補骨脂定對骨髓間充質(zhì)干細胞向癌相關(guān)成纖維細胞分化的抑制作用*

鐘媚共，阮曉紅，鄭明珠，陸文潔，陳莎莎，，林碧華，鄭焱，張鑫

[1.江門市婦幼保健院藥學部，江門 529000；2.江門市中心醫(yī)院婦科，江門 529030；3.江門市中心醫(yī)院中心實驗室，江門 529030；4.廣東醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，東莞 523808；5.廣東省人乳頭狀瘤病毒(HPV)相關(guān)疾病分子診斷工程技術(shù)研究開發(fā)中心，潮州 521021]

乳腺癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌是最主要的4種女性特發(fā)惡性腫瘤，其對應的2018年全球估算的女性新發(fā)病率分別是每10萬人45.3，13.1，8.4和6.6例，占全部女性腫瘤患者的38.6%，是威脅全球女性健康的重要風險因素[1]。對于中晚期患者，化學治療(化療)是關(guān)鍵的治療方法，但是化療不敏感及誘導耐藥的情況時有發(fā)生。研究表明[2-3]，癌細胞化療抵抗的獲得與腫瘤微環(huán)境的組成密切相關(guān)，特別是癌相關(guān)成纖維細胞(carcinoma associated fibroblasts，CAFs)對腫瘤細胞的支持在其中起到關(guān)鍵作用。

CAFs細胞一般源于被腫瘤細胞激活招募的成纖維細胞或肌成纖維細胞，也能由間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)在腫瘤細胞招募誘導下分化而成。而α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)是MSCs分化成CAFs后所特征性表達的基因之一[4- 5]。有研究報道，骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)能被招募到腫瘤組織，并向CAFs方向分化，對腫瘤起促進作用[5- 6]；但非成體固有的臍帶間充質(zhì)干細胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs)在歸巢至腫瘤組織后，卻常起著抑癌作用[7- 8]，而 UCMSCs是否能被誘導成CAFs還存爭議。

補骨脂定(psoralidin)為中藥補骨脂的藥效成分之一，屬于香豆素類化合物，具有抗骨質(zhì)疏松、調(diào)控細胞分化和抗腫瘤等作用。研究指出，補骨脂定能促進BMSCs向成骨細胞分化并抑制其向脂肪細胞分化[9-11]，表明補骨脂定在調(diào)控BMSCs分化中起重要作用。因此，筆者通過觀察BMSCs、UCMSCs與4種女性特發(fā)惡性腫瘤細胞共培養(yǎng)后，向CAFs方向分化的情況，探討補骨脂定對MSCs向CAFs方向分化的作用，以及對共培養(yǎng)體系中癌細胞的影響。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 補骨脂定購自上海阿拉丁公司，為高效液相色譜對照品，含量：98%，批號：P168140。DMEM/F12培養(yǎng)液、RPMI-1640培養(yǎng)液、MEM培養(yǎng)液、McCoy's 5A培養(yǎng)液、Opti-MEN培養(yǎng)液、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、L-谷氨酰胺和100×青霉素-鏈霉素(penicillin/streptomycin，P/S)為美國ThermoFisher公司產(chǎn)品；孔徑3.0 μm的PET聚酯膜細胞嵌入皿(Transwell小室培養(yǎng)皿)購自廣州潔特公司；細胞增殖毒性檢測(CCK-8)試劑盒(批號：CK04)購自日本同仁公司；針對STAT3(批號：9139)、p-STAT3 (Y705)(批號：9145)、JAK2(批號：74987)、p-JAK2 (Y1007/1008)(批號：3776)和α-tubulin(編號：2125)的抗體和Alexa Fluor 488標記的抗小鼠二抗(批號：4408)購自美國Cell Signal Technology公司；針對α-SMA(批號：ab32575)的抗體購自美國Abcam公司。Synergy2多功能酶標儀為美國BioTek公司產(chǎn)品，Mini-Protean電泳和Mini Trans-Blot轉(zhuǎn)膜設備為美國BIO-RAD公司產(chǎn)品，HD9 Touch多功能成像系統(tǒng)為英國UVITEC公司產(chǎn)品，Gallios流式細胞儀為美國Beckman Coulter公司產(chǎn)品。

