卵泡素樣3基因在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系

郭濤 辛振 王富豪

淮北礦工總醫(yī)院胃腸外科（安徽淮北 235000）

結(jié)腸癌是全球第三大常見(jiàn)癌癥［1-2］。雖然結(jié)腸癌的治療已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，但是結(jié)腸癌患者的高復(fù)發(fā)率仍然是臨床實(shí)踐中的主要問(wèn)題［3-4］。有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的方法有限，對(duì)于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者沒(méi)有令人滿(mǎn)意的治療方法。大量的研究對(duì)結(jié)腸癌復(fù)發(fā)的機(jī)制進(jìn)行了研究，這是解決臨床問(wèn)題的基石。

卵泡素樣3（FSTL3，也稱(chēng)FSRP 或FLRG）是FSTL 家族的成員。FSTL3 是一種新的細(xì)胞因子，可調(diào)節(jié)胰島素敏感性和抵消激活素或肌生成抑制素信號(hào)。最近的研究表明，F(xiàn)STL3 參與調(diào)節(jié)葡萄糖和脂肪穩(wěn)態(tài)、睪丸老化和睪丸大?。?］、骨骼重塑、骨關(guān)節(jié)炎、非小細(xì)胞肺癌［6］和其他生理過(guò)程或疾病。此外，還發(fā)現(xiàn)FSTL3 可以調(diào)節(jié)腫瘤的進(jìn)展，例如，F(xiàn)STL3 在侵襲性乳腺癌中過(guò)表達(dá)，通過(guò)拮抗內(nèi)源性激活物促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖［7］。然而，其在結(jié)腸癌中的表達(dá)和生物學(xué)功能尚不清楚。本研究前期通過(guò)分析TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中FSTL3 的結(jié)腸癌表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)FSTL3 是結(jié)腸癌的潛在治療基因和診斷靶點(diǎn)。進(jìn)一步通過(guò)臨床病例數(shù)據(jù)分析其表達(dá)及預(yù)后，并通過(guò)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證FSTL3 在結(jié)腸癌中起到重要的作用。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)分析本研究通過(guò)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)下載結(jié)腸癌COAD 項(xiàng)目中l(wèi)evel 3 HTSeq-FPKM 格式的RNAseq數(shù)據(jù)。將下載的521例結(jié)腸癌數(shù)據(jù)利用perl軟件和R 語(yǔ)言軟件整合，將患者按表達(dá)量中位數(shù)分為高表達(dá)組和低表達(dá)組進(jìn)行分析和繪圖，并利用數(shù)據(jù)進(jìn)行結(jié)腸癌預(yù)后比較及診斷ROC 曲線(xiàn)繪制。

1.2 一般資料選取淮北礦工總醫(yī)院自2015 年1月至2020 年12 月在外科手術(shù)的結(jié)腸癌組織蠟塊90 例及其配對(duì)的癌旁組織。所有患者術(shù)前均未接受化療、放療、內(nèi)分泌治療及靶向治療等輔助治療，并于術(shù)前均有明確診斷及術(shù)后再次診斷為結(jié)腸癌?；颊呔炇鹬橥鈺?shū)，研究方案經(jīng)蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和主要試劑結(jié)腸癌細(xì)胞SW620細(xì)胞購(gòu)自中科院細(xì)胞研究所。DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司，胎牛血清（FBS）購(gòu)自浙江天杭生物科技股份有限公司，F(xiàn)STL3 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及siRNA 由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)合成，Lipofectamin2000 于Thermo Scientific 公司購(gòu)買(mǎi)。一抗（FSTL3、GAPDH）均購(gòu)買(mǎi)于Abcam 公司，二抗購(gòu)于武漢三鷹生物科技有限公司，Western blot 試劑盒及BCA 蛋白濃度測(cè)量試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司，四甲基偶氮唑鹽（MTT）購(gòu)自Biofroxx 公司。Transwell 小室及六孔板購(gòu)自NEST 公司。

