綠豆富硒過程中超氧化物歧化酶活性變化研究

◎ 陳啟鐫，廖文彬

（廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，廣東 佛山 528300）

超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）是生命體中具有活性物質(zhì)的抗氧化酶，能消除新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，持續(xù)向人體補充SOD，具有特殊的抗衰老作用，其主要作用是能在生物氧化過程清除自由基[1]，將超氧陰離子自由基（O2-）轉(zhuǎn)化為過氧化氫，可作為藥用酶[2]預防和治療由自由基引起的各類疾病。

超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化物酶和過氧化氫酶是生物細胞的保護系統(tǒng)[3]，超氧化物歧化酶主要作用是清除細胞中的超氧陰離子自由基，從而保護生物膜的生物大分子結(jié)構免受氧化損傷[4]。而谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化物酶（CAT）和過氧化物酶（POD）分別清除脂質(zhì)和細胞中的過氧化物和過氧化氫[5]。自19世紀以來，SOD的研究一直被國內(nèi)外醫(yī)學、化學、生物學、食品等領域的學者廣泛關注[6]。近年來，SOD在抗衰老、抗炎、抗癌等機理研究取得了長足進展。

SOD活性測定方法已較成熟，相關活性研究較多。劉銀萍[7]以牡丹品種“洛陽紅”為研究對象，研究其花發(fā)育8個時期花瓣的3種抗氧化酶SOD、POD和CAT活性變化，結(jié)果表明3種抗氧化酶通過協(xié)同作用快速清除機體內(nèi)產(chǎn)生的O2-，花瓣的衰老受多因素的共同影響，其中抗氧化酶的參與延緩了花瓣的衰老進程。潘百明等[8]采用鄰苯三酚自氧化法測定了紫茄子超氧化物歧化酶（SOD）活性，并對影響SOD活性的因素進行了研究，對不同Tris-HCl緩沖液pH、反應溫度、反應時間、不同丙酮比例進行初步探討。結(jié)果顯示，在25 ℃下丙酮比例1∶2，Tris-HCl緩沖液pH=8.2，反應時間20 min為最佳反應條件。隋英忠[9]研究分析復方樹莓提取液中過氧化物歧化酶活力，驗證其在生物體內(nèi)的抗氧化作用，為深入開發(fā)利用樹莓資源提供依據(jù)。黃嘌呤與黃嘌呤氧化酶反應體系產(chǎn)生超氧陰離子自由基，形成亞硝酸鹽，通過公式計算可求出被測樣品中的SOD活力，研究結(jié)果表明復方樹莓提取液在生物體內(nèi)具有一定的抗氧化作用。

目前，SOD的研究大多停留在金屬離子對SOD活性影響上，對其機理的研究多以金屬離子的摻入模式為主，而硒對植物種子生長的影響較少。本研究以綠豆為材料施以Na2SeO3浸泡及萌發(fā)處理不同時間，探索Na2SeO3對綠豆SOD的影響，以及Se、總SOD、CuZn-SOD活力之間的關系，為功能性富硒綠豆制品的研制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售綠豆，選顆粒飽滿，無蟲蛀者。

超氧化物歧化酶測試盒（南京建成生物工程研究所）、亞硒酸鈉（先導稀有金屬化工有限公司，分析純）、乙二胺四乙酸（EDTA，天津市福晨化學試劑廠，分析純）、硒粉（天津科密歐化學試劑開發(fā)中心，分析純）、鹽酸羥胺（天津市大茂化學試劑廠，分析純）、甲酚紅（天津市大茂化學試劑廠，優(yōu)級純）及聚乙烯吡咯烷酮K30（上海伯奧生物科技有限公司）。

1.2 儀器與設備

熒光分光光度計（上?，F(xiàn)科儀器有限公司，F(xiàn)950）、快速混勻器（蘇州威爾實驗用品有限公司，SK-1）、旋渦混合器（上海精科實業(yè)有限公司，XW-80A）、分光光度計（上海第三分析儀器廠，721-100）。

1.3 試劑的配制

0.2 mol·L-1EDTA：稱7.4 g EDTA二鈉鹽，蒸餾水加熱溶解，冷卻后用蒸餾水稀釋至100 mL；混合酸：硝酸∶過氯酸=2∶1；DAN：0.1% 2，3-二氨基萘（純度95%～98%）需在暗室配制，稱取200 mg DAN于一帶蓋三角瓶中，加入200 mL 0.1 mol·L-1鹽酸，振搖約15 min，使其全部溶解；約加40 mL環(huán)己烷，繼續(xù)振搖5 min，將此液轉(zhuǎn)入塞有玻璃棉（或脫脂棉）分液漏斗中，待溶液分層后，棄去環(huán)己烷層，收集DAN層溶液。

