竹紅菌素的研究進(jìn)展

徐 倩，任清褒，張 燕，夏更壽*

（1.麗水學(xué)院生態(tài)學(xué)院,浙江麗水323000;2.麗水學(xué)院工學(xué)院,浙江麗水323000）

竹紅菌素（Hypocrellin）是肉座菌科的竹紅菌和竹黃菌等少數(shù)幾種竹寄生菌的次生代謝產(chǎn)物，屬于苝醌類衍生物，目前主要來源是通過菌絲體內(nèi)次級代謝合成途徑產(chǎn)生。作為苝醌類化合物，其結(jié)構(gòu)賦予它一定的光動(dòng)力活性，表現(xiàn)出較好的光療作用。因此近年來研究熱點(diǎn)大多集中在光敏殺傷腫瘤細(xì)胞和抑制病毒等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，以及光活化農(nóng)藥、光電轉(zhuǎn)換材料等的開發(fā)利用方面。本文綜述了竹紅菌素的最新研究進(jìn)展，重點(diǎn)闡述了竹紅菌素在生物合成途徑、應(yīng)用、產(chǎn)量優(yōu)化等方面的進(jìn)展情況。

1 竹紅菌素主要天然來源

竹紅菌素是由萬象義等人[1]在1980年首次從藥用真菌竹紅菌的肉質(zhì)子實(shí)體中分離出來的新苝醌類化合物，因源自竹紅菌而得名。而后在1991年，Kishi等人從另一個(gè)藥用真菌竹黃菌中也分離得到竹紅菌素[2]。

竹紅菌和竹黃菌等少數(shù)幾種竹寄生菌是竹紅菌素的天然來源。其中竹黃菌（Shiraia bambusicolaP.Hennings）主要分布在中國浙江、江蘇、安徽等省份，在日本、斯里蘭卡也有分布。浙江省內(nèi)的11個(gè)地級市均有分布，在天目山、莫干山、天臺山、四明山、百山祖等主要山脈都有發(fā)現(xiàn)，其中以杭州、湖州、麗水等地區(qū)的分布較廣，產(chǎn)量也較大[3]。它是我國傳統(tǒng)的重要藥用真菌，屬于囊菌亞門（Ascomycotina）肉座菌科（Hypocreaceae）竹黃屬（Sharaia），主要在苦竹、短穗竹、雷竹、白紋短穗竹等竹類植物的細(xì)嫩枝干上寄生，以短穗竹最為普遍，寄生率最高，產(chǎn)量最大，且只特異地寄生在前一年生的枝條上[4-5]。竹黃菌子座成熟時(shí)偏黃，表面光滑，紅色物質(zhì)逐漸積累呈粉紅色，質(zhì)地松軟，多為紡錘形或不規(guī)則瘤狀、塊狀，表面有細(xì)密紋理及針尖大小的斑點(diǎn)[6]。通常以肉質(zhì)子座入藥，其中竹紅菌素類成分的含量是衡量竹黃藥材質(zhì)量的重要指標(biāo)，近年通過代謝組學(xué)技術(shù)檢測出其他一些具有重要藥理作用的物質(zhì)，例如黃酮類、香豆素類及肉桂酸類等[7-8]。內(nèi)源性真菌Penicillium chrysogenum、Phaeosphaeriasp等經(jīng)發(fā)酵分離也可得到竹紅菌素、痂囊腔素等苝醌類化合物[9-10]。因此，竹紅菌素主要來自于寄生菌，同時(shí)也是寄生菌藥用價(jià)值的主要成分之一。

2 竹紅菌素的結(jié)構(gòu)、合成途徑與調(diào)控

苝醌類化合物是一類分布在自然界生物中的光敏色素。苝醌類衍生物（Perylenequinonoid derivatives，PQDs）是以苝醌為母核的化合物，含有5個(gè)共軛生色環(huán)，顏色較深，包括竹紅菌素（Hypocrellins）、尾孢素（Cercosporin）、痂囊腔菌素（Elsinochromes）、弗萊菌素（Phleichrome）和金絲桃素（Hypericin）等一系列的化合物[11]。竹紅菌素則是多種苝醌類衍生物的混合物，主要包括竹紅菌甲素（Hypocrellin A，HA）、竹紅菌乙素（Hypocrellin B，HB）、竹紅菌丙素（Hypocrellin C，HC）、竹紅菌丁素（Hypocrellin D，HD），在天然竹紅菌素中竹紅菌甲素含量為95%，遠(yuǎn)大于竹紅菌乙素，在合適的條件下兩者可以相互轉(zhuǎn)化。