1.4 免疫組化檢測(cè)FSTL3 蛋白將結(jié)腸癌組織蠟塊90 例及其配對(duì)的癌旁組織，進(jìn)行切片制備、脫臘、復(fù)水后對(duì)組織進(jìn)行抗原修復(fù)，然后進(jìn)行免疫反應(yīng)，滴加一抗（1∶200），4 ℃冰箱孵育過(guò)夜。加二抗（1∶500），室溫孵育1 h。DAB 化學(xué)染色，蘇木素復(fù)染。酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片。

1.5 免疫組化結(jié)果判斷采用二次計(jì)分法：每例標(biāo)本隨機(jī)計(jì)數(shù)5 個(gè)高倍視野（× 400），計(jì)數(shù)每個(gè)高倍視野中陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比。陽(yáng)性染色結(jié)果判斷：胞漿中的染色面積和棕黃色顆粒決定。染色強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)如下［8］：以基本色度標(biāo)準(zhǔn)，0 分無(wú)色，1 分淡黃色，2 分棕黃色，3 分棕褐色。再將陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比計(jì)分，0 分為陰性，1 分為陽(yáng)性細(xì)胞＜10%，2分為11%～50%，3 分為51%～75%，4 分為＞75%。用染色強(qiáng)度得分和細(xì)胞數(shù)得分的乘積作為判斷表達(dá)結(jié)果，若積分0～4 分為陰性，4～12 分為陽(yáng)性。因此，本研究將LYAR 陰性表達(dá)患者歸為低表達(dá)組，陽(yáng)性表達(dá)歸為高表達(dá)組。免疫組化結(jié)果由兩名以上高年資病理醫(yī)師同時(shí)讀片評(píng)定。

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，于轉(zhuǎn)染前24 h將細(xì)胞以3.0 × 104個(gè)/孔接種于6 孔板；轉(zhuǎn)染時(shí)按照脂質(zhì)體Lipofectamine TM2000 轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)，SW620 細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，記作FSTL3、NC及小干擾RNA，記作si-FSTL3、si-NC（細(xì)胞轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照NC），轉(zhuǎn)染時(shí)加入相應(yīng)試劑并混合均勻，將細(xì)胞培養(yǎng)基換為無(wú)血清培養(yǎng)基，5% CO2、37 ℃條件培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h 后更換新鮮培養(yǎng)基，然后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組：NC 組、FSTL3 組、si-NC 組、si-FSTL3 組。siRNAi-FSTL3 序列為5′-GGAACAAGATCAACCTCCTCGGCTT-3′。

1.7 MTT 法檢測(cè)待檢測(cè)細(xì)胞用胰蛋白酶消化，以5×103個(gè)/mL 細(xì)胞懸液，每孔200 μL，加入96 孔板中，DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后，分別以24、48、72 h 加入MTT 溶液20 μL 混勻，繼續(xù)孵育4 h；每孔加DMSO 150 μL，培養(yǎng)30 min；酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處的吸光值（OD值），計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值）/對(duì)照組OD值×100%。

1.8 克隆形成實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染24 h 后收集細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后，將500 個(gè)細(xì)胞接種于6 孔板內(nèi)，在5%CO2、37 ℃條件培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 周后，棄去培養(yǎng)基，加入4%多聚甲醛，室溫固定20 min，結(jié)晶紫染色10 min 后，拍照。

