雞樅菌菌絲體液體發(fā)酵培養(yǎng)液配方的優(yōu)化

張明星 李 潔 張玄妮 李歡歡 謝 娟 徐學(xué)鋒

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣州 510642）

雞樅菌（Termitomycesspp.）隸屬于擔(dān)子菌門傘菌綱傘菌目離褶傘科蟻巢傘屬，其子實(shí)體不僅味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，還具有免疫調(diào)節(jié)[1]、抗氧化[2]、降血糖[3]等功效，是一種集食用和藥用于一身的珍貴食用菌。雞樅菌作為一個(gè)與白蟻共生的菌類，其原生環(huán)境十分復(fù)雜，且菌絲生長(zhǎng)于白蟻活動(dòng)的菌圃之上，再加上其與菌圃之間的關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜、與菌圃內(nèi)部的白蟻協(xié)同進(jìn)化，其生理生化特性尚未明晰，故長(zhǎng)期以來，其子實(shí)體只能在部分地區(qū)的特定季節(jié)，以野生采摘的形式獲取，種質(zhì)資源利用十分受限。目前，人工栽培雞樅菌的嘗試與研究較多，但效果均一般，且關(guān)于雞樅菌生長(zhǎng)條件的研究報(bào)道較少[4-7]，故至今無法實(shí)現(xiàn)真正意義上的雞樅菌人工馴化。而雞樅菌菌絲體采用液體發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)，具有發(fā)酵速度快、周期短的特點(diǎn)，這有助于雞樅菌的人工馴化和資源利用。在此背景下，筆者對(duì)雞樅菌菌絲體液體發(fā)酵培養(yǎng)液的配方進(jìn)行了優(yōu)化，以期完善雞樅菌菌絲體液體發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)?，F(xiàn)將相關(guān)試驗(yàn)結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

野生雞樅菌（Genebank：MW692851，Sequence ID：AB960801.1）于2019年7月采集于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)。該菌株菌蓋長(zhǎng)8～12 cm，中央尖突，顏色為灰褐色或暗褐色，菌蓋邊緣為灰白色，邊緣形狀不規(guī)則，呈輻射狀開裂，有柱狀菌索。采用組織分離法獲得雞樅菌菌絲體，其菌絲細(xì)密，易在培養(yǎng)基（PDA）上形成褶皺，屬于匍匐型（菌絲體形態(tài)特征描述參照龍正海等[8]）。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 試劑及培養(yǎng)材料

具體為：牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、麥芽浸提物、可溶性淀粉（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn)），硝酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂（購(gòu)于廣東光華化學(xué)廠有限公司），葡萄糖、硫酸銅、氫氧化鈉、氯化鉀[購(gòu)于福晨(天津)化學(xué)試劑有限公司]，麥芽糖、乳糖、蔗糖（購(gòu)于天津富宇精細(xì)化工有限公司），膨化豆粕[購(gòu)于益海（連云港）糧油工業(yè)有限公司]，小麥麩皮[購(gòu)于益海嘉里（鄭州）食品工業(yè)有限公司]。

1.2.2 試驗(yàn)儀器

具體為：HVE-50型全自動(dòng)高壓滅菌鍋（日本Hirayama公司），雷磁pHs-25型數(shù)顯pH計(jì)（上海偉業(yè)儀器廠），SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），TG-16W臺(tái)式高速離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司），F(xiàn)SH-2A可調(diào)高速均質(zhì)機(jī)（常州市國(guó)旺儀器制造有限公司），101AS-3電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海浦東躍東欣科學(xué)儀器廠），LRH-250A型生化培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠），SPH-2102C立式恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海四平試驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2.3 供試培養(yǎng)液制備

基礎(chǔ)培養(yǎng)液（PD）：取土豆200.0 g，熬汁過濾后加葡萄糖20.0 g，蒸餾水定容至1 L，pH自然。

改良PD培養(yǎng)液：PD培養(yǎng)液取1 L，加入硫酸鎂1.0 g、磷酸二氫鉀1.0 g，pH自然。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 雞樅菌菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)試驗(yàn)