1.2細胞及培養(yǎng)條件 人骨髓間充質(zhì)細胞(hBMSCs)、人臍帶間充質(zhì)干細胞(hUCMSCs)、人乳腺癌細胞(BT-549)、人子宮內(nèi)膜癌細胞(HEC-1B)、人宮頸癌細胞(Hela)和人卵巢癌細胞(SK-OV-3)購自武漢普諾賽公司，均通過短串聯(lián)重復序列鑒定，經(jīng)規(guī)范培養(yǎng)、傳代擴增后，凍存于江門市中心醫(yī)院中心實驗室(臨床生物資源庫)的液氮罐中。hBMSCs的完全培養(yǎng)基為10% FBS、2 mmol ·L-1L-谷氨酰胺和1% P/S的DMEM/F12培養(yǎng)液，hUCMSCs的完全培養(yǎng)基為人MSCs無血清培養(yǎng)基(武漢普諾賽公司)，BT-549的完全培養(yǎng)基為10% FBS和1% P/S的RPMI-1640培養(yǎng)液，HEC-1B、Hela的完全培養(yǎng)基為含10% FBS和1% P/S的MEM培養(yǎng)液，SK-OV-3的完全培養(yǎng)基為含10% FBS和1% P/S的McCoy's 5A培養(yǎng)液；細胞換液、傳代、凍存及復蘇均按常規(guī)操作，所有細胞的培養(yǎng)環(huán)境均為5% 二氧化碳(CO2)、37.5 ℃恒溫恒濕。

1.3Transwell小室共培養(yǎng)體系 在Transwell共培養(yǎng)體系中，根據(jù)實驗目的，分別將MSCs或癌細胞接種在小室內(nèi)(上室)或培養(yǎng)皿中(下室)，接種密度均為(500±100)·(cm2)-1；鋪板前按常規(guī)消化處理細胞，并在共培養(yǎng)體系中加入適量的癌細胞完全培養(yǎng)液潤濕，鋪板時，用癌細胞完全培養(yǎng)液稀釋MSCs和癌細胞，先鋪下室，再鋪上室，盡量讓細胞分布均勻，正常培養(yǎng)72 h。

1.4CCK-8法測量細胞活性 如課題組前期報道所述[12]，細胞消化、計數(shù)并鋪板，正常培養(yǎng)過夜；補骨脂定對hBMSCs活性抑制實驗中，濃度梯度為0.1，0.5，1.0，5.0，10.0，50.0和100.0 μmol·L-1，1% 二甲亞砜為對照組，正常培養(yǎng)為參照組；在共培養(yǎng)體系中，待各細胞完全貼壁后，小心用含10.0 μmol·L-1的癌細胞完全培養(yǎng)液換液；均給藥培養(yǎng)72 h后，換含10% CCK-8的空白培養(yǎng)液，正常孵育1 h，測定各孔在波長450 nm處的吸光度，按下列公式計算：

抑制率=1-吸光度實驗組或?qū)φ战M/吸光度參照組

所得數(shù)據(jù)輸入CompuSyn軟件，參考說明及文獻[13]，計算對應的半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)。在計算不同處理因素對細胞活性變化的影響時，設立對應的實驗分組，如上進行操作，按下列公式計算：

活性率=吸光度實驗組/吸光度對照組×100%

1.5流式細胞術(shù)法分析細胞α-SMA表達陽性率 按實驗分組(二甲亞砜+hBMSCs組、補骨脂定+hBMSCs組、二甲亞砜+hUMSCs組、補骨脂定+hUMSCs組)處理細胞后，消化并用中性甲醛室溫固定，甲醇冰浴通透；PBS洗滌后，一抗工作液(稀釋度為1：50)，室溫孵育2 h，0.5% BSA-PBS洗滌，二抗工作液(稀釋度為1：500)，室溫孵育1 h，0.5% BSA-PBS洗滌；PBS重懸細胞后，流式細胞分析儀檢測，調(diào)整并收集每個樣品的前散射光(FSC)、側(cè)散射光(SSC)和綠光(α-SMA/Alexa Fluor 488)3個通道的信號，并以FSC/SSC作散點圖圈出主細胞群，再以α-SMA/Alexa Fluor 488對主細胞群作圖，以單加二抗的正常培養(yǎng)的MSCs為陰性參照，分出α-SMA/Alexa Fluor 488陽性細胞群，并計算各組陽性率。

