• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    ETAR-C58 多肽生物合成及其對(duì)黑色素瘤A375細(xì)胞遷移和侵襲的影響

    2021-12-28 04:47:26張飛飛張夢(mèng)王中山
    實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志 2021年22期
    關(guān)鍵詞:內(nèi)皮素黑色素瘤多肽

    張飛飛 張夢(mèng) 王中山

    1徐州醫(yī)科大學(xué)麻醉學(xué)院,江蘇省麻醉學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江蘇徐州 221004);2徐州市中心醫(yī)院,東南大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科(江蘇徐州 221009)

    內(nèi)皮素(endothelin,ET)主要包括三種同分異構(gòu)體亞型,分別是ET-1、ET-2、ET-3,皮膚中主要表達(dá)ET-1[1]。內(nèi)皮素通過(guò)特異性結(jié)合其受體(ETR)而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng),其受體分為兩種亞型即內(nèi)皮素A 受體(ETAR)和內(nèi)皮素B 受體(ETBR),兩者都是G 蛋白偶聯(lián)受體。ET 和ETR 構(gòu)成的內(nèi)皮素軸在多種腫瘤包括黑色素瘤中有促進(jìn)腫瘤的作用[2-4]。

    黑色素瘤是一種惡性程度較高的皮膚腫瘤[5],具有發(fā)病年齡早、轉(zhuǎn)移率高、臨床預(yù)后差等特點(diǎn)[6-7],對(duì)各種化療藥物敏感性低且易產(chǎn)生耐藥。隨著惡性黑色素瘤的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈上升的趨勢(shì)[8],迫切需要更有效的治療方法。

    研究表明[9-12],與良性痣相比,ETBR 在黑色素瘤中的表達(dá)增加,ETBR 的激活與黑色素瘤的侵襲密切相關(guān),對(duì)其進(jìn)行阻斷可達(dá)到一定的治療效果[9,13]。另外β-arrestin1 作為支架蛋白通過(guò)ETR 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在腫瘤發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移等過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[14-16]。ET-1 激活ETR 后,吸引β-arrestin1到細(xì)胞膜聚集,而β-arrestin1 和ETR 之間的相互作用是通過(guò)ETR 的羧基末端識(shí)別介導(dǎo)的[17]。選擇性干擾ETBR 和β-arrestin1 的相互作用,就可能阻止β-arrestin1 介導(dǎo)的信號(hào)通路。因此,研究和開(kāi)發(fā)阻斷ETBR 和β-arrestin1 相互作用的藥物,很有可能具有良好的抗黑色素瘤作用。

    在諸多抗腫瘤藥物中,多肽類(lèi)藥物因其相對(duì)分子質(zhì)量小、無(wú)免疫原性、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、副作用小等優(yōu)點(diǎn)越來(lái)越受到人們的重視,尤其是來(lái)源于人類(lèi)自身蛋白的多肽。常規(guī)地采用化學(xué)合成法獲得多肽不僅成本較貴,而且合成過(guò)程中可能引入一定的毒性,限制了臨床應(yīng)用范圍。而大腸桿菌表達(dá)體系具有蛋白表達(dá)量高、易操作、培養(yǎng)成本低等優(yōu)勢(shì),而且純化的重組蛋白可以大規(guī)模生產(chǎn),為進(jìn)一步研究目的蛋白的生物活性奠定了良好的基礎(chǔ)。

