基于高通量測序技術(shù)篩選低溫秸稈降解菌群的研究

何志剛，劉慧嶼，劉艷，雋英華，王秀娟，董環(huán)，韓瑛祚

（遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物營養(yǎng)與環(huán)境資源研究所，遼寧 沈陽 110161）

玉米秸稈是極為豐富且能直接利用的可再生有機資源。作物秸稈的循環(huán)利用是農(nóng)業(yè)有機生產(chǎn)中最經(jīng)濟的，對保持和提高土壤肥力以及農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展均有重要作用［1，2］。秸稈含有豐富的有機碳和大量的氮、磷、鉀、硅等礦質(zhì)營養(yǎng)元素［3］，將其還田能夠改善土壤結(jié)構(gòu)［4］，提高土壤養(yǎng)分含量，維持作物穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)［5］，優(yōu)化農(nóng)田生態(tài)環(huán)境，是一種促進土壤有機質(zhì)積累［6，7］、調(diào)節(jié)土壤溫度和水分［8］的農(nóng)藝措施。遼寧省是我國北方重要糧食主產(chǎn)區(qū)，大量玉米秸稈無處安放，如何將秸稈高效、無害化歸還到農(nóng)田土壤中，是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)急需解決的問題。秸稈進入農(nóng)業(yè)循環(huán)生產(chǎn)，不僅可以達到充分利用其中養(yǎng)分資源的目的，還可以增加土壤碳庫儲量，減少二氧化碳排放。隨著農(nóng)業(yè)機械化發(fā)展，遼寧地區(qū)玉米秸稈還田規(guī)模越來越大，但由于秋冬季節(jié)溫度過低，秸稈進入土壤后不易腐解，影響翌年作物播種和生長，已成為制約遼寧省玉米可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵瓶頸問題。

有學(xué)者認(rèn)為在滿足溫度條件下，秸稈還田可以明顯增加土壤微生物群落的多樣性，微生物群落多樣性影響秸稈在土壤中的分解速度［9~12］，在通常情況下，秸稈給土壤微生物繁殖提供養(yǎng)分，促進微生物的生長，并提高土壤中微生物的活性［13］。作物秸稈中的纖維素、木質(zhì)素和半纖維素、蛋白質(zhì)等物質(zhì)在土壤中腐解和發(fā)酵后轉(zhuǎn)化成土壤有機質(zhì)［14］，能減緩?fù)寥烙袡C質(zhì)的下降。為了解決東北地區(qū)秸稈不易腐解的問題，有研究者采用秸稈還田時加入腐熟劑，加快秸稈降解和養(yǎng)分釋放，緩解秸稈未腐解的負(fù)面影響［15，16］，但由于菌種對生存環(huán)境要求高，導(dǎo)致穩(wěn)定性不高、定殖存活效率低以及與土著微生物群落競爭生態(tài)位等問題［17，18］，限制了推廣應(yīng)用。有學(xué)者研究表明，受大田環(huán)境因素與所產(chǎn)纖維素酶的影響，單一微生物菌株很難高效降解秸稈類物質(zhì)，利用微生物間的協(xié)同共生作用將多種纖維素降解菌混合培養(yǎng)，其產(chǎn)酶具有多樣性，且有利于提高秸稈類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化率［19］。近年來，劉心吾等［20］報道通過篩選耐高溫木質(zhì)纖維素降解菌株達到降解秸稈的效果；李雯等［21］研究了不同纖維素降解菌對玉米秸稈的降解效果。目前，對于纖維素降解菌的研究主要集中在中高溫菌株及常溫菌株，對低溫降解細(xì)菌菌群的研究較少，但低溫條件進行富集篩選具有高效、成本低等優(yōu)點［22，23］。直接篩選組合馴化獲得的復(fù)合菌系群落結(jié)構(gòu)容易受環(huán)境條件影響［24］，且缺少對獲得的復(fù)合菌系在玉米秸稈降解過程中協(xié)同降解的微生物群落變化研究。因此，針對北方寒涼地區(qū)玉米秸稈還田關(guān)鍵瓶頸問題，為獲得低溫高效降解玉米秸稈的復(fù)合菌群，本試驗進行了玉米秸稈低溫降解菌群的富集培養(yǎng)、纖維素酶測定、秸稈失重試驗及其微生物群落多樣性分析，以期為秸稈綜合利用提供試驗理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

于遼寧省冬季廣泛采集低溫環(huán)境下菌源樣品，如玉米田耕層凍土、林下土等，采集后?20 ℃冰箱保存。

表1 菌源樣品來源Table 1 Source of samples

1.2 方法

1.2.1 菌群的篩選

（1） 富集培養(yǎng)基

每一代富集培養(yǎng)均采用赫奇遜富集培養(yǎng)基：KH2PO41.0g，NaCl 0.1g，F(xiàn)eCl·36H2O 0.01 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaNO32.5 g，CaCl2·6H2O 0.1 g，蒸餾水1 000 mL，玉米秸稈1.0 g。秸稈預(yù)處理：蒸餾水浸泡過夜，去除可溶性糖，沖洗數(shù)次，50~60 ℃烘干備用。

