As 對甜高粱種子萌發(fā)及幼苗生理的影響及評價

郝佳麗，白文斌，賈崢嶸，張陽，張建華，曹昌林

（山西農(nóng)業(yè)大學高粱研究所，山西 晉中 030600）

As 是廣泛存在于自然界的一種有害類金屬元素，是五大劇毒元素之一［1］。我國土壤中As 平均濃度為 11.2 mg·kg-1，約為世界平均值（6 mg·kg-1）的2 倍。土壤As 主要來源于工業(yè)生產(chǎn)、農(nóng)藥化肥和集約化養(yǎng)殖等，其進入環(huán)境后，能通過生物降解和化學反應轉(zhuǎn)化為遷移能力更強、毒性更大的化合物，造成環(huán)境污染。據(jù)2019 年全國土壤污染現(xiàn)狀調(diào)查顯示，我國土壤中As 含量點位超標率為2.7%，是僅次于Cd 的第二大污染物。

土壤重金屬污染物因其具有隱蔽性、不可逆性和長期性的特點［2］，是影響生態(tài)系統(tǒng)安全的一類重要污染物［3，4］。隨著化石燃料的日漸短缺和生態(tài)環(huán)境的持續(xù)惡化，當前尋找可再生的清潔能源及治理環(huán)境污染已成為人類亟待解決的兩大重要問題［5］。植物修復技術(shù)已成為當前重金屬污染土壤修復的主要途徑［6~8］，然而，植物修復技術(shù)往往受到復雜的土壤環(huán)境和植物自身因素的制約，因超富集植物生物量小、地域性強、難以馴化，使其修復效果降低［9，10］。因此，利用高生物量植物來修復重金屬污染土壤已成為植物修復技術(shù)中的一種重要途徑。

甜高粱作為一種抗逆性較強的高生物量植物［11，12］，既能作為能源植物替代化石燃料減少污染，又能有效吸收土壤中重金屬污染物［12，13］。大量研究表明甜高粱較其他作物在吸收重金屬方面具有很大的優(yōu)勢。劉曉輝等［14，15］研究不同濃度鋁對甜玉米、草高粱和甜高粱的逆境生理的影響，結(jié)果表明：甜高粱種子的SOD、POD 活性和MDA、Pro含量都顯著高于甜玉米，說明甜高粱種子對鋁的抗性高于甜玉米。陳夢妮等［16］研究Pb 脅迫下對甜高粱和玉米苗期的影響，通過分析生理抗性指標，綜合評價得出甜高粱的抗逆性顯著高于玉米。秦華等［17］研究結(jié)果表明在重金屬 Pb、Cd 脅迫下，遼甜1 號有較強的吸收轉(zhuǎn)運能力和抗逆性。利用甜高粱修復重金屬污染土壤具有廣闊的應用前景。

有關(guān)重金屬砷對不同作物的生長和抗性生理研究報道較少，前人主要研究了不同濃度砷脅迫下作物的生長發(fā)育及抗性生理。高雪等［18］研究表明外源砷顯著抑制青稞種子的萌發(fā)，降低青稞的株高、千粒重和產(chǎn)量。王春梅等［19］研究表明高濃度砷抑制谷子幼苗的生長，降低谷子POD 和CAT活性。Wang 等［20］研究表明砷濃度為 1.0 mg·kg-1脅迫下，鳳尾蕨的POD 活性明顯降低。然而，不同甜高粱品種在土壤砷脅迫下的響應研究鮮見報道，僅有研究闡述了不同甜高粱品種對砷的吸收轉(zhuǎn)運和積累特性［21］，對甜高粱種子萌發(fā)和幼苗生理響應的研究幾乎空白。本試驗通過室內(nèi)發(fā)芽試驗和室外盆栽試驗相結(jié)合的方法，研究不同濃度重金屬As 脅迫下的甜高粱種子萌發(fā)和苗期生理特性的影響，旨在探索不同甜高粱種子對重金屬As 的反應機制及苗期抗性生理的響應，篩選出抗性能力較強的甜高粱品種，為進一步提高高生物量植物甜高粱對重金屬污染土壤的植物修復技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試作物選取5 個抗逆性、抗病性和抗倒伏性較強，且植株高大、生物量高的甜高粱品種，其中2個為分蘗性強、可多次刈割的優(yōu)質(zhì)飼用甜高粱：大力士和綠巨人（百綠國際草業(yè)有限公司從澳大利亞引進的雜交種）；3 個為含糖量高、生產(chǎn)乙醇的優(yōu)質(zhì)能源甜高粱：晉甜雜3 號和晉甜1401（山西農(nóng)業(yè)大學高粱研究所選育），遼甜3 號（遼寧省農(nóng)業(yè)科學院選育）。As 標準貯備液，用 Na3AsO4·10H2O 配制，用去離子水稀釋成所需的濃度系列。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 不同As 濃度發(fā)芽培養(yǎng)試驗