竹紅菌素的生物合成途徑仍不十分明確，目前認(rèn)為主要是通過聚酮類化合物途徑合成，途徑中相關(guān)基因也陸續(xù)被詳細(xì)注釋[12]。Zhao等人對比竹紅菌素產(chǎn)量高的野生型S4201-W和產(chǎn)量低的突變體S4201-D1兩個(gè)竹黃菌的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，有716個(gè)Unigenes在突變體中表現(xiàn)為上調(diào)，同時(shí)有188個(gè)基因表現(xiàn)出下調(diào)，其中有7個(gè)基因參與了HA的生物合成，包括多銅氧化酶（Multicopper oxidase）、成束蛋白（Fasciclin）、聚酮合成酶（Polyketide synthase）、甲基轉(zhuǎn)移酶/FAD依賴性單加氧酶（O-methyltransferase/FAD-dependent monooxygenase）、甲基轉(zhuǎn)移酶（O-methyltransferase）、羥化酶（Hydroxylase）和FAD/FMN依 賴 氧 化 還 原 酶（FAD/FMN-dependent oxidoreductase），并初步推斷HA可能的生物合成途徑及關(guān)鍵基因[13]。另外，一些真菌全局性的調(diào)控因子、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等也參與次生代謝產(chǎn)物HA的生物合成，如光依賴型調(diào)節(jié)因子veA[14]、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（MFS）[15]等。

對竹紅菌素生物合成途徑相關(guān)基因的功能驗(yàn)證研究也已陸續(xù)開展。在分別敲除編碼聚酮合成酶（PSK）、單加氧化酶（MONO）、轉(zhuǎn)錄因子（ZFTF）基因的CRISPR轉(zhuǎn)基因菌株中竹紅菌素合成明顯受到抑制，合成相關(guān)基因的表達(dá)量都顯著降低，初步驗(yàn)證了這3個(gè)基因表達(dá)水平與竹紅菌素合成呈正相關(guān)關(guān)系。在過表達(dá)多銅氧化酶基因（MCO）的菌株中，竹紅菌素合成的多個(gè)基因表達(dá)量上升，竹紅菌素產(chǎn)量相比于野生型提高了5倍[16]。從分子水平解析竹紅菌素生物合成途徑，可以更深入地了解竹紅菌素，并為后續(xù)生物合成與調(diào)控的分子機(jī)理研究提供重要的參考，也為合理地利用竹黃等真菌資源提供新的途徑。

3 光敏的作用機(jī)制與應(yīng)用

光敏劑能在光和氧氣的作用下產(chǎn)生活性氧(ROS），活性氧有較強(qiáng)的氧化能力，在細(xì)胞中攻擊一些生物大分子如DNA、蛋白質(zhì)、脂類等，引起一系列細(xì)胞內(nèi)生理生化的變化，如細(xì)胞膜的劣變、細(xì)胞骨架損傷、阻斷細(xì)胞正常的周期等，因而對細(xì)胞具有明顯的殺傷作用。光敏活性的主要機(jī)理有兩種:分別是type I和typeⅡ機(jī)制，其中typeⅠ機(jī)制主要發(fā)生在無氧環(huán)境下，經(jīng)電子傳遞產(chǎn)生的活性氧主要有超氧陰離子自由基（O2）和羥基自由基（·OH）；typeⅡ機(jī)制主要發(fā)生在有氧條件下，通過產(chǎn)生單線態(tài)氧（1O2）與生物大分子物質(zhì)結(jié)合[17-18]。