1.6Western blotting檢測蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)磷酸化水平 細胞總蛋白提取使用RIPA裂解液，使用前加入蛋白酶抑制劑混合物及蛋白磷酸酶抑制劑混合物，冰上裂解、超聲破碎；蛋白定量用二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒，并按說明書操作。裂解液上樣前加入按上樣緩沖液，100 ℃熱變性。使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠蛋白電泳系統(tǒng)，上樣量為50 μg總蛋白，電泳參數(shù)為8%～12%分離膠、5%濃縮膠，100 V電泳至溴酚藍指示劑遷移至底部后，進行電轉(zhuǎn)移，使用孔徑為0.2 μm的聚偏二氟乙烯膜，300 mA冰浴電轉(zhuǎn)90 min。電轉(zhuǎn)結(jié)束后，膜使用5%脫脂奶粉封閉，TBST漂洗，加入稀釋的一抗工作液[稀釋度：STAT3為1：1000、p-STAT3 (Y705)為1：2000、JAK2為1：1000、p-JAK2 (Y1007/1008)為1：1000和α-tubulin為1：1000]，4 ℃孵育過夜，TBST漂洗，加入稀釋的二抗工作液(稀釋度為1：2000)，室溫孵育，TBST漂洗，加入電化學發(fā)光液，UVITEC Alliance mini HD9多功能成像儀自動成像。

2 結(jié)果

2.1補骨脂定對MSCs及癌細胞活性的影響 CCK-8實驗中，梯度濃度的補骨脂定處理hBMSCs和hUCMSCs達72 h，用CompuSyn軟件求得補骨脂定對兩種MSCs的IC50分別為477.34和364.83 μmol·L-1；其中在10 μmol·L-1濃度下，對兩種MSCs活性的抑制率分別為(3.77±1.65)%和(3.70±2.11)%，均小于5%，故選為后續(xù)研究的濃度。此外，在10 μmol·L-1濃度下，對4種癌細胞(BT-549、HEC-1B、Hela和SK-OV-3)活性的抑制率分別為(8.17±3.04)%，(4.57±3.95)%，(7.79±5.69)%和(8.33±3.45)%，均小于10%。

2.2補骨脂定對MSCs向成纖維細胞分化的影響 用10 μmol·L-1補骨脂定處理2種MSCs達72 h，流式細胞術(shù)分析hBMSCs和hUCMSCs中α-SMA表達情況見圖1，如圖1所示，相對于二甲亞砜處理組，補骨脂定處理2種MSCs細胞后α-SMA的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3與癌細胞共培養(yǎng)體系中MSCs向CAFs分化的變化 在MSCs與癌細胞的Transwell共培養(yǎng)72 h后，流式細胞儀分析培養(yǎng)上室MSCs中α-SMA表達情況(表1)。結(jié)果顯示，相對于單獨培養(yǎng)對照組，hBMSCs與4種癌細胞共培養(yǎng)后α-SMA表達陽性率上升(P<0.05)，但hUCMSCs在共培養(yǎng)體系中α-SMA表達陽性率變化無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 與癌細胞共培養(yǎng)體系中MSCs的α-SMA表達陽性率 Tab.1 Positive expression rate of α-SMA in MSCs in co-culture system of cancer cells

2.4補骨脂定對共培養(yǎng)體系中MSCs向CAFs分化的影響 在MSCs與癌細胞的Transwell共培養(yǎng)體系中，用10 μmol·L-1補骨脂定處理72 h，流式細胞儀分析培養(yǎng)上室MSCs中α-SMA表達情況(表2)。結(jié)果顯示，相對于二甲亞砜對照組，10 μmol·L-1補骨脂定能顯著抑制hBMSCs中α-SMA的表達率(P<0.05)，但不影響hUCMSCs中α-SMA的表達率(P>0.05)。