試驗于2020 年10 月在山西農(nóng)業(yè)大學高粱研究所實驗室進行。用去離子水配制5 個不同濃度As 溶液備用，分別為 0、10、20、40、60 mg·kg-1；選取籽粒飽滿、整齊一致的種子，用0.1%HgCl2消毒10 min，用去離子水反復沖洗5~6 次，待種子表面水分干燥后，將已消毒的種子整齊排列在直徑為12 cm 的培養(yǎng)皿中，每皿 30 粒，重復 3 次，并分別加入10 mL 相應濃度的As 溶液，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。期間每天稱重，加各濃度As 溶液至原重。

種子萌發(fā)以胚根長度達到種子長度的一半時，開始統(tǒng)計發(fā)芽數(shù)。培養(yǎng)3 d 后統(tǒng)計發(fā)芽勢，7 d后隨機選取10 粒，測定芽長、根長并統(tǒng)計發(fā)芽率，并計算發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)和根、芽耐性指數(shù)。各指標計算公式如下：

發(fā)芽指數(shù)＝∑（不同時間內(nèi)的發(fā)芽數(shù)）/（相應的發(fā)芽天數(shù)）；

活力指數(shù)＝發(fā)芽指數(shù)×芽長。

耐性指數(shù)＝各濃度處理的根（芽）長度/對照組的根（芽）長度×100%。

1.2.2 盆栽試驗

本研究采用二因素完全隨機區(qū)組設(shè)計盆栽試驗，因素一為甜高粱品種，分別為大力士、綠巨人、晉甜雜3 號、晉甜1401、遼甜3 號；因素二為重金屬As 處理，設(shè) 0、10、20、40、60 mg·kg-15 個水平，完全組合共25 個處理，3 次重復。

試驗在山西農(nóng)業(yè)大學高粱研究所東白基地旱棚中進行。2020 年4 月稱取過2 mm 篩的風干土15 kg 裝入直徑45 cm、內(nèi)深50 cm 的塑料盆中，按試驗設(shè)計添加不同濃度的重金屬As，混勻，澆水，放置穩(wěn)定1 周。5 月6 日，選取籽粒飽滿的甜高粱種子10 粒播種，每盆留3 株定苗，高粱生長期間適時澆水并及時去除雜草等，于6 月底進行收獲。苗期選取長勢一致的高粱進行生理指標測定。

1.2.3 測定指標

采用硫代巴比妥酸法測定MDA 含量，采用氮藍四唑光還原法測定SOD 活性，采用愈創(chuàng)木酚法測定POD 活性，采用茚三酮比色法測定Pro含量［22］。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 作圖及制表

測定數(shù)據(jù)采用 Microsoft Excel 2017 和DPS7.05 版軟件進行處理和分析，采用Duncan 新復極差法進行多重比較，LDS 法進行差異顯著性檢驗，顯著水平為P＜0.05。