竹紅菌素是一種新型的光療光敏劑，其藥用價(jià)值主要表現(xiàn)在抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗腫瘤等方面，民間常用于治療中風(fēng)、小兒驚風(fēng)、虛寒胃痛、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、跌打損傷、氣管炎和某些皮膚病等疾病[19-20]。萬象義等人將竹紅菌甲素用于治療外陰白色病變和疤痕疙瘩并取得了較好的療效[1]，臨床應(yīng)用上已用來治療皮膚病。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)竹紅菌素還具有良好的光敏殺傷腫瘤細(xì)胞、抑制艾滋病病毒HIV-1等作用[21]。竹紅菌素與抗腫瘤藥物血卟啉衍生物相比，具有一定的優(yōu)勢，如易純化、光化學(xué)動(dòng)力高、從正常組織排除的速度快等[22]。HA和HB能通過光動(dòng)力學(xué)作用，產(chǎn)生血管生成抑制因子促進(jìn)人腦瘤細(xì)胞死亡[23]。HA能在光照下通過產(chǎn)生羥自由基損傷受體的DNA，促使其裂解，在無光照條件下HA也能誘導(dǎo)人黑色素腫瘤細(xì)胞（A375-S2）凋亡，同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白CylinB1 mRNA表達(dá)增加并使細(xì)胞周期停滯在S期，其化學(xué)結(jié)構(gòu)可能是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的決定因素[24-25]。此外，藥理實(shí)驗(yàn)顯示竹紅菌素具有鎮(zhèn)痛、抗炎和抗菌等作用，但竹紅菌素是脂溶性物質(zhì)，其低水溶性和無特異組織分布制約了HA在光動(dòng)力療法中的應(yīng)用，可采用物理包埋方式或化學(xué)修飾等方法進(jìn)行改良，如用脂質(zhì)體或環(huán)糊精等包埋劑包埋，提高其水溶性[26]。采用化學(xué)修飾的方式將其裝載在轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的聚乳酸-羥基乙酸和羧甲基殼聚糖靶向納米粒中（HA-CMC-PLGA NPs），飼喂老鼠，結(jié)果顯示飼喂處理組小鼠的腸道和腫瘤部位積累了HA-CMC-PLGA NPs，同時(shí)腫瘤生長抑制率達(dá)到了63%[27]。采取上述的改良方式，不但提高了HA的利用效率，同時(shí)也使藥物開發(fā)更有靶向性。

除上述應(yīng)用在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域外，竹紅菌素還可應(yīng)用在農(nóng)業(yè)、食品等領(lǐng)域。利用其光反應(yīng)可開發(fā)新型、綠色、環(huán)保的光活化農(nóng)藥應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。徐德欽和夏更壽的研究表明，3種不同有機(jī)試劑的竹黃菌提取物對農(nóng)作物中常見的病原菌均有不同程度的抑制作用，其中甲醇提取物的效果最好，對棉花枯萎病菌的抑制率可達(dá)74.78%，這可能與甲醇提取菌絲體中竹紅菌素的效率有關(guān)[28]。殷紅福等人[29]也有類似的研究結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)竹紅菌甲素能明顯的抑制多種植物病原菌，尤其是對松針褐斑、鐮刀菌、蘋果腐爛病菌、山核桃干腐病原菌等抑制率高達(dá)90%以上。此外，竹紅菌甲素對眾多的害蟲（如桃蚜與黃粉蟲等）均有殺滅效果。在光照條件下，HA對番茄灰霉菌的抑制作用顯著高于黑暗條件，通過光反應(yīng)typeⅠ和typeⅡ的機(jī)制起到抑菌的作用，其中typeⅡ?yàn)橹饕愋?，產(chǎn)生的活性氧中單線態(tài)氧發(fā)揮的作用最大，是HA在抑制番茄灰霉菌菌絲生長的最關(guān)鍵因子[30]。另外，竹紅菌素的著色力強(qiáng)、可溶于酒精和其他有機(jī)溶劑，色澤鮮紅且富有保健功能，可作為一種脂溶性食品添加劑(食用色素）應(yīng)用到食品加工業(yè)中。由此可見，竹紅菌素在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、食品等領(lǐng)域有著巨大的研究價(jià)值和潛在開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。