表2 4組共培養(yǎng)體系中α-SMA表達陽性率比較 Tab.2 Positive expression rate of α-SMA in four groups of co-culture system of cancer cells

2.5與MSCs共培養(yǎng)體系中癌細胞活性的變化 在MSCs與癌細胞的Transwell共培養(yǎng)72 h后，以癌細胞單獨培養(yǎng)組為對照，CCK-8檢測培養(yǎng)下室4種癌細胞的活性變化(表3)。結(jié)果顯示，與hBMSCs共培養(yǎng)時癌細胞活性提高(t=22.01，11.34，15.93，16.06，P<0.05)，但與hUCMSCs共培養(yǎng)時癌細胞活性降低(t=14.99，9.59，8.39，19.75，P<0.05)。

表3 與MSCs共培養(yǎng)體系中癌細胞活性的變化 Tab.3 Cell viability of cancer cells in co-culture system with MSCs

A.二甲亞砜+hBMSCs組；B.補骨脂定+hBMSCs組；C.二甲亞砜+hUCMSCs組；D.補骨脂定+hUCMSCs組。圖1 流式細胞術(shù)檢測MSCs中α-SMA的表達陽性率 A.dimethyl sulfoxide+hBMSCs group；B.psoraldin +hBMSCs group；C.dimethyl sulfoxide +hUCMSCs group；D.psoralidin +hUCMSCs group.Fig.1 Positive expression rate of α-SMA in MSCs determined by flow cytometry

2.6補骨脂定對共培養(yǎng)體系中癌細胞活性的影響 在MSCs與癌細胞的Transwell共培養(yǎng)體系中，以正常共培養(yǎng)組為對照，用10 μmol·L-1補骨脂定處理72 h，CCK-8檢測培養(yǎng)下室癌細胞的活性變化(表4)。結(jié)果顯示，在兩種共培養(yǎng)體系中，相對于二甲亞砜對照組，10 μmol·L-1補骨脂定均能顯著降低4種癌細胞的活性(hBMSCs共培養(yǎng)組：t=6.62，6.57，5.50，8.68，P<0.05；hUCMSCs共培養(yǎng)組：t=8.62，16.67，4.93，9.06，P<0.05)。

表4 4組共培養(yǎng)體系中癌細胞的活性比較 Tab.4 Cell viability of cancer cells in four groups of co-culture system of cancer cells

2.7與MSCs共培養(yǎng)體系中癌細胞p-JAK2和p-STAT3表達的變化 4種癌細胞單獨培養(yǎng)或與2種MSCs共培養(yǎng)72 h后，以免疫印跡法檢測癌細胞中p-JAK2和p-STAT3的表達情況(圖2)。如圖2所示，與hBMSCs共培養(yǎng)時，4種癌細胞的p-JAK2和p-STAT3表達明顯上調(diào)，而與hUCMSCs共培養(yǎng)時2種蛋白表達明顯下調(diào)。

2.8補骨脂定對共培養(yǎng)體系中癌細胞p-JAK2和p-STAT3表達的影響 在MSCs與癌細胞的Transwell共培養(yǎng)體系中，用10 μmol·L-1補骨脂定處理72 h，免疫印跡法檢測培養(yǎng)下室中4種癌細胞的p-JAK2和p-STAT3表達情況(圖3)。如圖3所示，相對于二甲亞砜對照組，10 μmol·L-1補骨脂定能明顯抑制與hBMSCs共培養(yǎng)癌細胞中p-JAK2和p-STAT3的表達，但在hUCMSCs共培養(yǎng)下，經(jīng)補骨脂定處理后，4種癌細胞中p-JAK2和p-STAT3的表達變化均較小。

A.單獨培養(yǎng)；B.與hBMSCs共培養(yǎng)；C.與hUCMSCs共培養(yǎng)。圖2 與MSCs共培養(yǎng)體系中癌細胞p-JAK2和p-STAT3表達的變化 A.single cultivation；B.co-culture with hBMSCs；C.co-culture with hUCMSCs.Fig.2 Protein expression of p-JAK2 and p-STAT3 in cancer cells in co-culture system with MSCs