    基于此,本研究擬在體外通過(guò)大腸桿菌表達(dá)體系表達(dá)純化獲得ETAR 羧基末端58 個(gè)氨基酸的多肽(ETAR-C58)。在黑色素瘤細(xì)胞中,該多肽很有可能和ETBR 競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合β-arrestin1,從而干擾了ET-1/ETBR/β-arrestin1 信號(hào)通路的傳導(dǎo),進(jìn)而抑制了黑色素瘤的發(fā)展。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該多肽緩解了β-arrestin1介導(dǎo)的癌細(xì)胞遷移,侵襲等功能,為進(jìn)一步開(kāi)展對(duì)惡性黑色素瘤的科學(xué)研究和臨床應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料人源性惡性黑色素瘤A375 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù);大腸桿菌克隆宿主菌DH5α、表達(dá)宿主菌BL21(DE3)和表達(dá)質(zhì)粒pWaldo-GFPe 均為本實(shí)驗(yàn)室保存;限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA 連接酶購(gòu)自NEB;Trizol、逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA 聚合酶購(gòu)自南京諾唯贊;ET-1 購(gòu)自北京博奧森;DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自南京凱基;胎牛血清FBS 購(gòu)自L(fǎng)onsera;胰蛋白酶(0.25% Trypsin-EDTA)購(gòu)自Gibco;MatriGel 購(gòu)自BD;8 微米孔徑Transwell 24 孔板購(gòu)自CELLTER;鎳柱和分子篩購(gòu)自GE 公司;GFP 標(biāo)簽抗體和HRP 標(biāo)記的羊抗鼠二抗均購(gòu)自ABclonal;PCR 引物合成及測(cè)序由上海生工完成;FX101 細(xì)胞破碎儀(上海勵(lì)途公司);蛋白純化系統(tǒng)AKTA Pure(GE 公司);全能型成像系統(tǒng)(UVItech);研究級(jí)倒置顯微鏡(OLYMPUS 公司);Nanodrop 2000、酶標(biāo)儀、細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo 公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 ETAR-C58多肽基因的克隆提取人結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞的總RNA,根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄酶的使用說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),以獲得的cDNA 為模板,ETARC58F1:5′-CCATCTCGAGATGTACGGTCGTAAAAAACGTCGTCAGCGTCGTCGTTATTTTGTGAGCAAGAAATTTAAAA-3′(下劃線(xiàn)處為XhoI 酶切位點(diǎn),加粗部分為T(mén)AT 穿膜肽序列)和ETAR-C58R1:5′-CGTCGGATCCGTTCATGCTGTCCTTATGGCT-3′(下劃線(xiàn)處為BamHI 酶切位點(diǎn))為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,純化后的PCR 產(chǎn)物經(jīng)XhoI 和BamHI 酶切后克隆至pWaldo-GFPe 的相同位點(diǎn),經(jīng)酶切和測(cè)序驗(yàn)證后,獲得重組質(zhì)粒pWaldo-ETAR-C58。

    1.2.2 ETAR-C58多肽的誘導(dǎo)表達(dá)與純化將轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒的BL21(DE3)表達(dá)菌株接種于200 mL含30 μg/mL 卡納青霉素的LB 培養(yǎng)基中,37 ℃過(guò)夜培養(yǎng),然后轉(zhuǎn)接50 mL 菌液至1 000 mL LB 培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)至OD600約為0.6,加入0.2 mmol/L 的IPTG,20 ℃誘導(dǎo)表達(dá)20 h 后,6 000 g 離心15 min收集菌體,并用80 mL 裂解緩沖液懸?。?0 mmol/L Tris-HCl pH8.0,300 mmol/L NaCl),加入50 μg/mL溶菌酶、200 U DNAase I 和1 mmol/L PMSF 后,采用細(xì)胞破碎儀800 MPa 破碎細(xì)胞兩次,4 ℃、8 000 r/min離心30 min去除細(xì)胞碎片。取上清液自然流過(guò)鎳柱,用100 mL 洗滌緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl pH8.0,300 mmol/L NaCl,10%甘油和30 mmol/L咪唑)沖洗柱子,用含高濃度咪唑的洗脫緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl pH 7.5,300 mmol/L NaCl,10%甘油和300 mmol/L咪唑)洗脫目的蛋白質(zhì),收集蛋白質(zhì)樣品,過(guò)分子篩柱子(緩沖液含20 mmol/L Tris-HCl pH 7.5,300 mmol/L NaCl,10%甘油),收集有吸收峰的蛋白質(zhì)樣品,SDSPAGE 檢測(cè)樣品的純度,采用Nanodrop 2 000 測(cè)定多肽濃度。

    1.2.3 免疫印跡鑒定誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白通過(guò)SDS-PAGE 分離后,通過(guò)濕轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,隨后將膜用含有5%脫脂奶粉的TBST 室溫孵育2 h,加GFP 標(biāo)簽抗體(1∶1 000)于4 ℃孵育過(guò)夜,隨后TBST 洗膜3 × 3 min,加入HRP 標(biāo)記的羊抗鼠二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h,TBST 再次洗膜6 × 3 min,加入ECL 發(fā)光液,用UVI-tech 的全能型成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

    1.2.4 A375 細(xì)胞處理及分組干預(yù)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于3.5 cm 培養(yǎng)皿中,在10%FBS+高糖DMEM、37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng),待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合率接近80%~90%時(shí),進(jìn)行無(wú)血清化處理12 h,胰蛋白酶消化后,用血球板計(jì)數(shù)(為保障數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性,重復(fù)計(jì)數(shù)3 次并取其平均值),按如下分組加入等數(shù)量的細(xì)胞:對(duì)照組,ET-1 組(10 nmol/L),ET-1 組+ETAR-C58 多肽(2 μmol/L)組,其中ETARC58 多肽在ET-1 干預(yù)前1 h 加入,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,然后進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)的檢測(cè)。