4 產(chǎn)量優(yōu)化方式

目前竹紅菌素的天然產(chǎn)量較低，大量獲得的生產(chǎn)方法主要有天然萃取法、化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法。其中萃取法生產(chǎn)因生物資源有限，生產(chǎn)周期過于漫長，無法滿足研究和生產(chǎn)的需要；化學(xué)方法合成成本高，步驟較煩瑣，同時(shí)會(huì)殘留一些非目標(biāo)的化學(xué)物質(zhì)，純度受到影響，無法實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)；而微生物發(fā)酵生產(chǎn)是目前公認(rèn)的、比較容易實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)的一種方法[31-32]。

在進(jìn)行微生物發(fā)酵HA生產(chǎn)前，篩選出合適的株系是首要考慮的因素。各個(gè)菌株間存在明顯的遺傳分化，來源不同、產(chǎn)地不同的竹黃菌株在形態(tài)以及竹紅菌素產(chǎn)量方面存在著較大的差異[33]。本研究團(tuán)隊(duì)曾從野生竹黃子實(shí)體中分離得到82株內(nèi)生真菌，發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)TLC、HPLC鑒定獲得能生產(chǎn)竹紅菌素的ZHLS-03，并通過分子鑒定該菌株為竹黃菌[34]。Liang等人從短穗竹（B.densiflorum）中分離得到兩個(gè)菌株，在竹紅菌素產(chǎn)量上差異較大[35]。不同的菌株株系產(chǎn)生HA的效率不同，發(fā)現(xiàn)或創(chuàng)造新的菌株是提高HA產(chǎn)量的途徑之一。從竹黃子座中新分離出未知菌絲可通過多次分離和轉(zhuǎn)代進(jìn)行培養(yǎng)，依據(jù)菌絲的形態(tài)、顏色初步進(jìn)行判斷，進(jìn)一步對真菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）進(jìn)行擴(kuò)增和測序，與已知菌株序列進(jìn)行比對來確定新菌株的種屬地位[36]。如從蛇足石杉（Huperzia serrata）中分離得到一株可產(chǎn)生石杉堿甲的內(nèi)生真菌，屬于竹黃菌屬，被命名為Shiraiasp.Slf14，其菌絲和分生孢子形態(tài)與Shiraiasp.SUPER-H168相似，分子生物學(xué)分析結(jié)果 表 明Shiraiasp.Slf14與S.bambusicola、Shiraiasp.SUPER-H168的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，極可能是為竹黃屬的一個(gè)潛在新種[37-38]。新種質(zhì)的發(fā)現(xiàn)可以豐富竹紅菌素的來源，為其生產(chǎn)提供更多的天然資源和選擇。

適宜的培養(yǎng)基質(zhì)是提高竹紅菌素的產(chǎn)量的重要因素之一。于建興等利用單因素實(shí)驗(yàn)比較不同培養(yǎng)條件對竹黃菌生長和竹紅菌素產(chǎn)量的影響，獲得了最優(yōu)的發(fā)酵條件，并發(fā)現(xiàn)竹紅菌素的產(chǎn)生和竹黃菌的生長量有一定相關(guān)性，且碳氮比對竹紅菌素的影響較為顯著[39]。在液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同的金屬離子會(huì)影響真菌Shiraiasp.Slf14株系合成苝醌類物質(zhì)的數(shù)量，包括竹紅菌素、痂囊腔菌素等，K+、Na+、Ca2+等離子的添加對合成有促進(jìn)作用，然而Cu2+、Zn2+、Fe3+離子則極顯著地抑制苝醌類物質(zhì)的合成。鈣離子通過誘導(dǎo)鈣信號途徑中3個(gè)關(guān)鍵鈣感應(yīng)蛋白和苝醌類化合物合成關(guān)鍵基因（PKS1、omef、hyd）的轉(zhuǎn)錄水平來調(diào)控苝醌類物質(zhì)的合成[40]。Shiraiasp.SUPER-H168菌株在固體培養(yǎng)的不同時(shí)期外源添加淀粉酶和糖化酶可增加色素產(chǎn)量，進(jìn)一步分離到24個(gè)淀粉酶，并且在不同碳源培養(yǎng)基下表達(dá)各異，同時(shí)過表達(dá)其中的amy365-1和amy130菌株在液體發(fā)酵第13天時(shí)色素最高產(chǎn)量達(dá)到71.85 mg·gds-1，是野生型的2.83倍[41]。在工廠化發(fā)酵中選擇培養(yǎng)基的考慮因素除了產(chǎn)量外，還需考慮成本，在所獲得的苝醌類物質(zhì)產(chǎn)量相近的前提下，則可選擇廉價(jià)碳源，為低成本規(guī)模化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)[42-43]。