3 討論

hBMSCs和hUCMSCs分別與4種女性特發(fā)惡性腫瘤細胞Transwell共培養(yǎng)體系顯示，hBMSCs能促進癌細胞的增殖，而hUCMSCs則抑制癌細胞的增殖；相對應的是，4種癌細胞均能促進hBMSCs高表達α-SMA，但并不誘導hUCMSCs中α-SMA的表達。在臨床觀察及實驗研究中，表達α-SMA被認為是成纖維細胞、肌成纖維細胞及周細胞的標志，在MSCs中不表達或表達量很低，同時也不在MSCs分化所得的成骨細胞中表達，可作為CAFs的蛋白標志物之一[5-6，14-16]。因此，本研究結(jié)果顯示，hBMSCs在腫瘤細胞的誘導下向CAFs分化，并同時促進了癌細胞的惡性增殖，而hUCMSCs對腫瘤的抑制作用則可能與其不能被馴化成CAFs相關(guān)。

分化成CAFs的MSCs細胞可以通過分泌多種細胞因子，如堿性成纖維生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、白細胞介素(IL)-6、轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGF-)等，直接或間接促進癌細胞的惡性表型[3]；其中，白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)被認為是CAFs細胞促進癌細胞化療耐受的關(guān)鍵[4]，而上述細胞因子在作用于癌細胞的相應受體后，常共同激活JAK2/STAT3信號通路，進而激活上調(diào)與腫瘤惡性表型相關(guān)的基因，促進了腫瘤的各種惡性表型特征的出現(xiàn)[17]。因此，筆者觀察了共培養(yǎng)體系中能反映癌細胞JAK2/STAT3信號通路激活水平的p-JAK2和p-STAT3表達情況。結(jié)果顯示，與hBMSCs共培養(yǎng)的4種癌細胞中，p-JAK2和p-STAT3的表達水平均顯著升高，而與hUCMSCs共培養(yǎng)的癌細胞中，p-JAK2和p-STAT3的表達水平變化較小，表明朝CAFs方向分化的hBMSCs能通過分泌因子來激活癌細胞中的JAK2/STAT3信號通路，而hUCMSCs則不能有效激活共培養(yǎng)的癌細胞中JAK2/STAT3信號通路。

A.二甲亞砜+hBMSCs組；B.補骨脂定+hBMSCs組；C.二甲亞砜+hUCMSCs組；D.補骨脂定+hUCMSCs組。圖3 補骨脂定對共培養(yǎng)體系中癌細胞p-JAK2和p-STAT3表達的影響 A.DMSO +hBMSCs group；B.psoralidin +hBMSCs group；C.DMSO +hUCMSCs group；D.psoralidin +hUCMSCs group.Fig.3 Effect of psoralidin on the expression of p-JAK2 and p-STAT3 in cancer cells in co-culture system with MSCs

此外，本研究還檢測了補骨脂定對hBMSCs和hUCMSCs的活性影響情況，觀察到補骨脂定不影響單獨培養(yǎng)的MSCs及共培養(yǎng)的hUCMSCs中α-SMA的表達，但能顯著抑制與4種癌細胞共培養(yǎng)的hBMSCs表達α-SMA；與此對應的是，10 μmol·L-1補骨脂定對4種癌細胞增殖活性的抑制作用并不明顯(<10%)，但能顯著抑制與hBMSCs共培養(yǎng)的癌細胞活性，以及癌細胞中p-JAK2和p-STAT3的表達水平。這表明補骨脂定能抑制癌細胞對hBMSCs的馴化，降低癌細胞中JAK2/STAT3信號通路的活性，抑制癌細胞的惡性增殖。

雖然本研究結(jié)果是通過hBMSCs和hUCMSCs與癌細胞體外的Transwell共培養(yǎng)體系進行實驗和檢測的，但依然體現(xiàn)出不同MSCs在不同微環(huán)境狀態(tài)下具有不同的功能，表明MSCs在臨床應用中值得進一步觀察和研究。補骨脂定能進一步降低hUCMSCs對癌細胞增殖活性的抑制，但其是否能加強hUCMSCs的抗癌作用及其機制仍需進一步研究。