiàn)象，并對(duì)腫瘤疾病本身發(fā)生及進(jìn)展發(fā)揮著助推作用[11-12]。本研究結(jié)果顯示，PD-1在NSCLC患者腫瘤組織中表達(dá)明顯高于癌旁組織，且腺癌患者PD-1陽(yáng)性表達(dá)水平高于鱗癌，臨床Ⅲ期和Ⅱ期患者PD-1陽(yáng)性表達(dá)水平高于Ⅰ期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），一方面提示PD-1在NSCLC腫瘤組織中存在異常高表達(dá)狀態(tài)，另一方面證實(shí)PD-1在肺腺癌腫瘤組織中高表達(dá)，且具有促癌特性。CD86和CD206分別是M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞表面的特異性抗體，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中扮演不同的角色，M1型巨噬細(xì)胞屬激活型，M2型巨噬細(xì)胞在腫瘤發(fā)展過(guò)程中能夠有效激活M1型巨噬細(xì)胞，破壞腫瘤微環(huán)境[13-14]；此外，腫瘤發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程中巨噬細(xì)胞功能異常紊亂，M2型巨噬細(xì)胞多表現(xiàn)為異常極化現(xiàn)象，促進(jìn)腫瘤組織的重塑，推動(dòng)相關(guān)腫瘤組織細(xì)胞的發(fā)展過(guò)程[15]。本研究結(jié)果顯示，NSCLC患者癌組織CD86陽(yáng)性表達(dá)低于癌旁組織，且高分化患者CD86表達(dá)水平高于低分化和中分化，臨床Ⅲ期和Ⅱ期CD86陽(yáng)性表達(dá)水平低于Ⅰ期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示M1型巨噬細(xì)胞在腫瘤的發(fā)展過(guò)程中的抑制狀態(tài)，有望成為腫瘤代謝調(diào)節(jié)和免疫治療的新靶點(diǎn)[16]，但本研究COX回歸分析中CD86與患者1年生存率未表現(xiàn)出明顯相關(guān)性。本研究結(jié)果還顯示，NSCLC患者癌組織CD206陽(yáng)性表達(dá)高于癌旁組織，高分化和中分化CD206表達(dá)水平低于低分化，浸潤(rùn)性生長(zhǎng)患者CD206表達(dá)水平高于非浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），進(jìn)一步證實(shí)M2型巨噬細(xì)胞的促癌作用，且M2型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)性明顯高于M1型巨噬細(xì)胞，與巨噬細(xì)胞在多種腫瘤因子和炎癥因子作用下向M2型巨噬細(xì)胞極化有關(guān)[17]。

有學(xué)者在研究中指出，予以機(jī)體PD-1抗體阻斷可提升巨噬細(xì)胞吞噬率[18]。PD-1和B7H1基因缺陷小鼠的基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，小鼠細(xì)菌的負(fù)荷能力明顯降低，同時(shí)巨噬細(xì)胞的吞噬能力明顯升高，免疫耐受性上升，生存期明顯改善[19]。B7H1基因與巨噬細(xì)胞表面抗原遞呈相關(guān)分子表達(dá)有關(guān)，可能參與巨噬細(xì)胞的極化[20]，上述研究提示PD-1與巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)以及炎癥反應(yīng)可能同樣存在一定的關(guān)系。本研究對(duì)NSCLC患者腫瘤組織PD-1、CD86和CD206陽(yáng)性表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，NSCLC患者腫瘤組織PD-1表達(dá)與CD206陽(yáng)性表達(dá)成正相關(guān)（P＜0.05），由于M2型巨噬細(xì)胞具有促癌作用，故有理由推測(cè)PD-1可能參與M2型巨噬細(xì)胞的異常極化，共同促進(jìn)癌癥的進(jìn)展，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。此外，COX回歸分析顯示，PD-1與CD206高陽(yáng)性表達(dá)均是NSCLC患者1年內(nèi)死亡率的危險(xiǎn)因素，二者有望成為NSCLC患者治療新靶點(diǎn)。

綜上所述，NSCLC癌組織及癌旁組織中PD-1、CD86和CD206的表達(dá)存在明顯差異，PD-1高表達(dá)、M2型巨噬細(xì)胞的高浸潤(rùn)特性可明顯增加患者1年內(nèi)死亡率。