清胰煎劑與顆粒中4種成分在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)比較*

歐水平，鄭小翠，王森，3，陳靈，王玉和 ，任麗

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科，遵義 563000；2.遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遵義 563003；3.畢節(jié)市第一人民醫(yī)院藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室，畢節(jié) 551700)

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是臨床常見(jiàn)的急腹癥，發(fā)病急，進(jìn)展快，死亡率高，極易發(fā)展為重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)。SAP病情兇險(xiǎn)，常伴有局部或全身炎癥反應(yīng)綜合征及全身多器官功能障礙[1-2]。AP的病因和發(fā)病機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜、多因素參與的病理過(guò)程，胰酶激活和胰腺自身消化、胰腺微循環(huán)障礙等均會(huì)引起AP[3-4]。目前AP治療主要包括中醫(yī)、西醫(yī)及中西醫(yī)結(jié)合治療[5]。西醫(yī)治療主要包括手術(shù)、鎮(zhèn)痛、液體復(fù)蘇等。中藥治療AP主要有中藥單體、單味中藥和復(fù)方。用于治療AP的中藥方劑主要有大承氣湯、茵陳湯、清胰湯等[6]。清胰煎劑來(lái)源于遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院臨床經(jīng)驗(yàn)方，現(xiàn)已記載于《古今名方》，由大黃、赤芍、炒梔子、木香、姜厚樸、醋延胡索、丹皮及芒硝等8味藥組成，組方嚴(yán)謹(jǐn)，遵循中醫(yī)治療急腹癥以“通”為用的原則，諸藥合用共奏疏肝理氣、清熱解毒、鎮(zhèn)痛、通里攻下之功效。我院臨床應(yīng)用已有五十多年的歷史，療效確切，能顯著提高 AP 及 SAP 的治愈率[7]。目前，清胰制劑是以煎劑應(yīng)用于臨床，雖然煎劑與中醫(yī)辨證診治、隨癥加減的原則一致，但體積大，易腐壞，攜帶、儲(chǔ)存不便，制備麻煩且難以控制質(zhì)量等，不適宜工業(yè)化批量生產(chǎn)。顆粒劑既克服了煎劑易霉變、質(zhì)量難控等缺點(diǎn)，也保持了煎劑吸收和作用迅速的優(yōu)點(diǎn)。筆者前期也對(duì)清胰制劑的研究概況進(jìn)行了總結(jié)[7]。在前期研究的基礎(chǔ)上，筆者采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS/MS)方法研究清胰煎劑與顆粒中蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸、大黃酚在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征，為清胰顆粒的研制和臨床應(yīng)用提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠10只，體質(zhì)量250～280 g，購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)SCXK(湘)2014-0011。飼養(yǎng)環(huán)境溫度(25±1) ℃，相對(duì)濕度( 55±2)%，每天光/暗交替 12 h/12 h。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)遵義醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)：倫審[2017]2-083號(hào)。

1.2試藥 蘆薈大黃素、大黃酚(成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)分別為MUST-17030605，MUST-17030603，含量均>98%)，大黃素、大黃酸(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為110756-201512，110757-201607，含量>98%)，1，8-二羥基蒽醌(成都埃法生物科技有限公司，批號(hào)：AF8022701)，甲醇(色譜純，瑞典Oceanpak公司，批號(hào)：17110609G104)，清胰煎劑、清胰顆粒(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科自制，批號(hào)分別為：201807101，2018071101)，其余試劑均為分析純。

1.3儀器 4000Q TRAP LC/MS/MS液質(zhì)聯(lián)用儀(美國(guó)AB SCIEX公司)，Sartorius BT125D分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司，感量：0.01 mg)，TGL16M型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙邁佳森儀器設(shè)備有限公司)，TGL-16C高速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，IKA Vortex 1渦旋儀(德國(guó)IKA 公司)，DURA12型超純水機(jī)[澤拉布儀器科技(上海)有限公司]。