1.3.2 統(tǒng)一不同指標的量綱

參考嚴明建等［23］研究方法，將相應指標的平均值進行標準化轉(zhuǎn)換，求得各測定指標的耐性系數(shù)（K）。通過比較K 值大小來消除各項指標的差異。計算公式為：耐性系數(shù)（K）=處理測定值/對照測定值×100%

1.3.3 綜合評定

逆境下條件種子萌發(fā)和幼苗的長勢、生理特性均發(fā)生相應的變化，單從某一方面分析的抗性較為局限，采用隸屬函數(shù)法對多項指標進行綜合評估能準確、合理的評價植株抗性。本試驗采用隸屬函數(shù)值法［24］，利用模糊數(shù)學隸屬度公式對各指標耐性系數(shù)進行定量轉(zhuǎn)換，分別求出不同甜高粱品種各指標的具體函數(shù)值。

種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率、根長、芽長、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)和幼苗中的POD、SOD 活性和脯氨酸含量的K值越大抗性越強，K值與抗性正相關(guān)，采用隸屬函數(shù)公式：

MDA 含量的K值越大抗性越弱，與抗性呈負相關(guān)，用反隸屬函數(shù)計算其隸屬函數(shù)值，計算公式：

式中，i 為每個甜高粱品種；R（Xij）為各指標的隸屬函數(shù)值，R（Xij）［0，1］；Xij為i 個甜高粱品種第j 個指標的K 值；Xjmax和Xjmin分別為不同甜高粱品種第j個指標的K 值的最大值和最小值。

利用模糊學隸屬函數(shù)值對每種植物的系列發(fā)芽指標和抗性生理指標進行計算并求平均值，以評價其重金屬抗性順序。計算公式為：

式中為所有甜高粱品種的第j 項指標的平均值，Vj表示第j 項指標的標準差系數(shù)，Wj表示第j 項指標的權(quán)重，D 表示不同甜高粱品種的抗性綜合評價值，D 值越大，抗性越強。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度As 脅迫對甜高粱種子萌發(fā)的影響

由表1 可見，隨著As 濃度的增加，甜高粱種子的根長、芽長、發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)都顯著降低，根長較芽長降幅較大，高濃度下根長幾乎為0，表明As 對根生長的抑制作用較大。其中晉甜 1401 的根長在 As 濃度≥40 mg·kg-1時，顯著高于其它4 個品種，芽長差異不顯著；而大力士和綠巨人在高濃度As 脅迫下表現(xiàn)較差，根長為0。晉甜雜3 號的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)高于其它品種，且降幅較小，種子萌發(fā)特性較強。遼甜3 號的發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)隨著As 濃度的增加降幅都較小，僅次于晉甜雜3 號。大力士和綠巨人在As 濃度為60 mg·kg-1時發(fā)芽勢和發(fā)芽率顯著降低。隨著As 濃度的增加綠巨人的活力指數(shù)極顯著低于CK，表明在高濃度As 脅迫下綠巨人的種子萌發(fā)特性較差；大力士和晉甜1401 在高濃度As 脅迫下發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)表現(xiàn)較差。

表1 不同濃度As 脅迫對甜高粱種子萌發(fā)的影響Table 1 Effect of different Asconcentrations on sweet Sorghum germination

2.2 不同濃度As 脅迫對甜高粱種子根、芽耐性指數(shù)的影響

由圖1 可見，隨著As 濃度的增加，5 個甜高粱品種的種子根、芽的耐性指數(shù)均明顯降低；芽的耐性指數(shù)都顯著高于根的耐性指數(shù)。As 濃度為10 mg·kg-1時，大力士的根芽耐性指數(shù)最高，當As 濃度≥40 mg·kg-1時，大力士的根耐性指數(shù)為0，極顯著低于其它4 個品種。晉甜1401 在As 濃度≥10 mg·kg-1時芽的耐性指數(shù)低于大力士，高于其他3個品種；但根的耐性指數(shù)在As 濃度為10 mg·kg-1時，僅高于綠巨人，As 濃度≥40 mg·kg-1時，晉甜1401 顯著高于其它4 個品種，說明晉甜1401 在高濃度As 脅迫下根芽耐性指數(shù)較高?？傮w評價芽的耐性指數(shù)的大小為：晉甜1401＞大力士＞晉甜雜3 號＞遼甜3 號＞綠巨人；根的耐性指數(shù)大小為：晉甜1401＞晉甜雜3 號＞遼甜3 號＞綠巨人＞大力士。

