hTERT 基因多態(tài)性與結(jié)腸癌遺傳易感性研究

袁志麗，徐保華，杜文貞，楊楠，張曉，司君圣

（山東省煙臺市開發(fā)區(qū)業(yè)達醫(yī)院 消化內(nèi)科，山東 煙臺 264000）

0 引言

人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）基因定位于5p15.33，為單拷貝基因，全長約41Kb，hTERT 是端粒酶中起催化作用的亞單位，通常被作為調(diào)控端粒酶活性的限速步驟而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[1]。多項研究證實，hTERT 基因的多個SNP 位點與多種腫瘤發(fā)生有關(guān)，如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、食管癌等[2-9]。目前有關(guān)hTERT 單核苷酸多態(tài)性在結(jié)腸癌發(fā)病過程中的作用尚鮮有相關(guān)報道。本研究擬采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）分析方法對結(jié)腸癌、結(jié)腸腺瘤、健康體檢者hTERT 基因rs2853676 和rs2853677 位點單核苷酸多態(tài)性的分布進行調(diào)查，結(jié)合分析其與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)關(guān)系，探索與結(jié)腸癌易感性關(guān)系及增值侵襲發(fā)病過程中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017年1月-2018年12月在煙臺業(yè)達醫(yī)院內(nèi)鏡活檢或術(shù)后組織病理確診為結(jié)腸癌186例、結(jié)腸腺瘤194例為病例組，以煙臺地區(qū)無腫瘤病史、健康體檢行結(jié)腸鏡檢查未見明顯異常健康者406例為對照組，按性別和年齡（±5 歲）與病例組匹配。收集研究對象外周血標本2mL，并進行面訪調(diào)查，包括詳細的人口學資料、吸煙、飲酒及腫瘤病史等內(nèi)容。

納入標準：所有患者均知情且同意；所有研究對象均為漢族。病例組排除合并其他系統(tǒng)或器官惡性腫瘤者，綜合結(jié)腸癌患者組織病理、腹部CT 或磁共振結(jié)果進行臨床分期，結(jié)腸腺瘤組排除增生性、炎性及錯構(gòu)瘤性息肉者。該研究獲得煙臺業(yè)達醫(yī)院倫理委員會批準，患者簽署知情同意書。

1.2 DNA 提取

選用廣東東勝生物科技有限公司提供的外周血DNA 提取試劑盒提取白細胞DNA，紫外分光光度計檢測DNA 含量及質(zhì)量，OD260/OD280 均位于1.6～1.8，含量80～120ng/μL 視為合格，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 基因型分析

采用PCR-RFLP 進行基因多態(tài)性檢測。

使用primer premier 5.0 引物設(shè)計軟件，按照引物設(shè)計基本原則設(shè)計各位點引物，并于基因全序列內(nèi)核對，避開變異位點，提高擴增片段特異性，引物由上海生工生物有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系均采用15μL 反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min，然后進行35 個循環(huán)：94℃變性30s，分別以59.5℃、64.0℃退火30s，72℃延伸45s，終末以72℃延伸10min，擴增的DNA 片段長度分別為501bp、404bp，凝膠電泳及隨機抽取部分擴增產(chǎn)物基因測序?qū)CR 擴增產(chǎn)物鑒定質(zhì)控。對rs2853676、rs2853677 位點PCR 擴增產(chǎn)物分別采用限制性內(nèi)切酶NaeI、FauI 進行酶切，凝膠電泳觀察DNA 條帶分析基因型。隨機抽取10%樣本雙向測序驗證，測序結(jié)果與酶切結(jié)果均一致。

1.4 觀察指標

病例組和對照組一般信息比較。hTERT 基因SNP 位點基因型分布及其與結(jié)腸癌易感性關(guān)系。rs2853677 位點基因多態(tài)性與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學軟件，采用χ2檢驗進行Hardy-Weinberg 平衡檢驗。以t檢驗和χ2檢驗比較人口學特征和位點基因型在病例組與對照組之間頻率分布差異，以O(shè)R（odds radio）值及95%置信區(qū)間（CI）表示相對危險度，以P＜0.05（雙側(cè)）為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

病例組和對照組的年齡和性別構(gòu)成差異無統(tǒng)計學意義，說明病例對照匹配合適，吸煙及飲酒無明顯統(tǒng)計學差異。

表1 病例組與對照組一般情況

2.2 遺傳平衡檢驗

經(jīng)χ2檢驗，所選各組樣本均符合Hardy-Weinberg 平衡，具有群代表性。

2.3 hTERT 各SNP 位點基因型分布

（1）rs2853676 位點各基因型在對照組、結(jié)腸腺瘤組及結(jié)腸癌組中分布差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。rs2853677 位點結(jié)腸癌組CC 基因型分布頻率（17.74%）明顯高于對照組（8.62%），差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）,較結(jié)腸腺瘤組（10.30%）差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。攜帶CC 基因型者罹患結(jié)腸癌風險增加2.193倍（95%CI：1.287-3.373），（如表2 所示）。各位點PCR-RFLP 酶切電泳圖如圖1、圖2 所示。rs2853677 位點結(jié)腸腺瘤組+結(jié)腸癌組TT、TC、CC 基因型分布頻率分別為52.37%、33.68%、13.95%，與對照組相比CC 基因型分布差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.028），OR=1.682（95%CI：1.053-2.685）。