（2） 傳代培養(yǎng)

取樣品5 g 加入裝有50 mL 無菌水的150 mL三角瓶中，120 r·min-1震蕩 30 min，吸取懸濁液 1 mL 于盛有富集培養(yǎng)基的三角瓶中，以15 d 為周期（10 ℃）培養(yǎng)箱中震蕩 120 r·min-1培養(yǎng)，每 15 d 按5%（V/V）接種量接種到新的富集培養(yǎng)基中，連續(xù)傳代10 次。

（3） 玉米秸稈失重率的測定

發(fā)酵前稱量添加干玉米秸稈的質(zhì)量，發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵剩余物 8 000 r·min-1離心 10 min，棄去上清液，然后用去離子水洗2 次，收集沉淀物于105 ℃烘干至恒重，測定玉米秸稈失重計算秸稈降解率，以不接菌處理作為對照，設(shè)置3 個重復(fù)［25］。

（4） 纖維素酶活性的測定

以崗位能力點為標(biāo)準(zhǔn)，以項目為載體的過程教學(xué)模式具有系列考核指標(biāo)，學(xué)習(xí)效果評價管理網(wǎng)絡(luò)信息化便于教師記錄過程信息與考核結(jié)果，避免了傳統(tǒng)紙質(zhì)記錄的不便與管理的繁瑣。通過信息平臺向?qū)W生實時公開過程考核情況，以使學(xué)生了解自身的學(xué)習(xí)狀況，及時制定彌補措施，公開透明的評價方式也利于形成好的學(xué)習(xí)風(fēng)氣。

采用DNS 法見［25］測定傳代最后一代培養(yǎng)液的不同纖維素酶活性［以纖維素類物質(zhì)（濾紙、羧甲基纖維素、脫脂棉、水楊苷）為底物測定降解能力，其中以濾紙為底物的濾紙酶活性（FPA）、羧甲基纖維素為底物的內(nèi)切-1，4-β-葡聚糖酶活性（CMCase）、脫脂棉為底物的外切-1，4-β-葡聚糖酶酶活性（C1）、水楊苷為底物的β-葡萄糖苷酶活性（BG）］。

1.3 微生物菌群測定

微生物總DNA 的提取采用DNA 提取試劑盒（Power Soil? DNA Isolation Kit），提取微生物總DNA。所提取的總DNA 純度和濃度用核酸定量儀（Nano Drop ND-1000）檢測。各樣品純化后DNA 送至北京百邁客公司應(yīng)用Illumina 平臺的HiSeq 進行測序，分別測定細(xì)菌群落。方法見參考文獻［26~28］。

1.4 固體發(fā)酵培養(yǎng)正交實驗

為確定SLX 菌系固體培養(yǎng)基的最佳配方，將麥麩：秸稈粉、水料比、接種量作為三因素三水平正交表設(shè)計試驗，試驗設(shè)計方案見表2。

表2 固體培養(yǎng)正交試驗設(shè)計Table 2 The design of soil orthogonal experiment

1.5 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)微生物種群測序結(jié)果的Barcode序列和PCR 擴增引物序列，從下機數(shù)據(jù)中拆分出各樣品數(shù)據(jù)，使用Flash 軟件對每個樣品的數(shù)據(jù)進行拼接，得到高通量測序原始數(shù)據(jù)。進一步去除嵌合體、兩端引物以及非靶區(qū)域序列后得到有效數(shù)據(jù)，明確 OTU（Operational Taxonomic Units）為研究中的最小分類單元；然后用綜合考慮物種多樣性及豐度的weighted unifrac 法進行UPGMA（Unweighted Pair Group Method with Arithmetic means）聚類分析；使用 UniFrac 軟件中 jackknifed算法進行樣本之間的距離計算，將細(xì)菌高通量測序得出的細(xì)菌豐度指數(shù)、多樣性指數(shù)作細(xì)菌矩陣。分析結(jié)果使用Canoco5.0 軟件制圖，其余常規(guī)數(shù)據(jù)采用Excel 進行整理分析作圖，采用SPSS 19.6 軟件進行相關(guān)分析，采用Duncan 法，顯著水平0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 富集菌群的分解玉米秸稈效果