    1.2.5 TAT-ETAR-C58 融合多肽穿膜進(jìn)入細(xì)胞的效率當(dāng)接種于3.5 cm 培養(yǎng)皿的A375 細(xì)胞融合率接近80%~90%時(shí),加入2 μmol/L 純化的多肽,并于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育6 h,PBS 洗滌后更換新鮮的完全培養(yǎng)基,過(guò)夜培養(yǎng),通過(guò)熒光顯微鏡觀(guān)察TATETAR-C58 融合多肽穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞的效率。

    1.2.6 A375 細(xì)胞的遷移根據(jù)1.2.4 所述進(jìn)行細(xì)胞的處理后,向24 孔板Transwell 上室加入用無(wú)血清DMEM 懸浮的細(xì)胞懸浮液2 × 104個(gè)細(xì)胞,用DMEM 補(bǔ)充至200 μL,下室加600 μL 含10%FBS的培養(yǎng)基。24 h 后移除上、下室的液體,下室加入600 μL 4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞20 min。移除多聚甲醛,PBS 洗滌后,下室加入600 μL 0.5%結(jié)晶紫(PBS 配制)染色15 min。再用PBS 洗滌3 次,用棉棒將上室內(nèi)壁和外壁殘留的結(jié)晶紫擦除,切勿碰到膜的表面。將洗滌好的上室轉(zhuǎn)移到新的24孔里,在顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞并拍照。最后用20%乙酸進(jìn)行洗脫,酶標(biāo)儀OD600檢測(cè)。

    1.2.7 A375 細(xì)胞的侵襲用無(wú)血清的冷DMEM 按照1∶7 稀釋Matrigel,取50 μL Matrigel 稀釋液加到24 孔板Transwell 上室中,37 ℃培養(yǎng)箱里風(fēng)干0.5 h。根據(jù)1.2.4 所述進(jìn)行細(xì)胞的處理后,向24 孔板Transwell 上室加入用無(wú)血清DMEM 懸浮的細(xì)胞懸浮液5×104個(gè)細(xì)胞,用DMEM 補(bǔ)充至200 μL,下室加600 μL 含10%FBS 的培養(yǎng)基,接下來(lái)的步驟和遷移實(shí)驗(yàn)相同。

    1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)以()形式表示,采用Graphpad Prism 軟件進(jìn)行分析處理,兩組間比較采用t檢驗(yàn),P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 ETAR-C58 多肽基因的克隆按照1.2.1 所述的克隆步驟,通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶XhoI 和BamHI 鑒定獲得重組子pWaldo-ETAR-C58,并送往上海生工公司測(cè)序。峰圖整齊有序,ETAR-C58 多肽序列正確,共174 bp,編碼形成6.8 kDa 的多肽,和TAT 穿膜肽(1.6 kDa)、GFP 標(biāo)簽(26 kDa)、TEV 酶切位點(diǎn)(0.9 kDa)融合后其相對(duì)分子質(zhì)量約為35.3 kDa。見(jiàn)圖1。

    圖1 ETAR-C58 多肽表達(dá)載體測(cè)序峰圖Fig.1 Sequencing of ETAR-C58 peptide expression vector

    2.2 ETAR-C58 多肽的誘導(dǎo)表達(dá)、純化與鑒定將pWaldo-ETAR-C58 轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3),經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)和SDS-PAGE 分析,融合蛋白得到很好的表達(dá),大小與預(yù)期完全一致,且可溶性融合多肽的表達(dá)量約為總蛋白的90%。融合多肽經(jīng)鎳柱和分子篩純化后,SDS-PAGE 檢測(cè)純度較高(>95%),見(jiàn)圖2A。免疫印跡結(jié)果表明,融合多肽可與GFP 抗體發(fā)生特異性結(jié)合,在相應(yīng)位置有明顯的條帶,說(shuō)明純化獲得的融合蛋白就是需要的目的多肽,見(jiàn)圖2B。

    圖2 融合多肽TAT-ETAR-C58 的表達(dá)純化及免疫印跡分析Fig.2 Expression,purification and western blotting analysis of fusion peptide

    2.3 TAT-ETAR-C58融合多肽穿膜進(jìn)入細(xì)胞的效率TAT 穿膜肽可以作為載體攜帶多肽或蛋白質(zhì)片段,以非受體依賴(lài)的方式穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞。為了檢測(cè)TAT-ETAR-C58融合蛋白穿膜進(jìn)入細(xì)胞的效率,2 μmol/L 多肽和A375 細(xì)胞孵育6 h,顯微鏡整個(gè)視野下幾乎所有的細(xì)胞均呈綠色,即TAT穿膜肽介導(dǎo)的融合蛋白進(jìn)入細(xì)胞的效率較高。見(jiàn)圖3。

    圖3 顯微鏡觀(guān)察TAT-ETAR-C58 融合多肽的穿膜效率Fig.3 Transmembrane efficiency of fusion peptide identified by microscope