2 方法與結(jié)果

2.1清胰煎劑及清胰顆粒的制備及質(zhì)量控制 遵循清胰煎劑臨床水煎煮制備工藝，確定按文獻(xiàn)[8-9]方法制備清胰煎劑濃度相當(dāng)于生藥量2 g· mL-1。取處方量藥材，加入10倍量65 ℃水浸泡30 min(芒硝除外)，煎煮3次，每次20 min，過(guò)濾，合并3次濾液，取適量溶解芒硝，其余55 ℃減壓濃縮成稠浸膏，70 ℃減壓干燥得干浸膏，粉碎過(guò)篩孔內(nèi)徑0.18 mm(5號(hào))篩，即得浸膏粉。按比例稱(chēng)取浸膏粉與輔料混勻，加入一定量濃度的乙醇，制得軟材，擠壓過(guò)篩制粒，干燥0.5 h，過(guò)篩孔內(nèi)徑2.00 mm(1號(hào))與篩孔內(nèi)徑0.25 mm(4號(hào))篩整粒即得清胰顆粒。稱(chēng)取清胰顆粒適量，加熱水?dāng)嚢枞芙?，使其濃度?.91 g· mL-1(相當(dāng)于生藥量2 g· mL-1)，即得清胰顆粒溶液，使用時(shí)再次攪拌均勻。課題組前期對(duì)清胰煎劑及清胰顆粒的制備工藝進(jìn)行了篩選及優(yōu)化，建立了質(zhì)量控制方法[9]及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并考察了制劑的穩(wěn)定性。研究結(jié)果表明，制備工藝合理穩(wěn)定可行，建立的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及質(zhì)量控制方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，穩(wěn)定性良好。

2.2對(duì)照品溶液的配制 分別精密稱(chēng)取蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸、大黃酚、1，8-二羥基蒽醌(內(nèi)標(biāo))對(duì)照品適量，加少量三氯甲烷溶解后，加入甲醇制成濃度依次為0.435，0.202，0.50，0.50，0.40 mg· mL-1的對(duì)照品溶液。分別精密吸取上述蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸、大黃酚單個(gè)對(duì)照品溶液300，170，1600，480 μL于10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度得濃度分別為3.48，3.45，80.00，24.00 μg· mL-1的混合對(duì)照品溶液。加甲醇等比稀釋成梯度濃度混合對(duì)照品溶液。另將內(nèi)標(biāo)稀釋為1 μg· mL-1溶液備用。

2.3測(cè)定方法建立

2.3.1色譜/質(zhì)譜條件 采用UItimate LP-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫：25 ℃，流速：0.8 mL·min-1，0.1%甲酸溶液-甲醇(15：85)等度洗脫，進(jìn)樣量5 μL。采用ESI負(fù)離子檢測(cè)，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multi-reaction monitoring，MRM)模式測(cè)定。主要參數(shù)為離子化溫度550 ℃；噴霧電壓4500 V，氣簾氣壓力276 kPa；霧化氣壓力448 kPa；輔助加熱器壓力448 kPa；碰撞氣Medium，各成分與內(nèi)標(biāo)m/z、碎片能量及撞擊能量見(jiàn)表1。

表1 4種成分及內(nèi)標(biāo) MRM檢測(cè)模式參數(shù) Tab.1 Parameters for MRM detection mode of four analytes and internal standard

2.3.2樣品處理 取血漿 200 μL至離心管，加入1 μg· mL-1內(nèi)標(biāo)溶液10 μL，渦旋1 min，加甲醇100 μL，渦旋1 min，加入鹽酸溶液(0.1 mol·L-1)200 μL，渦旋1 min混勻后加7倍量乙酸乙酯，渦旋7 min，離心(5000 r·min-1，r=10 cm，5 min)，取有機(jī)層氮?dú)獯蹈?，加甲?00 μL渦旋 2 min復(fù)溶，離心(12 000 r·min-1，r=10 cm，5 min)，取上清液進(jìn)樣分析。

2.3.3方法學(xué)考察

①專(zhuān)屬性考察。取大鼠空白血漿、空白血漿+內(nèi)標(biāo)、空白血漿+混標(biāo)溶液+內(nèi)標(biāo)，給藥后血漿樣品，經(jīng)“2.3.2”項(xiàng)下方法處理后，按“2.3.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明，空白血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)均能與蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸、大黃酚、內(nèi)標(biāo)色譜峰分開(kāi)，不干擾測(cè)定。