將平板中的菌種接入50 mL錐形瓶中，加入20 mL無菌水，并用均質(zhì)機(jī)在轉(zhuǎn)速10 000g下工作30 s，將打碎的菌絲液吸入改良PD培養(yǎng)液中，每瓶加入5 mL菌液，于28 ℃、150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。將活化的一級(jí)菌種過濾、沖洗，然后將菌球倒入50 mL錐形瓶中，加入5 mL無菌水，并用均質(zhì)機(jī)在轉(zhuǎn)速10 000g下勻漿30 s，然后將其全部轉(zhuǎn)移到裝有300 mL無菌水的500 mL錐形瓶中混勻。將活化的菌種液，以5%的接種量接種到改良PD培養(yǎng)液中，共接種54瓶，于28 ℃、150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9 d，每隔12 h取樣1次，每次取3瓶，用蒸餾水將發(fā)酵好的菌液清洗3次，于80 ℃烘箱中烘至恒重，檢測(cè)菌絲體生物量，并確定雞樅菌發(fā)酵的截止時(shí)間，以作為后續(xù)單因素試驗(yàn)的最佳發(fā)酵時(shí)間。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

為明確培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)液pH、硫酸鎂添加量、磷酸二氫鉀添加量、硫酸銅添加量、碳源、氮源等因素對(duì)雞樅菌菌絲生長(zhǎng)的影響，在不同碳源、氮源、pH和不同硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸銅添加量的培養(yǎng)液中接入5%的活化菌種液，于28 ℃、150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)到雞樅菌菌絲體最佳發(fā)酵時(shí)間，取出已發(fā)酵好的菌液用蒸餾水清洗3次，于80 ℃烘箱中烘至恒重，檢測(cè)菌絲體生物量。具體為：（1）培養(yǎng)溫度試驗(yàn)。向同上述1.3.1步驟中的改良PD培養(yǎng)液中接種一級(jí)菌種，并于22、25、28、31、34 ℃下進(jìn)行黑暗培養(yǎng)。每處理重復(fù)3次。（2）培養(yǎng)液pH試驗(yàn)。用1%NaOH和1%HCl 調(diào)節(jié) PD 培養(yǎng)液的 pH 分別為 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。每處理重復(fù)3次。（3）硫酸鎂試驗(yàn)。向PD培養(yǎng)液中加入硫酸鎂，添加量（質(zhì)量濃度）分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 g/L。每處理重復(fù)3次。（4）磷酸二氫鉀添加量試驗(yàn)。向PD培養(yǎng)液中加入磷酸二氫鉀，添加量（質(zhì)量濃度）分別為 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 g/L。每處理重復(fù)3次。（5）硫酸銅添加量試驗(yàn)。向PD培養(yǎng)液中加入硫酸銅，添加量（質(zhì)量濃度）分別為 0、0.015、0.030、0.045、0.060、0.075 g/L（硫酸銅溶液要與培養(yǎng)液分開單獨(dú)滅菌）。每處理重復(fù)3次。（6）碳源試驗(yàn)。碳源添加量（質(zhì)量濃度）分別為葡萄糖2.0 g/L、乳糖2.0 g/L、果糖2.0 g/L、淀粉2.0 g/L、蔗糖2.0 g/L、麥芽糖2.0 g/L。每處理重復(fù)3次。（7）氮源試驗(yàn)。以20 g葡萄糖為基礎(chǔ)加入氮源，氮源添加量（質(zhì)量濃度）分別為酵母浸膏3.0 g/L、蛋白胨3.0 g/L、硝酸銨3.0 g/L、牛肉膏3.0 g/L、膨化豆粕5.0 g/L、麥芽浸汁2.0 g/L。每處理重復(fù)3次。