硒標準儲備液（100 μg·mL-1）：精確稱取100.0 mg元素硒（分析純），溶于少量硝酸中，加2 mL過氯酸（70%～72%），置沸水浴中加熱3～4 h，冷卻后加入8.4 mL濃鹽酸，再置沸水浴中煮2 min。準確稀釋至 1 000 mL，此儲備液硒含量為 100 μg·mL-1。

硒標準使用液（0.05 μg·mL-1）：將硒標準儲備液用 0.1 mol·L-1鹽酸稀釋，使含硒為 0.05 μg·mL-1。于冰箱中保存。

1.4 實驗方法

1.4.1 Na2SeO3溶液浸泡對綠豆SOD活性的影響

根據(jù)富硒綠豆方法，在35 ℃溫度下用濃度為30 μg·mL-1、3 倍于綠豆重量的 Na2SeO3水溶液分別處理綠豆1 h、2 h、3 h、4 h和5 h，測定總SOD活性、CuZn-SOD活性和蛋白含量以及總硒含量和無機硒含量[10]。

1.4.2 蒸餾水浸泡對綠豆SOD活性的影響

35 ℃溫度下用3倍于綠豆重量的蒸餾水分別處理綠豆1 h、2 h、3 h、4 h和5 h，測定總SOD活性、CuZn-SOD活性和蛋白含量以及總硒含量和無機硒含量，作為對照。

1.4.3 富硒綠豆萌發(fā)后SOD活性的變化

在 35 ℃下、用 3.0 μg·mL-1、3倍于綠豆重量的Na2SeO3水溶液處理5 h，洗凈、去除表面水分后繼續(xù)萌發(fā)2 h、4 h、6 h，測定總SOD活性、CuZn-SOD活性和蛋白含量以及總硒含量和無機硒含量。

1.4.4 正常生長的綠豆萌發(fā)后SOD的變化

在35 ℃下、用3倍于綠豆重量的蒸餾水處理5 h，洗凈、去除表面水分后繼續(xù)萌發(fā)2 h、4 h、6 h，測定總SOD活性、CuZn-SOD活性和蛋白含量以及總硒含量和無機硒含量，作為對照。

1.5 總SOD的提取和測定（SOD測試盒）

1.5.1 總SOD的提取

取處理好的樣品1.00 g于研缽中，加入pH=7.8的磷酸緩沖溶液9 mL，充分研磨，即制成10%的組織勻漿，將勻漿倒入離心管中，4 000 r·min-1離心15 min，所得上清液為SOD粗酶液。

1.5.2 總SOD活性的測定

將SOD粗酶液用生理鹽水稀釋10倍，依表1加入試劑，混勻，室溫放置10 min，與波長550 nm處，1 cm光徑比色杯，蒸餾水調(diào)零，比色?？係OD活力（U·mg-1）按式（1）計算。

表1 SOD測定操作表

1.6 CuZn-SOD的提取和測定（SOD測試盒）

（1）CuZn-SOD的提取。依照南京建成生物工程研究所研制的SDS+KCl抑制法測CuZn-SOD，粗酶液提取同總SOD的提取。

（2）CuZn-SOD的測定。測定步驟同總SOD測定。

（3）CuZn-SOD活性的計算。計算方法同總SOD。

1.7 硒含量的測定

1.7.1 樣品的處理

將樣品用蒸餾水洗凈，放入100 ℃烘箱中5 h，粉碎后4 ℃保存。

1.7.2 樣品的消化

稱取1.000 0 g樣品于磨口三角瓶內(nèi)，加10 mL 5%硫酸，樣品濕潤后，再加20 mL混合酸液放置過夜。次日于沙浴上逐漸加熱至淡黃色。

測定無機硒及有機硒含量時，稱取1.000 0 g樣品，加入用 4 mol·L-1HCl 30 mL后，170 ℃加熱、回流20 min，冷卻后用定量濾紙過濾雜質(zhì)。