優(yōu)化液體發(fā)酵過程中的溫度、搖床轉(zhuǎn)速、初始pH值、培養(yǎng)基等條件，可以提高竹黃菌的生物量，正如本團(tuán)隊(duì)的前期研究結(jié)果表明，在pH值為7.0、溫度為30℃的發(fā)酵條件下竹黃菌絲生長較好且自由基清除率提高[43]。合適的條件下HA的產(chǎn)量也相應(yīng)地提高，在優(yōu)化竹黃ZH4菌株液體發(fā)酵條件后，HA產(chǎn)量從原來的103.51 mg/L提高到365.14 mg/L，增加了2.52倍，并且在暗培養(yǎng)下產(chǎn)生的色素量最大[43]。也有研究表明，弱光環(huán)境（小于600 lx）培養(yǎng)的竹黃菌無論是菌絲內(nèi)還是胞外的HA都高于黑暗處理中[44]。光照尤其是藍(lán)光下可以促進(jìn)竹黃菌次生菌絲的生長，但色素的產(chǎn)量會(huì)減少。超聲處理也影響竹黃菌的生長和生產(chǎn)HA的量，孫春曉對超聲參數(shù)進(jìn)行篩選并確定了最佳的超聲處理?xiàng)l件，即在菌絲培養(yǎng)的第3天進(jìn)行超聲處理，處理3次，每次5 min，每次間隔12 h，不僅菌絲內(nèi)HA的含量明顯提高，同時(shí)也促進(jìn)了HA向胞外的分泌，總含量達(dá)到247.67 mg/L，是對照組的3倍，另外大量活性氧積累，HA合成與釋放相關(guān)基因（包括PKS、Mono、FAD、O-mef和MFS）表達(dá)水平上調(diào)[44]。外界不同因素影響著微生物發(fā)酵方式中竹紅菌素的產(chǎn)量，從本質(zhì)上來說是影響了真菌的生長狀態(tài)，其中涉及到了不同酶的活性、不同基因的表達(dá)等調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)，相應(yīng)的機(jī)理還有待于更系統(tǒng)性的研究。

5 結(jié)論與展望

綜上所述，目前的竹紅菌素大多是從竹黃中提取的，而我國的野生竹黃資源產(chǎn)量有限，野生竹黃采收期僅集中于每年的4—5月，隨著竹紅菌素的功能開發(fā)，天然的竹紅菌素產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)無法滿足市場需求，因此竹紅菌素的大量生產(chǎn)還須通過發(fā)酵的方式。在發(fā)酵過程中，菌株株系的選擇、培養(yǎng)液的配方、培養(yǎng)條件等都會(huì)影響產(chǎn)量。隨著分子生物學(xué)研究的發(fā)展和發(fā)酵技術(shù)的提高，更多的研究已深入到生物合成竹紅菌素的機(jī)理機(jī)制、創(chuàng)新菌株的種質(zhì)資源、提高利用率等方面并取得了一定的進(jìn)展，但是仍有一些問題有待于解決和突破。在竹紅菌素生物合成途徑中的大多數(shù)關(guān)鍵酶和相應(yīng)的基因敲除株系已經(jīng)鑒定，但整個(gè)代謝通路仍不十分明確，并且其合成也必然受到其他通路的基因或者轉(zhuǎn)錄因子的影響進(jìn)而形成一個(gè)復(fù)雜的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，另外對環(huán)境條件的響應(yīng)和誘導(dǎo)機(jī)制也仍需進(jìn)一步地研究。這些問題的闡明將使竹紅菌素的生產(chǎn)更加地高效，將為實(shí)現(xiàn)竹紅菌素的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)和技術(shù)支撐，也為合理保護(hù)、開發(fā)利用這一獨(dú)特的醫(yī)藥資源提供新的方式和途徑。