1.3.3 最優(yōu)培養(yǎng)液配方組合篩選

本試驗(yàn)以菌絲體生物量為主要測(cè)量指標(biāo)，并參考常見的食用菌優(yōu)良液體發(fā)酵感官指標(biāo)，以菌液澄清、無異味，菌球輪廓清晰、大小均一為宜[9-12]，選擇對(duì)雞樅菌菌絲體生物量影響較為顯著的三個(gè)因素進(jìn)行組合，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平，篩選出最優(yōu)的培養(yǎng)液配方組合。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS V20.0進(jìn)行處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞樅菌菌絲體液體發(fā)酵培養(yǎng)的生長(zhǎng)特性

由圖1可知，在發(fā)酵培養(yǎng)的第3天到第5天，雞樅菌菌絲體生物量急劇增加；從第5天開始，雞樅菌菌絲體生物量增速變緩；第6天到第7天，雞樅菌菌絲體生物量雖有所增加但不顯著；從第8天開始，雞樅菌菌絲體生物量顯著降低。據(jù)觀察雞樅菌菌絲體在發(fā)酵瓶中的生長(zhǎng)狀態(tài)發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵培養(yǎng)開始后的第2天，菌絲體變化不明顯；第3天開始，能明顯觀察到菌絲體向四周伸長(zhǎng)；第4天，菌絲體逐漸變圓有毛刺；第5天，能觀察到菌絲體毛刺減少，菌球變飽滿；第6天，菌球飽滿、圓滑；第7天變化不明顯；第8天菌絲體自溶，時(shí)間越往后自溶現(xiàn)象越明顯。綜合菌絲體生物量變化和發(fā)酵現(xiàn)象，最終確定發(fā)酵截止時(shí)間為第7天。

圖1 雞樅菌菌絲體在液體發(fā)酵培養(yǎng)中生長(zhǎng)曲線

2.2 培養(yǎng)溫度對(duì)雞樅菌菌絲體生物量的影響

由圖2可知，當(dāng)培養(yǎng)溫度低于28 ℃時(shí)，雞樅菌菌絲體生物量隨培養(yǎng)溫度的增加而顯著增加；當(dāng)培養(yǎng)溫度為28 ℃時(shí)，雞樅菌菌絲體生物量達(dá)到最大，為11.03 g/L；當(dāng)培養(yǎng)溫度高于28 ℃時(shí)，雞樅菌菌絲體生物量顯著降低，且培養(yǎng)溫度為31 ℃時(shí)雞樅菌菌絲體生物量顯著低于培養(yǎng)溫度為22 ℃時(shí)的雞樅菌菌絲體生物量，表明高溫對(duì)雞樅菌菌絲生長(zhǎng)有害。但是，由于低溫、高溫對(duì)雞樅菌菌絲體生物量的抑制作用均顯著，且恒溫振蕩培養(yǎng)箱本身存在一定的溫控誤差，故在后續(xù)試驗(yàn)中將不再調(diào)查培養(yǎng)溫度對(duì)雞樅菌菌絲體生物量的影響。經(jīng)綜合考慮，最終確定雞樅菌菌絲體的最適培養(yǎng)溫度為28 ℃。

圖2 培養(yǎng)溫度對(duì)雞樅菌菌絲體生物量的影響

2.3 培養(yǎng)液pH對(duì)雞樅菌菌絲體生物量的影響

由圖3可知，雞樅菌菌絲體生物量隨培養(yǎng)液pH的增加呈先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)培養(yǎng)液pH為6.0時(shí)，雞樅菌菌絲體生物量達(dá)到最高，為10.87 g/L。通過觀察雞樅菌菌絲體在發(fā)酵瓶中的生長(zhǎng)狀態(tài)可知，在不同pH的培養(yǎng)液中，菌液的澄清程度和菌球形態(tài)無明顯變化。經(jīng)綜合考慮，最終確定雞樅菌菌絲體液體發(fā)酵培養(yǎng)液的最適pH為6.0。