    2.4 ETAR-C58 多肽對(duì)A375 細(xì)胞遷移和侵襲的影響根據(jù)1.2.4 所述的方法將處理的A375 細(xì)胞分為三組:對(duì)照組(Control)、ET-1 組、ET-1+ETARC58 多肽組,ET-1 組中添加10 nmol/LET-1,可以激活黑色素瘤細(xì)胞里ET-1/ETBR 組成的內(nèi)皮素信號(hào)軸,ET-1+ETAR-C58 多肽組中提前添加2 μmol/L多肽,以期多肽干擾ET-1/ETBR/β-arrestin1 組成的信號(hào)通路,從而阻斷ET-1 所引起的細(xì)胞效應(yīng)。然后按照1.2.6 和1.2.7 所述的方法進(jìn)行Transwell 遷移和侵襲實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明ET-1 組較對(duì)照組,轉(zhuǎn)移和侵襲的細(xì)胞數(shù)明顯增加,這與已報(bào)道文獻(xiàn)的結(jié)果一致[18];ET-1+ETAR-C58 多肽組可以部分阻斷ET-1 組引起的細(xì)胞遷移和侵襲效應(yīng),即ETAR-C58多肽可以降低A375 細(xì)胞的遷移和侵襲能力,組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

    圖4 ET-1 和ETAR-C58 多肽對(duì)A375 細(xì)胞遷移與侵襲能力的影響Fig.4 The effects of ET-1 and ETAR-C58 peptide on migration and invasion of A375 cells by Transwell

    3 討論

    TAT 穿膜肽是人類(lèi)免疫缺陷病毒1(HIV-1)來(lái)源的參與病毒復(fù)制的反式轉(zhuǎn)錄激活蛋白,作為經(jīng)典的細(xì)胞穿膜肽被廣泛用于各種物質(zhì)的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)[19-21]。本研究結(jié)果表明大多數(shù)細(xì)胞都具有綠色熒光,即大多數(shù)TAT-ETAR-C58-GFP 融合蛋白可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)功能,說(shuō)明TAT 穿膜肽作為一種藥物運(yùn)輸載體具有較大的潛力。

    為了提高目的融合肽的表達(dá)量和克服小肽易被蛋白酶所降解的缺點(diǎn),本研究選擇以綠色熒光蛋白(GFP)作為融合標(biāo)簽,另外GFP 作為一種可以發(fā)出很強(qiáng)熒光的蛋白分子,可以很好地定位和追蹤目的蛋白。為了防止GFP 標(biāo)簽影響多肽的活性,本研究在多肽和GFP 之間添加了TEV 蛋白酶的酶切位點(diǎn),方便下一步獲得沒(méi)有標(biāo)簽的多肽。β-arrestin1 可作為GPCRs 信號(hào)的轉(zhuǎn)換器,參與多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑,引起細(xì)胞增殖、凋亡、組織的炎癥反應(yīng)及血管新生等生物學(xué)效應(yīng)[22-23]。上述生物學(xué)效應(yīng)與多種腫瘤的增殖、遷移、惡化、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。β-arrestin1 作為癌癥發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵分子,靶向β-arrestin1 的藥物研究將蘊(yùn)含巨大的臨床治療潛力。有研究表明[18],ET-1/ETBR/β-arrestin1 信號(hào)軸參與調(diào)節(jié)了黑色素瘤細(xì)胞的遷移和血管生成擬態(tài)。ZHANG 等[24]發(fā)現(xiàn)在黑色素瘤中主要表達(dá)截短的ETAR(缺少了外顯子3 和4),而且該ETAR對(duì)ET-1 的親和力較低。所以在黑色素瘤細(xì)胞中,主要是ET-1 和ETBR 組成的內(nèi)皮素軸發(fā)揮作用,而且β-arrestin1 可以和ETR 羧基末端結(jié)合進(jìn)而介導(dǎo)了信號(hào)通路的傳導(dǎo)[17],根據(jù)這些特點(diǎn),本研究創(chuàng)新性設(shè)計(jì)的ETAR-C58 多肽,可能通過(guò)干擾ETBR和β-arrestin1 之間的相互作用,進(jìn)而影響了該信號(hào)通路的傳導(dǎo),而實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,ETAR-C58 多肽抑制了A375 細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。說(shuō)明ETAR-C58 多肽可以干擾β-arrestin1 和ETBR 兩者的相互作用,進(jìn)而抑制腫瘤的發(fā)展。