1.9 Transwell 檢測(cè)細(xì)胞遷移能力無(wú)需鋪基質(zhì)膠外分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的si-NC 組、si-FSTL3 組、NC 組、FSTL3 組的SW620 細(xì)胞，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，消化離心后，用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸于小室中。于37 ℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)24 h；取出小室；PBS清洗2 次，4%多聚甲醛固定15 min，用結(jié)晶紫染液室溫下染色10 min；PBS 漂去多余染料，在200×視野下觀察透膜細(xì)胞數(shù)。計(jì)數(shù)并求平均值，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.10 Western Blot 檢測(cè)轉(zhuǎn)染48 h 的細(xì)胞加入預(yù)冷的RIPA 裂解液提取總蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度；加入蛋白上樣緩沖液，調(diào)整蛋白為相同濃度，95 ℃煮沸5 min 使蛋白變性；10%SDS-PAGE 電泳分離蛋白，分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂奶封閉2 h；一抗（FSTL3、GAPDH）按1∶1 000 稀釋?zhuān)? ℃搖床孵育過(guò)夜，二抗1∶5 000 稀釋?zhuān)瑩u床孵育2 h；ECL 發(fā)光試劑，暗室曝光拍照，以Image J 軟件分析目的蛋白，GAPDH 為內(nèi)參計(jì)算蛋白的灰度值，以其比值為蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間比較用配對(duì)t檢驗(yàn)，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，采用受試者工作曲線(xiàn)（ROC）比較診斷效能，單因素及多因素分析采用Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，生存分析采用Kaplan-Meier 法計(jì)算。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中FSTl3在結(jié)腸癌中的表達(dá)及預(yù)后情況在TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中，F(xiàn)STL3 基因在非配對(duì)組中，相比較于正常組織，在癌組織中的表達(dá)量明顯上升（圖1A）。在配對(duì)組中，相較于癌旁組織，癌組織中FSTL3 表達(dá)明顯較高（圖1B）。以FSTL3的表達(dá)量作為診斷結(jié)腸癌的指標(biāo)繪制ROC，曲線(xiàn)下面積0.776（95%CI：0.707～0.846）。以表達(dá)量2.186為診斷節(jié)點(diǎn)，靈敏度0.749，特異度0.683，約登指數(shù)1.432，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值0.965，陰性預(yù)測(cè)值0.189（圖1C）。對(duì)FSTL3 在結(jié)腸癌組織的表達(dá)進(jìn)行K-M 生存分析顯示，高表達(dá)組的生存率顯著低于低表達(dá)組（P＜0.008，圖1D）。

圖1 TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中FSTL3 在結(jié)腸癌中的表達(dá)及預(yù)后情況Fig.1 The expression and prognosis of FSTL3 in colon cancer in the TCGA database

2.2 FSTL3 蛋白表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理特征的相關(guān)性FSTL3在結(jié)腸癌中的表達(dá)與年齡（P=0.049）、TNM 分期（P=0.033）、浸潤(rùn)深度（P=0.06）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（P=0.001）有關(guān)，而與性別（P=0.386）、淋巴轉(zhuǎn)移（P=0.215）、分化程度（P=0.565）無(wú)關(guān)。見(jiàn)表1。

表1 FSTL3 表達(dá)與患者臨床病理因素的關(guān)系Tab.1 Relationship between FSTL3 expression and clinicopathological factors in patients例

2.3 免疫組化檢測(cè)FSTL3 蛋白表達(dá)在90 例結(jié)腸癌組織蠟塊和與其相匹配的癌旁正常組織中，F(xiàn)STL3 蛋白在癌組織中陽(yáng)性表達(dá)明顯高于癌旁正常組織（P＜0.001），見(jiàn)表2。FSTL3 陽(yáng)性反應(yīng)物定位于細(xì)胞胞漿中，見(jiàn)圖2。

圖2 免疫組化檢測(cè)FSTL3 蛋白在結(jié)腸癌組織的表達(dá)（×200）Fig.2 The expression of FSTL3 protein in Colon cancer tissues was detected by immunohistochemistry（×200）

2.4 FSTL3 蛋白達(dá)與結(jié)腸癌患者預(yù)后的關(guān)系本課題組收集90 例患者資料，隨訪時(shí)間60 個(gè)月，死亡66 例，總體生存率26.7%。對(duì)FSTL3 表達(dá)情況進(jìn)行K-M 分析，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織中，F(xiàn)STL3 高表達(dá)患者生存率顯著低于低表達(dá)患者。見(jiàn)圖3。