圖1 不同濃度As 脅迫下甜高粱的根芽耐性指數(shù)Fig.1 Effect of different As concentrations on root-shoot tolerance indexes of sweet Sorghum

2.3 不同濃度As 脅迫對甜高粱幼苗POD 和SOD 活性的影響

由圖2 可見，不同濃度As 脅迫下，甜高粱幼苗POD、SOD 的活性都顯著高于CK，而且隨著As 濃度的增加，POD、SOD 的活性都呈先升高后降低的趨勢，說明As 濃度增加可誘導甜高粱幼苗體內(nèi)POD 和SOD 的活性增加，以消除As 的毒害作用，但是超過一定范圍，就會抑制其活性。大力士POD 的活性在 As 濃度為 20 mg·kg-1時最高，其他四個品種幼苗的POD 活性在As 濃度為40 mg·kg-1時最高；大力士和綠巨人SOD 的活性在As 濃度為20 mg·kg-1時最高，其他3 個品種幼苗的SOD活性在 As 濃度為40 mg·kg-1時最高；說明大力士和綠巨人幼苗在As 濃度≥40 mg·kg-1時受到As脅迫明顯，而晉甜1401、晉甜雜3 號和遼甜3 號在As 濃 度 為 60 mg·kg-1時 才 會 受 到 As 脅 迫 的影響。

圖2 不同濃度As 脅迫下甜高粱幼苗中POD 和SOD 的活性Fig.2 Effects of different As concentrations on the activities of POD and SOD of sweet sorghum seedlings

2.4 不同濃度As 脅迫對甜高粱幼苗中MDA 和Pro 含量的影響

由圖3 可見，不同濃度As 脅迫下，甜高粱幼苗中MDA 含量呈上升趨勢，顯著高于和Pro 含量都顯著高于CK，而且隨著As 濃度的增加，MDA 和Pro 含量都呈升高趨勢。MDA 含量增加說明甜高粱幼苗在As 脅迫下都發(fā)生了膜脂過氧化作用，隨著As 濃度的增加，大力士的MDA 含量增幅最大，其次是綠巨人，而晉甜雜3 號和遼甜3 號的MDA含量增幅較小，根據(jù)MDA 含量變化幅度的大小，可以反映出晉甜雜3 號和遼甜3 號遭受膜脂傷害較輕。當 As 濃度為 20 mg·kg-1時，5 種甜高粱幼苗中 Pro 含量顯著高于 10 mg·kg-1和 CK，當 As 的濃度≥40 mg·kg-1時 ，Pro 含量極顯著高于 20 mg·kg-1，而當 As 濃度為 60 mg·kg-1時，大力士、綠巨人和晉甜 1401 的 Pro 含量與 As 濃度為 40 mg·kg-1時的差異較小，而晉甜雜3 號和遼甜3 號的Pro 含量呈顯著性差異。

圖3 不同濃度As 脅迫下甜高粱幼苗中MDA 和Pro 的含量Fig.3 Effects of different As concentrations on the MDA and Pro contents of sweet sorghum seedlings

2.5 不同甜高粱品種對土壤As 抗性能力大小綜合評價

采用隸屬函數(shù)法對5 個甜高粱品種的種子萌發(fā)期相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率、相對胚芽長、相對胚根長、相對萌發(fā)指數(shù)、相對活力指數(shù)和幼苗期POD 活性、SOD 活性、MDA 含量、Pro 含量進行了綜合評價，得到5 個甜高粱品種的對As 的綜合抗性能力D 值（表2）。