圖1 hTERT rs2853676 位點PCR-RFLP 酶切電泳圖

圖2 hTERT rs2853677 位點PCR-RFLP 酶切電泳圖

表2 hTERT 基因SNP 位點基因型分布及其與結(jié)腸癌易感性關(guān)系

（2）rs2853677 位點基因多態(tài)性與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系。rs2853677 位點CC 基因型可顯著增加結(jié)腸癌患病風險，我們進一步對該位點基因多態(tài)性與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)進行分析，結(jié)果顯示該位點各基因型分布頻率與結(jié)腸癌患者的性別、年齡、腫瘤分化程度差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表3。

表3 rs2853677 位點基因多態(tài)性與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討論

結(jié)腸癌的病因尚未完全清楚，目前認為主要是環(huán)境與遺傳因素綜合作用的結(jié)果。近年研究發(fā)現(xiàn)hTERT在正常細胞中不表達，而在包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的約90%的腫瘤細胞中表達水平明顯增高[10]，亓玉琴等[11]研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織及外周血hTERT mRNA 表達明顯升高，并與結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移有關(guān)。多項全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）表明，hTERT 有多個單核苷酸多態(tài)性位點與多種腫瘤易感性有關(guān)，包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、食管癌等多種惡性腫瘤，與結(jié)直腸癌遺傳易感性尚鮮有報道。

rs2853676位點定位于hTERT 第2內(nèi)含子，Shete 等[12]進行的GWAS 表明，該位點與膠質(zhì)瘤風險有關(guān)。2016年，He 等[2]對西安地區(qū)膠質(zhì)瘤患者研究發(fā)現(xiàn)“A/G”基因型降低了進展生存率，與基因型G/G 相比，“A/A+A/G”降低了復(fù)發(fā)率，表明該位點多態(tài)性與中國人群中膠質(zhì)瘤的生存和復(fù)發(fā)率相關(guān)，提示其可能作為膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后標志物。與肺癌易感性關(guān)系研究中，該位點表現(xiàn)出組織學異質(zhì)性，與肺腺癌顯著相關(guān)，而與鱗狀細胞癌和小細胞癌均無相關(guān)性[13]。然而，rs2853676 多態(tài)性與癌癥之間的確切功能機制仍不清楚，研究表明端粒長度會改變癌癥風險，可能還存在該位點與附近其他生物潛在功能多態(tài)性或致病突變的高連鎖不平衡，此外還可能受環(huán)境風險因素或遺傳背景影響[14]，有待進一步研究。

rs2853677 位于hTERT 基因轉(zhuǎn)錄起始位點的第2 個內(nèi)含子+7969 堿基對上。rs2853677 T 等位基因在不同的癌癥類型間表現(xiàn)出多效性。GWAS已確定rs2853677 為日本和非洲裔美國人肺癌易感位點[15-16]。同一等位基因與睪丸生殖細胞腫瘤和胰腺癌呈正相關(guān)，與膠質(zhì)瘤和肺癌呈負相關(guān)[17]。Daniele 等[18]研究發(fā)現(xiàn)T 等位基因可導(dǎo)致端粒變長增加胰腺癌患病風險。Li 等[5]研究表明rs2853677的T 等位基因是中國漢族人群對NSCLC 易感性的保護因子。此外，在另一項研究中該位點被確定與骨髓增生性腫瘤有關(guān)[19]。2016年一項對肺腺癌的體外功能研究發(fā)現(xiàn)，rs2853677 位于hTERT 的增強子功能區(qū)域，發(fā)現(xiàn)Snail1 可與增強子結(jié)合并重組hTERT 基因內(nèi)的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)從而抑制hTERT 轉(zhuǎn)錄，rs2853677 高危型C 等位基因破壞了Snail1 的結(jié)合位點，從而消除了Snail1 對hTERT 轉(zhuǎn)錄的抑制作用，表明rs2853677 通過改變轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合親和力影響hTERT 的轉(zhuǎn)錄[3,20]。本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌組CC 基因型分布頻率較對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義，結(jié)腸癌患病風險增加2.193 倍；結(jié)腸腺瘤被看作是結(jié)腸癌的癌前病變，與結(jié)腸腺瘤組相比CC基因型分布頻率差異無統(tǒng)計學意義，我們將二組合并后與對照組相比，發(fā)現(xiàn)TC 基因型分布頻率差異無統(tǒng)計學意義，CC 基因型分布頻率差異仍有統(tǒng)計學意義（P=0.028），風險增加1.68倍（95%：1.053-2.685），我們推測CC 基因型結(jié)腸腺瘤患者更易進展為結(jié)腸癌，這需要進一步的前瞻性研究證實。另外，值得注意的是2017年Li 等[21]對中國西北地區(qū)結(jié)直腸癌患者研究發(fā)現(xiàn)rs2853676、rs2853677 與結(jié)直腸癌易感性無關(guān)，rs2853677 位點結(jié)果與本研究不一致，這種差異可能受研究人群不同、遺傳背景差異或樣本量不足有關(guān)等因素影響，將來需要進一步研究明確。

綜上所述，hTERT 基因rs2853676 位點單核苷酸多態(tài)性未明顯增加結(jié)腸癌患病風險，rs2853677 位點CC 基因型個體罹患結(jié)腸癌的風險性增高，該位點的CC 基因型可能與結(jié)腸癌遺傳易感性有關(guān)。CC 基因型結(jié)腸腺瘤患者是否更易進展為結(jié)腸癌有待進一步前瞻性研究證實。