②線性關(guān)系和定量限。取空白血漿200 μL，分別精密加入系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)各10 μL，按樣品處理方法處理，進(jìn)樣分析。采用加權(quán)(W=1/X2)最小二乘法，以蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(Y)對(duì)濃度(X)作線性回歸，結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)曲線方程依次為Y=0.012 6X+0.006 3(r=0.994 9)，Y=0.315 0X+0.044 6(r=0.999 0)，Y=0.042 6X+0.128 0(r=0.997 1)，Y=0.062 4X-0.074 20(r=0.999 9)，Y=0.205 3X+0.006 4(r=0.999 7)，線性范圍依次為5.10～652.50，1.35～172.38，31.25～4000，9.38～1200 ng· mL-1，表明各成分在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低定量限依次為5.10，1.35，31.25，9.38 ng· mL-1。

③精密度與準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)。取大鼠空白血漿200 μL，精密加入混合對(duì)照品溶液，配制各成分低、中、高濃度的質(zhì)控樣品各5份，按照“2.3.2”項(xiàng)下的方法處理，測(cè)定3 d，代入隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求得各成分濃度，計(jì)算日內(nèi)、日間精密度。結(jié)果見(jiàn)表2，表明蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸、大黃酚的日內(nèi)、日間精密度RSD值均小于15%，日內(nèi)、日間準(zhǔn)確度均在±15%范圍內(nèi)，符合生物樣本測(cè)定要求。

④回收率與基質(zhì)效應(yīng)實(shí)驗(yàn)。取空白血漿樣品200 μL，精密加入混合對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)溶液，制備各成分低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品各5份，經(jīng)“2.3.2”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣測(cè)定得峰面積為A，另取空白血漿，同法處理后，加入等量低、中、高濃度對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)溶液，測(cè)定得峰面積為B，測(cè)等量未經(jīng)處理的3 個(gè)濃度的工作溶液峰面積C。回收率=A/B，基質(zhì)效應(yīng)=B/C。結(jié)果見(jiàn)表2，表明蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸、大黃酚4種成分提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)均在 80%～110%之內(nèi)，均符合標(biāo)準(zhǔn)，本方法測(cè)定條件下血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)對(duì)各成分的測(cè)定沒(méi)有影響。

表2 4種成分血漿樣品的精密度、準(zhǔn)確度、回收率與基質(zhì)效應(yīng) Tab.2 Precision，accuracy，recovery and matrix effects of four analytes in plasma %，n=5

⑤穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。取空白血漿樣品200 μL，分別精密加入混合對(duì)照品，配制成高、中、低3種濃度的樣品各5份，分別于室溫條件下存放24 h，-20 ℃冷凍-室溫融化循環(huán)3次，-20 ℃存放2周后，按“2.3.2”項(xiàng)下方法處理，測(cè)定。結(jié)果表明4種成分在3種條件下測(cè)得濃度RSD值均小于15%，說(shuō)明樣品穩(wěn)定性良好。

2.4藥動(dòng)學(xué)研究 雄性SD大鼠10只，給藥前均禁食12 h，自由飲水，按體質(zhì)量隨機(jī)分為清胰煎劑組和清胰顆粒組，分別按26 g·kg-1量灌胃給“2.1”項(xiàng)下制備的清胰煎劑和顆粒溶液。于給藥后0.083，0.25，0.5，1，2，3，4，6，8，12，24 h眼眶靜脈取血1 mL，存于有肝素鈉的尖底離心管中，4 ℃離心(5000 r·min-1，r=10 cm，10 min)，取血漿200 μL。按“2.3.2”項(xiàng)方法處理，按“2.3.1”項(xiàng)方法分析，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)大鼠血漿中蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸、大黃酚的血藥濃度。將其他成分血藥濃度數(shù)據(jù)用PkSolver軟件，選擇非房室模型處理[10]，清胰煎劑組和顆粒組活性成分的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表3。