表2 甜高粱種子萌發(fā)期和幼苗期隸屬函數(shù)綜合評價Table2 The comprehensive evaluation of subordinate function of sweet Sorghum germination stages and seedling

5 個甜高粱品種的綜合抗性能力D 值在0.207~0.406 之間，其As 抗性能力大小為晉甜1401＞晉甜雜3 號＞遼甜3 號＞大力士＞綠巨人。

3 討論

種子萌發(fā)是植物生長最敏感、最關(guān)鍵的時期，在外源重金屬脅迫條件下，能否正常發(fā)芽以及發(fā)芽狀況都可以反映出該種子抗性能力，通常情況下發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)在一定程度上能反映出種子活力狀況。本試驗中種子發(fā)芽各項指標都隨As 濃度的增加顯著降低，對根長抑制作用大于芽長。這與陳夢妮等［26］研究發(fā)現(xiàn)不同濃度Cr6+對3 種甜高粱種子各項萌發(fā)指標均產(chǎn)生不同程度的抑制作用結(jié)果相一致。說明重金屬As 脅迫下甜高粱種子體內(nèi)蛋白酶等活性受到抑制，影響了種子內(nèi)蛋白和淀粉的分解，使種子萌發(fā)受到抑制。本研究中As 濃度為0 mg·kg-1時，綠巨人的發(fā)芽指標最高，晉甜1401 最低，這可能與不同品種基因型的發(fā)芽率有較大關(guān)系；當As 濃度≥10 mg·kg-1時，晉甜雜3 號和遼甜3 號的發(fā)芽指標相對較高，表明其種子萌發(fā)特性較強。高濃度As 脅迫下，芽長差異不顯著，根長呈顯著差異，晉甜1401的根長最大，大力士和綠巨人根長為0。

隨著As 濃度的增加，5 種甜高粱種子根、芽的耐性指數(shù)均顯著降低；芽的耐性指數(shù)都顯著高于根的耐性指數(shù)，這與胡培全［26］研究3 種牧草種子根、芽的耐性指數(shù)均隨著Cd 濃度的增加而明顯降低，且高濃度Cd 脅迫下芽的耐性指數(shù)高于根的耐性指數(shù)的結(jié)果一致。本試驗中晉甜1401 在高濃度As 脅迫下根芽耐性指數(shù)顯著高于其他四個甜高粱品種；大力士的根芽耐性指數(shù)在低濃度時最高，但高濃度As 脅迫下顯著降低；綠巨人的根芽的耐性指數(shù)都較低。說明低濃度As 會抑制種子萌發(fā)能力，但隨重金屬濃度的升高，超出植物的耐性與抗逆性，會造成植物完全喪失發(fā)芽能力［27］。因為過量的重金屬脅迫會造成種子內(nèi)細胞膜脂過氧化，使植物體內(nèi)產(chǎn)生活性氧自由基，導致抗氧化防御系統(tǒng)之間的失衡，從而影響植物正常萌發(fā)［28］。

甜高粱幼苗POD、SOD 的活性都隨As 濃度的增加呈先升高后降低的趨勢，這與郝正剛［29］研究鎘脅迫下甜高粱幼苗SOD、POD 和CAT 活性隨鎘濃度升高都呈先上升后下降的趨勢一致。李建剛等［30］研究甜高粱在低濃度鎘脅迫下SOD 和POD 發(fā)揮抗氧化功能，其活性增加，而高濃度時其活性顯著降低。說明在低濃度As 脅迫下，甜高粱幼苗可通過提高體內(nèi)POD 和SOD 的活性，來降低As 的毒害作用；但高濃度As 使其產(chǎn)生的活性氧自由基超過了其自凈閾值，受到的抑制作用增強。本試驗中晉甜1401、晉甜雜3 號和遼甜3 號在As濃度為 60 mg·kg-1時，其幼苗 POD、SOD 的活性受到抑制，而大力士和綠巨人幼苗在As 濃度≤40 mg·kg-1時，其 POD、SOD 的活性就會受到抑制。