圖3 培養(yǎng)液pH對(duì)雞樅菌菌絲體生物量的影響

2.4 硫酸鎂不同添加量對(duì)雞樅菌菌絲體生物量的影響

由圖4可知，雞樅菌菌絲體生物量隨硫酸鎂添加量的增加大體上呈先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)硫酸鎂添加量為1.0 g/L時(shí)，雞樅菌菌絲體生物量為最高，達(dá)11.10 g/L。通過觀察雞樅菌菌絲體在發(fā)酵瓶中的生長(zhǎng)狀態(tài)可知，當(dāng)硫酸鎂添加量高于1.5 g/L時(shí)，菌球會(huì)發(fā)生自溶，表明硫酸鎂添加量對(duì)雞樅菌菌絲體菌球形狀的影響較大。經(jīng)綜合考慮，最終確定硫酸鎂的最適添加量為1.0 g/L。

圖4 硫酸鎂不同添加量對(duì)雞樅菌菌絲體生物量的影響

2.5 磷酸二氫鉀不同添加量對(duì)雞樅菌菌絲體生物量的影響

由圖5可知，雞樅菌菌絲體生物量隨磷酸二氫鉀添加量的增加大體上呈先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)磷酸二氫鉀添加量為1.0 g/L時(shí)，雞樅菌菌絲體生物量達(dá)到最高，為10.70 g/L；當(dāng)磷酸二氫鉀添加量為1.5 g/L時(shí)，雞樅菌菌絲體生物量顯著降低。經(jīng)綜合考慮，最終磷酸二氫鉀的最適添加量為1.0 g/L。

圖5 磷酸二氫鉀不同添加量對(duì)雞樅菌菌絲體生物量的影響

2.6 硫酸銅不同添加量對(duì)雞樅菌菌絲體生物量的影響

由圖6可知，雞樅菌菌絲體生物量隨硫酸銅添加量的增加而顯著降低，經(jīng)分析，這可能是因?yàn)橥炼怪械你~離子已足夠供應(yīng)雞樅菌菌絲體生長(zhǎng)，或是硫酸銅對(duì)雞樅菌菌絲體有毒害作用，額外添加銅離子會(huì)抑制雞樅菌菌絲體的生長(zhǎng)。

圖6 硫酸銅不同添加量對(duì)雞樅菌菌絲體生物量的影響

2.7 不同碳源對(duì)雞樅菌菌絲體生物量的影響

由圖7可知，不同碳源對(duì)雞樅菌菌絲體生物量有顯著影響，以碳源為葡萄糖時(shí)，雞樅菌菌絲體生物量顯著高于其他碳源，為11.70 g/L。通過觀察雞樅菌菌絲體在發(fā)酵瓶中的生長(zhǎng)狀態(tài)可知，以淀粉為碳源時(shí)，菌液渾濁，菌球形狀不規(guī)則，自溶現(xiàn)象明顯；以果糖為碳源時(shí)，菌液澄清、靜置分層，且與其他碳源相比，菌球偏大且密度較低；以葡萄糖為碳源時(shí)，菌液澄清、靜置不分層，菌球大小均一懸浮能力強(qiáng)。經(jīng)綜合考慮，最終雞樅菌菌絲體液體發(fā)酵培養(yǎng)的最適碳源為葡萄糖。

圖7 不同碳源對(duì)雞樅菌菌絲體生物量的影響

2.8 不同氮源對(duì)雞樅菌菌絲體生物量的影響

由圖8可知，不同氮源對(duì)雞樅菌菌絲體生物量有顯著影響，以膨化豆粕為氮源時(shí)，雞樅菌菌絲體生物量顯著高于其他氮源，達(dá)11.42 g/L；而以牛肉膏及麥芽浸汁為氮源時(shí)，雞樅菌菌絲體生物量均與以膨化豆粕為氮源相差不大，且均顯著高于以酵母浸膏、蛋白胨及硝酸銨為氮源。通過觀察雞樅菌菌絲體在發(fā)酵瓶中的生長(zhǎng)狀態(tài)可知，以蛋白胨為氮源時(shí)，菌株大小均一性差；以膨化豆粕為氮源時(shí)，菌液澄清，菌球飽滿且相對(duì)較硬；以硝酸銨為氮源時(shí)，菌液澄清，菌球小而細(xì)膩；以牛肉膏、酵母膏和麥芽浸汁為氮源時(shí)，菌液澄清，菌球飽滿，菌絲細(xì)膩程度介于以膨化豆粕與硝酸銨為氮源之間。經(jīng)綜合考慮，最終取膨化豆粕為雞樅菌菌絲體液體發(fā)酵培養(yǎng)的最適氮源。