1.7.3 樣品總硒含量的測定

將樣品消化液定容到100 mL容量瓶中，吸取10 mL于三角瓶中，加40 mL EDTA混合液，用氨水或鹽酸調(diào)至淡紅橙色（pH=1.5～2.0）。以下步驟在暗室進行：加6 mL DAN試劑，混勻，置沸水浴中煮7 min，取出后立即冷卻，加6 mL環(huán)己烷，振搖4 min，將全部溶液移入分液漏斗，待分層后棄去水層，環(huán)己烷層轉(zhuǎn)入裝有約1 g無水硫酸鈉的帶蓋試管中，于波長360 nm，發(fā)射光波長520 nm處測定苤硒腦的熒光強度。

1.7.4 硒標準曲線的繪制

準確吸取硒標準使用液（0.05 μg·mL-1）0 mL、0.4 mL、2.0 mL、4.0 mL及8.0 mL，相當于0.00 μg、0.02 μg、0.10 μg、0.20 μg、0.40 μg 硒，加水至 5 mL，按樣品測定步驟同時進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 硒標準曲線的繪制

本研究采用標準曲線法測定樣品的硒含量，因此，硒標準曲線的繪制及其線性相關性對于測定結(jié)果準確性影響較大。實驗結(jié)果（圖1）顯示，硒含量標準曲線為Y=125.34X+1.851 4，在0～0.4 μg范圍，樣品熒光強度與其硒含量之間具有良好的線性關系，相關系數(shù)R2=0.997 9。

圖1 硒標準曲線圖

2.2 綠豆對硒的吸收和轉(zhuǎn)化

由圖2可以看出，外源Se對綠豆中Se含量有顯著影響。隨著浸泡時間的增加，綠豆中總硒含量逐漸增加。從第3 h開始，綠豆中總硒含量明顯上升，當浸泡時間為5 h時，綠豆中Se含量達到12.20 μg·g-1，是對照0.70 μg·g-1的17倍，到了萌芽階段，有機硒占總硒的90%以上。

圖2 浸泡和萌芽過程中綠豆Se含量的變化圖

2.3 綠豆富硒過程中總SOD活性的變化

由圖3可見，隨著浸泡時間的增加，SOD的活性逐漸升高，但當浸泡時間達到3 h后，SOD的活性呈下降趨勢，綠豆中SOD的活性從279.785 U·mg-1降到129.621 U·mg-1，減少了53.7%。隨著浸泡時間的延長，內(nèi)源硒含量增加，SOD活性增加，過量的硒抑制了綠豆SOD的合成。

圖3 浸泡和萌芽過程中總SOD活性的變化圖

2.4 綠豆富硒過程中CuZn-SOD活性的變化

由4的結(jié)果可以看出，在綠豆富硒的過程中，CuZn-SOD活性的變化趨勢與總SOD的變化趨勢大致相同，都是隨著浸泡時間的增加，CuZn-SOD的活性逐漸升高，但當浸泡時間達到3 h后，CuZn-SOD的活性呈下降趨勢。

圖4 浸泡和萌芽過程中CuZn-SOD活性的變化圖

2.5 綠豆富硒過程中CuZn-SOD活性占總SOD活性的百分率

由圖5可知，CuZn-SOD活性均占總SOD活性60%以上，表明綠豆中SOD主要以CuZn-SOD為主。Na2SeO3浸泡后SOD活性上升，CuZn-SOD活性占總SOD活性比率下降，而在SOD活性下降階段，CuZn-SOD活性占總SOD活性比率上升，說明加硒處理對SOD活性增長和抑制作用主要表現(xiàn)在對Mn-SOD、Fe-SOD活性的作用。

圖5 浸泡和萌芽過程中CuZn-SOD活性占總SOD活性的百分率圖

3 結(jié)論

通過對綠豆富硒過程中的硒含量、SOD活性的研究，可以看出：①綠豆用Na2SeO3水溶液浸泡3 h，即硒含量為2.13 μg·g-1時能顯著提高綠豆SOD活性。②綠豆中SOD活性以CuZn-SOD為主，最高是達到總SOD的97.8%，最低時占69.1%。但硒處理對Mn-SOD、Fe-SOD活性無論是增長作用還是抑制作用，都比CuZn-SOD明顯。③含量過高的無機硒對SOD活性的抑制作用強于有機硒。SOD作為植物體內(nèi)普遍存在的一種專一清除生物氧化中產(chǎn)生超氧陰離子自由基的酶，誘導植物產(chǎn)生更多的SOD，可以用來分離純化，用于食品、藥物、化妝品等領域，仍然是今后的研究課題。