植株在逆境條件下，除POD、SOD 活性的變化，MDA 和Pro 含量也常作為判斷其抗性的重要生理指標。本試驗中甜高粱幼苗中MDA 和Pro 含量都隨As 濃度的增加呈升高趨勢，且都顯著高于CK。MDA 含量增加說明甜高粱幼苗在As 脅迫下都發(fā)生了膜脂過氧化作用，也反映出植株體內(nèi)的自由基增加；而Pro 含量的增多可增強植物體內(nèi)調(diào)節(jié)滲透壓的能力，從而降低毒害作用。本試驗中晉甜雜3 號和遼甜3 號的MDA 含量在高濃度As脅迫下增幅較小，可以反映出晉甜雜3 號和遼甜3號的細胞膜脂過氧化作用相對較弱，受到傷害較輕；而大力士的MDA 含量增幅最大，說明其在高濃度As 脅迫下發(fā)生較強的細胞膜脂過氧化作用，導致其體內(nèi)的自由基含量增加，使MDA 含量增加。當 As 濃度為 60 mg·kg-1時，晉甜雜 3 號和遼甜3 號的Pro 含量較低濃度時呈顯著性差異，而大力士、綠巨人和晉甜1401 的Pro 含量差異較小。

不同作物、不同指標在不同重金屬濃度脅迫下存在不同差異，單項指標不能準確的評價作物的抗逆性，而將各項指標結(jié)合起來進行綜合評價更可靠。張美俊等［24］采用隸屬函數(shù)法計算不同糜子萌發(fā)期的綜合指標來評價糜子的抗旱性；陳夢妮等［25］采用隸屬函數(shù)法綜合評價了3 種甜高粱種子萌發(fā)期耐Cr6+性。本試驗研究了5 種甜高粱種子萌發(fā)期和苗期抗性生理指標，同樣采用了模糊數(shù)學隸屬函數(shù)法，綜合評價了不同品種甜高粱在As 脅迫下的抗性能力，結(jié)果為晉甜1401 的耐As性能力最強，相比其他品種而言，晉甜1401 的根長、芽長、活力指數(shù)和抗性生理指標得出的隸屬函數(shù)值都高于其他品種，而發(fā)芽勢和發(fā)芽率較低，與品種自身芽率不高有關(guān)，與抗性能力強弱關(guān)系不大；晉甜雜3 號的耐As 性僅次于晉甜1401，由于晉甜雜3 號在高濃度As 脅迫下，各項發(fā)芽指標和幼苗抗性生理指標都相對較高，綜合得出抗性能力也較強；而大力士和綠巨人雖然發(fā)芽率較高，但在高濃度As 脅迫下，發(fā)芽指標顯著降低，幼苗POD和SOD 活性也較差，計算得出的綜合評價D 值也較低，所以抗性能力也較弱。本試驗只是通過種子萌發(fā)和幼苗抗性生理綜合評價其抗性，但植物的整個生育期生理變化比較復雜，應進一步研究多個生育期及植株吸收富集特性進行分析。

4 結(jié)論

不同甜高粱品種種子的根長、芽長、發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)和根芽耐性指數(shù)都隨著As 濃度的增加顯著降低，且對根長的抑制作用大于芽長，芽的耐性指數(shù)顯著高于根的耐性指數(shù)。甜高粱幼苗POD、SOD 的活性先升高后降低，MDA 和Pro 含量呈升高趨勢。晉甜1401 的根芽耐性指數(shù)最高，種子萌發(fā)和幼苗抗性指標較高；晉甜雜3 號和遼甜3 號次之，大力士和綠巨人的發(fā)芽指標和根芽耐性指數(shù)表現(xiàn)較差，且MDA 含量增幅較大，Pro 含量增幅較小。采用模糊數(shù)學隸屬函數(shù)法綜合評價5 種甜高粱耐As 性：晉甜1401＞晉甜雜3 號＞遼甜3 號＞大力士＞綠巨人。