圖8 不同氮源對(duì)雞樅菌菌絲體生物量的影響

2.9 雞樅菌菌絲體液體發(fā)酵培養(yǎng)液的最優(yōu)配方組合

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，選擇對(duì)雞樅菌菌絲體生物量影響較為顯著的氮源、培養(yǎng)液pH和磷酸二氫鉀添加量三個(gè)因素進(jìn)行組合。由表1可知，以2號(hào)培養(yǎng)液對(duì)雞樅菌菌絲體的生長(zhǎng)促進(jìn)作用最為顯著，菌絲體生物量達(dá)11.6 g/L。

表1 雞樅菌菌絲體液體發(fā)酵培養(yǎng)液的最優(yōu)配方組合

3 結(jié) 論

試驗(yàn)結(jié)果表明，供試雞樅菌菌絲體在供試培養(yǎng)液上均能生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)速度差異達(dá)顯著水平，說明培養(yǎng)溫度、磷酸二氫鉀添加量、培養(yǎng)液pH、碳源、氮源對(duì)菌絲體的生長(zhǎng)都有一定影響。單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示，在本試驗(yàn)條件下，雞樅菌菌絲體生長(zhǎng)的最適碳源為葡萄糖，最適氮源為膨化豆粕，最適硫酸鎂添加量為1.0 g/L，最適磷酸二氫鉀添加量為1.0 g/L，最適培養(yǎng)液pH為6.0，最適培養(yǎng)溫度為28℃；最優(yōu)培養(yǎng)液配方組合篩選試驗(yàn)結(jié)果顯示，雞樅菌菌絲體生長(zhǎng)的液體培養(yǎng)液配方以氮源為膨化豆粕、硫酸鎂添加量為1.5 g/L、培養(yǎng)液pH為6.0最適宜，此配方的雞樅菌菌絲體生物量最高，達(dá)11.6 g/L，該配方組合結(jié)果與前人的研究結(jié)果一致，但雞樅菌菌絲體生物量有一定差距[13]，這可能是因?yàn)殡u樅菌的種類不同，或是因?yàn)榕c雞樅菌共生的白蟻種屬不同，或是因?yàn)殡u樅菌經(jīng)離體培養(yǎng)優(yōu)化之后，嗜好生存條件不同[14]，或是因?yàn)榘l(fā)酵后雞樅菌菌絲體的酶種類及酶活性在一定程度上存在差異[15-16]。

在本試驗(yàn)中，鑒于雞樅菌菌絲體生長(zhǎng)緩慢，菌絲茂密程度不一，菌齡相差較大等，本試驗(yàn)對(duì)其接種方式進(jìn)行了改進(jìn)，有別于傳統(tǒng)的打孔法接種，本試驗(yàn)事先在無菌條件下將菌絲打碎，得到了相對(duì)均一的菌液。同時(shí)，在本試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，不同培養(yǎng)液對(duì)雞樅菌菌絲體不同生長(zhǎng)階段的影響不一，這說明菌絲生長(zhǎng)的全過程是變量生長(zhǎng)曲線。此外，在試驗(yàn)過程中還發(fā)現(xiàn)，菌球形態(tài)易受硫酸鎂添加量和碳源種類的影響，具體表現(xiàn)為菌絲輪廓不清晰，容易自溶，故對(duì)這兩類物質(zhì)的添加要額外注意；而培養(yǎng)液氮源為膨化豆粕時(shí)，菌絲體生物量相對(duì)最大，菌球也比其他氮源的飽滿、硬，且菌液中蘑菇的香味最濃烈，這可能是因?yàn)榕蚧蛊稍跒殡u樅菌提供氮源的同時(shí)，還提供了一定的木質(zhì)纖維素，雞樅菌對(duì)其進(jìn)行降解時(shí)分泌出了香味。