圖3 結(jié)腸癌患者FSTL3 高表達(dá)組與FSTL3 低表達(dá)組5 年生存率比較Fig.3 The 5 years survival rate in the FSTL3 overexpression group was significantly lower than that in the FSTL3 low expression group

2.5 結(jié)腸癌預(yù)后單因素及多因素分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析預(yù)后，單因素結(jié)果顯示，F(xiàn)STL3高表達(dá)，年齡，浸潤(rùn)深度，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是結(jié)腸癌的預(yù)后因素。多因素結(jié)果分析顯示，F(xiàn)STL3 過(guò)表達(dá)、浸潤(rùn)深度是結(jié)腸癌的預(yù)后因素。見(jiàn)表2。

表2 FSTL3 表達(dá)以及臨床特征對(duì)結(jié)腸癌患者生存率的影響Tab.2 The effect of FSTL3 expression and clinical characteristics on the survival rate of colon cancer patients

2.6 FSTL3沉默后的表達(dá)水平Western Blot 檢測(cè)顯示，與si-NC 組比較，si-FSTL3 組SW620 細(xì)胞中FSTL3 的蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖4A。與NC 組比較，F(xiàn)STL3 組SW620 細(xì)胞中FSTL3的蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)圖4B。

圖4 轉(zhuǎn)染48 h 后結(jié)腸癌細(xì)胞SW620 中的FSTL3 表達(dá)水平Fig.4 The expression level of FSTL3 in colon cancer cell SW620 48 h after transfection

2.7 FSTL3 基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顯示，轉(zhuǎn)染si-FSTL3 后的SW620 細(xì)胞形成的細(xì)胞集落數(shù)目少于對(duì)照組（P＜0.05）。同樣的，過(guò)表達(dá)FSTL3 后，F(xiàn)STL3 組SW620 細(xì)胞形成的細(xì)胞集落數(shù)目明顯多于NC 組（P＜0.05），見(jiàn)圖5A。MTT 檢測(cè)顯示，與si-NC 組比較，si-FSTL3組結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620 細(xì)胞24、48、72 h 增殖率顯著下降（P＜0.05）。同樣的，MTT 檢測(cè)顯示，與NC組比較，F(xiàn)STL3 組SW620 細(xì)胞24、48、72 h 增殖率顯著上升（P＜0.05），見(jiàn)圖5B。

圖5 FSTL3 對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響Fig.5 The effect of FSTL3 on the proliferation of colon cancercells

2.8 FSTL3 基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞遷移的影響Transwell 實(shí)驗(yàn)顯示，與si-NC 組比較，si-FSTL3 組結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620 細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)目顯著降低（P＜0.05）。過(guò)表達(dá)FSTL3后，與NC組比較，F(xiàn)STL3組SW620 細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)目顯著增高（P＜0.05），見(jiàn)圖6。

圖6 FSTL3 對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移的影響Fig.6 The effect of FSTL3 on the migration of colon cancer cells

3 討論

結(jié)腸癌是最常見(jiàn)的消化道癌癥之一，死亡率較高，給全球帶來(lái)了巨大的健康負(fù)擔(dān)。然而，結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。研究表明，越來(lái)越多的分子被發(fā)現(xiàn)參與了該疾病的發(fā)生發(fā)展。既往研究發(fā)現(xiàn)FSTL 家族成員在腫瘤中表達(dá)異常，并參與腫瘤發(fā)生和進(jìn)展［9-11］。如FSTL1 在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)可顯著抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［12］；而FSTL1 在肝癌中表達(dá)上調(diào)，下調(diào)其表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖［13］。有研究報(bào)道FSTL5 在肝細(xì)胞癌中表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)可抑制癌細(xì)胞存活［14］。FSTL3 作為FSTL 家族的一員，在腫瘤中也存在異常表達(dá)的物質(zhì)。例如，F(xiàn)STL3 可以作為乳腺癌和肝細(xì)胞癌的癌癥生物標(biāo)志物。FSTL3 在乳腺癌中表達(dá)上調(diào)，過(guò)表達(dá)可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生進(jìn)展。這些結(jié)果表明，F(xiàn)STL3 作為一種致癌基因參與了癌癥的發(fā)生發(fā)展。