    本研究目前只是在體外水平,初步驗(yàn)證了ETAR-C58 多肽具有抗腫瘤的作用,下一步將采用TEV 酶切掉GFP 標(biāo)簽后,獲得分子量更小的活性ETAR-C58 小肽,通過(guò)進(jìn)行小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步驗(yàn)證其抗腫瘤活性,并對(duì)其作用機(jī)制做進(jìn)一步研究,以期開(kāi)發(fā)出一種新型、高效、低毒,具有良好臨床應(yīng)用前景的治療黑色素瘤的藥物。

    猜你喜歡
    內(nèi)皮素黑色素瘤多肽
    高多肽含量苦瓜新品種“多肽3號(hào)”的選育
    內(nèi)皮素-1對(duì)牙周膜細(xì)胞腫瘤壞死因子及白介素-1β表達(dá)的影響
    原發(fā)性食管惡性黑色素瘤1例并文獻(xiàn)復(fù)習(xí)
    抗HPV18 E6多肽單克隆抗體的制備及鑒定
    顱內(nèi)黑色素瘤的研究進(jìn)展
    左拇指巨大黑色素瘤1例
    胎盤(pán)多肽超劑量應(yīng)用致嚴(yán)重不良事件1例
    徐寒梅:創(chuàng)新多肽藥物研究與開(kāi)發(fā)
    和肽素與大內(nèi)皮素-1及N末端腦鈉肽對(duì)心力衰竭的預(yù)后價(jià)值
    糖脈康顆粒治療2型糖尿病的療效觀(guān)察及其對(duì)血管內(nèi)皮素-1的影響
    中成藥(2014年11期)2014-02-28 22:30:12
    欧美黄色淫秽网站| 日韩电影二区| 久久人妻熟女aⅴ| 久9热在线精品视频| 午夜久久久在线观看| 午夜福利影视在线免费观看| 成人av一区二区三区在线看 | 夜夜夜夜夜久久久久| 色视频在线一区二区三区| 久久国产精品影院| 日韩精品免费视频一区二区三区| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 国产av又大| 国产精品免费大片| 欧美精品亚洲一区二区| 日韩精品免费视频一区二区三区| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 亚洲av男天堂| 飞空精品影院首页| 国产不卡av网站在线观看| 99国产精品一区二区蜜桃av | 欧美成狂野欧美在线观看| av又黄又爽大尺度在线免费看| 黄色怎么调成土黄色| 动漫黄色视频在线观看| 不卡一级毛片| 啦啦啦 在线观看视频| 嫁个100分男人电影在线观看| 午夜成年电影在线免费观看| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 久久久国产欧美日韩av| 成在线人永久免费视频| 两人在一起打扑克的视频| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 欧美激情 高清一区二区三区| a级毛片在线看网站| 大片电影免费在线观看免费| 一本大道久久a久久精品| 久久精品国产a三级三级三级| 国产在线免费精品| 国产欧美日韩一区二区精品| 久久综合国产亚洲精品| 久久久久久久大尺度免费视频| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲精品国产色婷婷电影| 欧美日韩精品网址| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 桃花免费在线播放| 老司机影院成人| tube8黄色片| 精品国产乱码久久久久久男人| 极品人妻少妇av视频| 国产成人精品久久二区二区免费| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 老汉色av国产亚洲站长工具| 制服诱惑二区| 99久久综合免费| www.自偷自拍.com| 国产av精品麻豆| 日本vs欧美在线观看视频| 99九九在线精品视频| 国产精品影院久久| 亚洲欧美精品自产自拍| 人妻久久中文字幕网| 五月天丁香电影| 啦啦啦免费观看视频1| 性色av乱码一区二区三区2| 十分钟在线观看高清视频www| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 久久久国产欧美日韩av| 色精品久久人妻99蜜桃| 日韩中文字幕视频在线看片| 搡老乐熟女国产| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 老司机靠b影院| 黄片小视频在线播放| 亚洲五月婷婷丁香| 国产成人a∨麻豆精品| www.自偷自拍.com| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 在线av久久热| 亚洲国产精品成人久久小说| 成年动漫av网址| 美女大奶头黄色视频| √禁漫天堂资源中文www| 欧美日韩精品网址| 亚洲精品美女久久av网站| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 久久久久久久精品精品| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 色综合欧美亚洲国产小说| 9热在线视频观看99| 久久久精品免费免费高清| 最新的欧美精品一区二区| 青春草亚洲视频在线观看| 热re99久久精品国产66热6| 久久久久精品人妻al黑| 99热国产这里只有精品6| 中文字幕高清在线视频| 久久狼人影院| 成年人黄色毛片网站| 一级毛片女人18水好多| 亚洲成人免费av在线播放| 性色av乱码一区二区三区2| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 久热爱精品视频在线9| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 丁香六月天网| 午夜福利在线观看吧| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 激情视频va一区二区三区| 精品少妇黑人巨大在线播放| 精品国产乱码久久久久久小说| 精品少妇内射三级| 巨乳人妻的诱惑在线观看| av网站免费在线观看视频| 国产人伦9x9x在线观看| 国产精品影院久久| 