表3 清胰煎劑及顆粒中 4種成分的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù) Tab.3 Pharmacokinetic parameters of four analytes after oral administration of Qingyi decoction and granules

結(jié)果表明，清胰顆粒組蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸的達(dá)峰時(shí)間(tmax)均比煎劑組提前；大黃酚延緩25 min。顆粒組大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素Cmax略低于煎劑組；大黃酚兩組基本相等。煎劑組蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚AUC0-∞比顆粒劑組稍大。采用SPSS 16.0版軟件對(duì)兩組主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果表明，清胰顆粒組4種成分所有藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(tmax、t1/2、Cmax、AUC0-∞、MRT0-∞、Vz/F、CL/F)與煎劑組相比均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明清胰顆粒劑和煎劑具有相似的藥動(dòng)學(xué)特征。

3 討論

本研究對(duì)清胰制劑的君藥大黃中有效成分蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸、大黃酚的血藥濃度進(jìn)行測(cè)定，比較清胰傳統(tǒng)煎劑與顆粒在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征，實(shí)驗(yàn)選擇乙腈、甲醇沉淀蛋白，乙醚、乙酸乙酯、三氯甲烷萃取處理樣品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用萃取法處理樣品，大黃酸的提取率和基質(zhì)效應(yīng)只有50%，采用沉淀蛋白法時(shí)蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸的提取率和基質(zhì)效應(yīng)比較低。大黃中蒽醌類(lèi)成分主要有結(jié)合型和游離型，結(jié)合蒽醌進(jìn)入體內(nèi)后，經(jīng)過(guò)腸道菌群代謝為游離蒽醌進(jìn)而發(fā)揮作用[11]。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定游離蒽醌，結(jié)果表明該方法處理樣品空白血漿的干擾較小，提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)均高，線性關(guān)系、精密度、穩(wěn)定性良好。

本研究結(jié)果顯示，清胰顆粒中4種成分主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)與煎劑比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明兩劑型具有相似的藥動(dòng)學(xué)特征。兩種劑型均吸收迅速，適用AP發(fā)病急、進(jìn)展快的特征?？傮w上，煎劑AUC比顆粒劑稍大，煎劑的生物利用度稍大，顆粒血藥濃度達(dá)峰時(shí)間比煎劑快，這可能由于清胰顆粒中加入了輔料，促進(jìn)藥物吸收，使得顆粒組的達(dá)峰時(shí)間提前。同一組不同的大鼠之間差異較大，一是由于動(dòng)物自身的差異，二是由于處方中的君藥大黃有瀉熱通便、攻積滯的功效，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)所有大鼠均存在腹瀉現(xiàn)象，且發(fā)生腹瀉的時(shí)間與程度不一，對(duì)藥物吸收產(chǎn)生不同程度影響。中藥成分復(fù)雜，復(fù)方更是如此，且配伍后相互影響，難全面闡明中藥復(fù)方的吸收、分布、代謝和排泄規(guī)律。文獻(xiàn)[10，12]報(bào)道無(wú)論是單味大黃給藥還是復(fù)方制劑給藥，大黃中游離蒽醌類(lèi)成分在體內(nèi)吸收快，但消除較慢，大黃素、大黃酸、大黃酚和蘆薈大黃素在給藥后24 h可檢測(cè)到。大黃酸在大鼠血漿中的濃度明顯高于大黃素、蘆薈大黃素和大黃酚，這可能是由于大黃酸在清胰煎劑與顆粒中含量最高，而另外3種成分含量較低，且大黃素和蘆薈大黃素能在體內(nèi)被氧化并轉(zhuǎn)化為大黃酸[13]。番瀉苷A是大黃蒽醌類(lèi)衍生物以及蒽酮與葡萄糖結(jié)合形成的苷類(lèi)，在體內(nèi)能被β-葡萄糖苷酶代謝為蒽酮，再氧化得到其苷元大黃酸[14]。因此，這在一定程度上增加了大鼠體內(nèi)大黃酸濃度，而大黃素甲醚在體內(nèi)的含量較低無(wú)法檢測(cè)。這些均與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果基本一致。本研究為清胰制劑的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。