本研究中，首先通過(guò)分析TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中的結(jié)腸癌數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)FSTL3 不論是在配對(duì)樣本還是非配對(duì)樣本中，表達(dá)水平都明顯上升。以FSTL3 的表達(dá)量作為診斷結(jié)腸癌的指標(biāo)繪制ROC，曲線(xiàn)下面積為0.776，以FSTL3 作為診斷結(jié)腸癌的指標(biāo)，具有一定的準(zhǔn)確性。并且FSTL3 高表達(dá)患者生存率明顯低于FSTL3 低表達(dá)患者，這提示FSTL3 可能是結(jié)腸癌的生物學(xué)標(biāo)志物。隨后，收集了90 例結(jié)腸癌病例，通過(guò)免疫組化檢測(cè)了FSTL3 在結(jié)腸癌中的表達(dá)水平，驗(yàn)證了TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)的結(jié)果。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)FSTL3 在結(jié)腸癌中的表達(dá)與年齡（P=0.049）、TNM 分期（P=0.033）、浸潤(rùn)深度（P=0.06）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（P=0.001）有關(guān)，而與性別（P=0.386）、淋巴轉(zhuǎn)移（P=0.215）、分化程度（P=0.565）無(wú)關(guān)。通過(guò)單因素分析顯示，F(xiàn)STL3 高表達(dá)、年齡、浸潤(rùn)深度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是結(jié)腸癌的預(yù)后因素。多因素結(jié)果分析顯示，F(xiàn)STL3 過(guò)表達(dá)、浸潤(rùn)深度是結(jié)腸癌的預(yù)后因素。此外，通過(guò)轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞SW620 細(xì)胞株，得到FSTL3 過(guò)表達(dá)及沉默細(xì)胞株。通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)及MTT 實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)FSTL3 相比與對(duì)照組，明顯促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖。相反，敲低FSTL3 表達(dá)，結(jié)腸癌細(xì)胞增殖受到明顯抑制。通過(guò)Transwell 實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)FSTL3，結(jié)腸癌細(xì)胞遷移明顯增長(zhǎng)。相反，敲低FSTL3，結(jié)腸癌細(xì)胞遷移明顯受到抑制。這些結(jié)果都提示FSTL3 可能是一種原癌基因。相較于在前期的研究報(bào)道中FSTL3 在非小細(xì)胞肺癌及肝癌中，表達(dá)異常，本課題組首次發(fā)現(xiàn)FSTL3 在結(jié)腸癌中表達(dá)上調(diào)，F(xiàn)STL3 的表達(dá)量與患者的生存時(shí)間有關(guān)。同時(shí)，進(jìn)一步進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)調(diào)控FSTL3 的表達(dá)量，可以調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移。這些發(fā)現(xiàn)為結(jié)腸癌的治療提供了新的靶基因。因此可以判斷，檢測(cè)結(jié)腸癌組織中FSTL3 蛋白量有助于判斷腫瘤的惡性程度和進(jìn)展?fàn)顟B(tài)。然而，本研究沒(méi)有對(duì)FSTL3 在結(jié)腸癌中的分子機(jī)制進(jìn)行深入研究。下一步將深入研究FSTL3 在結(jié)腸癌中作用機(jī)制。

綜上所述，F(xiàn)STL3 在結(jié)腸癌組織中高度表達(dá)，并且FSTL3 在結(jié)腸癌的預(yù)后和進(jìn)展中具有重要意義。此外，敲低其表達(dá)可以明顯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移，而過(guò)表達(dá)FSTL3 則有促癌作用。FSTL3 作為一種致癌基因參與了結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展。