久久免费观看电影| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 嫩草影视91久久| 久久中文字幕一级| 亚洲国产精品一区三区| 欧美+亚洲+日韩+国产| 免费观看人在逋| 国产男女内射视频| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 亚洲精品粉嫩美女一区| av网站在线播放免费| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 啦啦啦 在线观看视频| 女人精品久久久久毛片| 一边摸一边做爽爽视频免费| 亚洲国产日韩一区二区| 大片电影免费在线观看免费| 国产亚洲一区二区精品| 国产av精品麻豆| 欧美中文综合在线视频| 国产精品久久久久久精品古装| 国产三级黄色录像| 亚洲欧洲日产国产| 男人舔女人的私密视频| 久久久久久久久久久久大奶| 青青草视频在线视频观看| 亚洲精品国产av蜜桃| 久久中文字幕一级| 男女高潮啪啪啪动态图| 久久久久久人人人人人| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 两个人看的免费小视频| 亚洲欧美色中文字幕在线| av超薄肉色丝袜交足视频| 黄片播放在线免费| 亚洲欧美色中文字幕在线| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 国产成人免费无遮挡视频| 91成人精品电影| 亚洲av欧美aⅴ国产| 91老司机精品| 国产人伦9x9x在线观看| 日韩欧美国产一区二区入口| 丝袜美腿诱惑在线| 淫妇啪啪啪对白视频 | 波多野结衣一区麻豆| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 午夜免费观看性视频| 成年人黄色毛片网站| 咕卡用的链子| 欧美变态另类bdsm刘玥| 视频区图区小说| 国产精品熟女久久久久浪| 亚洲视频免费观看视频| 女人精品久久久久毛片| 麻豆乱淫一区二区| 精品国产乱码久久久久久男人| 精品一区在线观看国产| videos熟女内射| 国产精品 国内视频| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 少妇精品久久久久久久| 美女主播在线视频| 97精品久久久久久久久久精品| 黄色视频不卡| 久久ye,这里只有精品| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 高清黄色对白视频在线免费看| 黄片播放在线免费| 久久亚洲精品不卡| 99久久精品国产亚洲精品| a 毛片基地| 捣出白浆h1v1| 欧美国产精品一级二级三级| 嫩草影视91久久| 男女边摸边吃奶| 国产成人免费无遮挡视频| 精品视频人人做人人爽| e午夜精品久久久久久久| 老熟妇乱子伦视频在线观看 | 黑人猛操日本美女一级片| 久久久久久久大尺度免费视频| 国产福利在线免费观看视频| 日日夜夜操网爽| 美女中出高潮动态图| av福利片在线| 日韩一区二区三区影片| 天天操日日干夜夜撸| 看免费av毛片| 在线观看一区二区三区激情| 香蕉国产在线看| 一本大道久久a久久精品| 高清视频免费观看一区二区| 日韩中文字幕视频在线看片| 黄色 视频免费看| 黄频高清免费视频| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 美女午夜性视频免费| 美女主播在线视频| 亚洲成人免费电影在线观看| 亚洲欧美精品自产自拍| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 亚洲第一青青草原| 午夜久久久在线观看| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 亚洲精品自拍成人| 一区二区三区乱码不卡18| 18禁国产床啪视频网站| 成人三级做爰电影| 亚洲伊人色综图| 丝袜人妻中文字幕| 色婷婷久久久亚洲欧美| 黄色视频,在线免费观看| 久久国产精品人妻蜜桃| 午夜福利一区二区在线看| 日本wwww免费看| 亚洲中文字幕日韩| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 亚洲精品久久午夜乱码| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 99热国产这里只有精品6| 亚洲专区国产一区二区| 天堂中文最新版在线下载| 一区二区三区四区激情视频| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| bbb黄色大片| 秋霞在线观看毛片| 老鸭窝网址在线观看| 黑人操中国人逼视频| 久久亚洲国产成人精品v| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 丝袜在线中文字幕| 日韩大码丰满熟妇| 亚洲国产精品成人久久小说| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 午夜影院在线不卡| 欧美黄色淫秽网站| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 精品熟女少妇八av免费久了| 日韩一区二区三区影片| 麻豆av在线久日| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 国产亚洲欧美精品永久| 一个人免费看片子| 最新在线观看一区二区三区| 老司机靠b影院| a级毛片在线看网站| av电影中文网址| 亚洲久久久国产精品| 2018国产大陆天天弄谢| 亚洲欧美色中文字幕在线| 一进一出抽搐动态| 啦啦啦啦在线视频资源| 免费人妻精品一区二区三区视频| 美女国产高潮福利片在线看| 天天添夜夜摸| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 他把我摸到了高潮在线观看 | 在线十欧美十亚洲十日本专区| 大香蕉久久网| 窝窝影院91人妻| 亚洲精品一二三| 亚洲avbb在线观看| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 一进一出抽搐动态| 三上悠亚av全集在线观看| 黄片大片在线免费观看| 一级黄色大片毛片| 亚洲黑人精品在线| 亚洲一区中文字幕在线| 日本a在线网址| 丝袜美足系列| 女人久久www免费人成看片| 国产成人av激情在线播放| 国产精品久久久人人做人人爽| 久久久久视频综合| 国产亚洲精品第一综合不卡| av福利片在线| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 欧美日韩视频精品一区| 另类精品久久| 两性夫妻黄色片| 亚洲精品第二区| 亚洲黑人精品在线| a 毛片基地| 在线看a的网站| 午夜91福利影院| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 国产成人欧美在线观看 | 日韩中文字幕欧美一区二区| 男女边摸边吃奶| 国产精品久久久久久精品电影小说| 99国产综合亚洲精品| 日日爽夜夜爽网站| 国产一区二区激情短视频 | 免费观看人在逋| 精品卡一卡二卡四卡免费| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 欧美精品av麻豆av| 国产一卡二卡三卡精品| 久久ye,这里只有精品| 久久亚洲国产成人精品v| 欧美黄色淫秽网站| 国产成人系列免费观看| 日韩大片免费观看网站| 国产精品久久久av美女十八| 一本色道久久久久久精品综合| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 老司机午夜十八禁免费视频| 亚洲 国产 在线| 男人操女人黄网站| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 午夜两性在线视频| 两性夫妻黄色片| 国产精品一二三区在线看| 又大又爽又粗| 天堂俺去俺来也www色官网| a级毛片在线看网站| 老熟妇乱子伦视频在线观看 | 丰满少妇做爰视频| 香蕉丝袜av| av电影中文网址| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 精品少妇内射三级| 国产av精品麻豆| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产av一区二区精品久久| 91麻豆av在线| 亚洲国产看品久久| 777米奇影视久久| 在线观看人妻少妇| 在线av久久热| 亚洲国产看品久久| 久久久精品94久久精品| 久久久欧美国产精品| 国产高清videossex| 午夜免费观看性视频| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 青春草视频在线免费观看| 精品久久蜜臀av无| 欧美97在线视频| 久久久国产一区二区| 免费少妇av软件| 婷婷丁香在线五月| 久久亚洲精品不卡| 中国国产av一级| 亚洲第一青青草原| 国产99久久九九免费精品| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 午夜福利,免费看| 黄片播放在线免费| 国产在线免费精品| 在线观看舔阴道视频| 俄罗斯特黄特色一大片| 搡老熟女国产l中国老女人| 午夜福利在线免费观看网站| 搡老熟女国产l中国老女人| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 亚洲欧美清纯卡通| 满18在线观看网站| 亚洲精品第二区| 免费高清在线观看视频在线观看| 亚洲精品第二区| 嫁个100分男人电影在线观看| 天堂俺去俺来也www色官网| 中文欧美无线码| 亚洲精品在线美女| 欧美日韩一级在线毛片| 亚洲少妇的诱惑av| 少妇的丰满在线观看| 欧美av亚洲av综合av国产av| 亚洲精品国产一区二区精华液| 日韩电影二区| 国产精品一区二区在线不卡| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 天堂8中文在线网| 成年人免费黄色播放视频| 99国产精品99久久久久| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产亚洲精品一区二区www | 成在线人永久免费视频| 老司机深夜福利视频在线观看 | 成年人午夜在线观看视频| 国产成人精品无人区| 国产精品免费视频内射| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 飞空精品影院首页| 色婷婷av一区二区三区视频| 巨乳人妻的诱惑在线观看| √禁漫天堂资源中文www| 亚洲精品一二三| 高潮久久久久久久久久久不卡| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 久久久久视频综合| 国产av一区二区精品久久| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 在线精品无人区一区二区三| 黄色毛片三级朝国网站| 大陆偷拍与自拍| 国产精品久久久久成人av| 最近最新中文字幕大全免费视频| 黄色视频在线播放观看不卡| 免费高清在线观看视频在线观看| 国产高清视频在线播放一区 | 青春草视频在线免费观看| 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲精品一二三| 国产99久久九九免费精品| 午夜福利在线免费观看网站| www日本在线高清视频| 老鸭窝网址在线观看| 国产亚洲一区二区精品| 一区二区av电影网| 国产精品久久久av美女十八| 国产人伦9x9x在线观看| 国产三级黄色录像| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 十八禁人妻一区二区| 不卡一级毛片| e午夜精品久久久久久久| 国产淫语在线视频| 淫妇啪啪啪对白视频 | 日本av手机在线免费观看| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 亚洲欧洲日产国产| 精品少妇黑人巨大在线播放| 色播在线永久视频| 日韩欧美免费精品| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 久热爱精品视频在线9| 国产一区二区三区av在线| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 国产亚洲欧美精品永久| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 精品国产国语对白av| 99国产精品一区二区蜜桃av | 免费人妻精品一区二区三区视频| 一边摸一边做爽爽视频免费| 视频区图区小说| 国产日韩欧美在线精品| 国产一区二区 视频在线| videosex国产| 美女国产高潮福利片在线看| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 国产在线一区二区三区精| 大片电影免费在线观看免费| 亚洲久久久国产精品| 午夜91福利影院| 美女大奶头黄色视频| 亚洲精品中文字幕在线视频| 99久久精品国产亚洲精品| 午夜福利乱码中文字幕| 精品一区二区三区av网在线观看 | 啪啪无遮挡十八禁网站| 999久久久精品免费观看国产| 精品一区二区三区四区五区乱码| 午夜福利乱码中文字幕| 啦啦啦在线免费观看视频4| 99精国产麻豆久久婷婷| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产精品成人在线| 丁香六月天网| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 老熟妇乱子伦视频在线观看 | 国产视频一区二区在线看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 中国国产av一级| 午夜福利在线免费观看网站| 一级a爱视频在线免费观看| 久久香蕉激情| 精品一区二区三卡| 国产99久久九九免费精品| 久久人妻熟女aⅴ| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 亚洲国产av新网站| 欧美黑人精品巨大| 国产99久久九九免费精品| 香蕉丝袜av| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 一个人免费看片子| 天堂8中文在线网| 91av网站免费观看| 久久久久久免费高清国产稀缺| 亚洲免费av在线视频| 欧美变态另类bdsm刘玥| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 国产真人三级小视频在线观看| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 妹子高潮喷水视频| 一本色道久久久久久精品综合| 黄片小视频在线播放| 丰满少妇做爰视频| 超色免费av| 99国产极品粉嫩在线观看| 午夜久久久在线观看| av有码第一页| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 久久久精品区二区三区| 国产精品亚洲av一区麻豆| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 中国美女看黄片| 老熟女久久久| 国产精品一区二区在线不卡| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 热re99久久精品国产66热6| 少妇的丰满在线观看| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲精品日韩在线中文字幕| av在线app专区| 丰满迷人的少妇在线观看| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 亚洲熟女毛片儿| 日韩大片免费观看网站| 在线精品无人区一区二区三| 岛国在线观看网站| 久久香蕉激情| 精品国产一区二区三区四区第35| 亚洲精品久久午夜乱码| 交换朋友夫妻互换小说| 亚洲国产成人一精品久久久| 欧美国产精品一级二级三级| 久久国产精品大桥未久av| 久久人人爽人人片av| 少妇人妻久久综合中文| 亚洲av美国av| 超碰成人久久| 在线观看免费午夜福利视频| 成年动漫av网址| 国产成人精品久久二区二区免费| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 亚洲成人免费av在线播放| 我的亚洲天堂| 亚洲黑人精品在线| 亚洲精品一区蜜桃| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 亚洲一码二码三码区别大吗| 亚洲 国产 在线| 欧美精品av麻豆av| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 少妇粗大呻吟视频| 777米奇影视久久| 美女高潮到喷水免费观看| 久久国产精品影院| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 免费在线观看完整版高清| 国产精品久久久久成人av| 99香蕉大伊视频| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 日日夜夜操网爽| 最近最新免费中文字幕在线| 涩涩av久久男人的天堂| 精品第一国产精品| 久久99一区二区三区| 纯流量卡能插随身wifi吗| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 午夜福利在线免费观看网站| 热re99久久精品国产66热6| 欧美另类亚洲清纯唯美| 日韩视频一区二区在线观看| 久久久久久免费高清国产稀缺| 久久久国产一区二区| 免费高清在线观看日韩| 婷婷色av中文字幕| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 黑人操中国人逼视频| 香蕉国产在线看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲天堂av无毛| 国产主播在线观看一区二区| 美国免费a级毛片| 国产欧美日韩一区二区精品| 考比视频在线观看| 一本综合久久免费| 精品熟女少妇八av免费久了| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 99re6热这里在线精品视频| 美女国产高潮福利片在线看| 后天国语完整版免费观看| 午夜福利视频在线观看免费| 精品一区在线观看国产| 久久精品国产亚洲av高清一级|