4 個處理進行富集培養(yǎng)傳代10 次后，均由培養(yǎng)開始的淡黃色轉(zhuǎn)為培養(yǎng)結(jié)束時的棕褐色；絮狀物析出明顯（圖1），呈現(xiàn)為隨著世代的延長，秸稈降解率增長的現(xiàn)象。在最后一個傳代周期內(nèi)，如表3所示，不同處理SLA、SLW、SLX、SLZ 的秸稈失重率分別達到38.00%、41.33%、58.97%、50.10%，分別比2 代培養(yǎng)提高了30%、31.33%、40.97%、30.77%。如表4 所示，不同處理纖維素酶活性表現(xiàn)結(jié)果：FPA 酶：SLX＞SLZ＞SLW＞SLA，其中SLX 處理比與 SLA、SLW 提高了 6.97、5.06 U·mL-1，差異顯著（P＜0.05）；CMC 酶：SLZ＞SLX＞SLW＞SLA，SLZ 處理比與 SLA、SLW 提高了7.49、6.02 U·mL-1，差異顯著（P＜0.05）；C1 酶：SL X＞SLZ＞SLW＞SLA 其中SLX 處理比與SLA、SLW 提高了 4.82、4.64 U·mL-1，差異顯著（P＜0.05）；BG 酶：SLZ＞SLW＞SLX＞SLA，處理間差異不顯著。分析其中原因：由于富集培養(yǎng)會使某些特定的微生物菌株大量累積，4 個處理的菌源來源不同，導(dǎo)致富集后存在的菌種也存在差異，從不同酶活性變現(xiàn)差異可以看到，SLX 和SLZ 處理的酶活性均高于另外2 個樣品，說明這2 個樣品中存在的微生物群落更加容易降解玉米秸稈，SLA是采集玉米耕層凍土，從表3 中觀察也具有一定玉米秸稈分解能力，但是由于土壤中的菌群降解能力有限，在所有處理中效果最差，也從另一個角度說明北方地區(qū)玉米秸稈還田，存在很大難度。通過觀察低溫繼代培養(yǎng)過程中的變化，4 個菌系均具有良好的玉米秸稈降解和纖維素酶活性，具有穩(wěn)定的分解功能。其中篩選的復(fù)合菌群SLX 的玉米秸稈降解率顯著高于其他復(fù)合菌群，說明復(fù)合菌群SLX 具有更高的秸稈降解活性及低溫優(yōu)越性。

圖1 不同處理富集傳代培養(yǎng)結(jié)果Fig.1 Enrichment subculture in different treatments

表3 不同處理分解玉米秸稈降解率Table 3 Degradation rate（DR）of corn stalk decomposed by different treatment 單位：%

表4 不同處理纖維素酶活性變化Table 4 Changes in cellulase activity in different treatments 單位：U·mL?1

2.2 微生物群落多樣性指數(shù)分析

2.2.1 細(xì)菌多樣性指數(shù)分析

在微生物生態(tài)學(xué)研究中，OTU（operational taxonomic units）是將基因序列相似性接近97%的定義為一個OTU；Effective Tags 為原始序列過濾后得到的優(yōu)化序列數(shù)再過濾嵌合體后的有效序列數(shù)；本研究對不同處理細(xì)菌16S rRNA 基因序列進行了高通量測序，刪除掉低質(zhì)量序列后，共得到有效序列量318 356 條，測序平均獲得62 348.5 有效片段，被聚類為1 094.9 個OTU，平均長度414 75 bp。微生物群落的均勻度指數(shù)（Ace）和多樣性指數(shù)（Shannon）表 5 中 可 見 ，處 理 SLX 和 SLZ 的OTU 數(shù)量達到 1 140.3 和 1 144.7，均高于 SLW 和SLA，差異達到顯著水平；SLX 和 SLZ 的 Ace 指數(shù)達 到 1 164.1 和 1 169.9，均 高 于 SLW 和 SLA；SLX 和 SLZ 的 Shannon 指數(shù)達到 8.33 和 8.2，均高于SLW 和SLA，差異達到顯著水平，處理SLX 和SLZ 細(xì)菌群落多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)均很高，說明這兩個處理的菌群豐富度較高；處理SLX 和SLZ；SLW 和 SLA 分別兩樣本的 Shannon 指數(shù)接近，表示二者之間菌群落結(jié)構(gòu)類似，進一步對比分析。

表5 細(xì)菌群落多樣性指數(shù)分析Table 5 Analysis of Bacterial Community Diversity Index

通過Venn 圖（圖2）分析了4 個處理細(xì)菌共有的優(yōu)勢屬（相對豐度＞1%）的數(shù)量及特有的優(yōu)勢屬，4 個處理優(yōu)勢屬共有4 378 個，整體的優(yōu)勢菌屬排序：SLX＞SLZ＞SLW＞SLA，3 個處理中均有分布的優(yōu)勢種屬有1 138 個；SLX 處理中優(yōu)勢屬的種類最多，為1 210 個；SLA 處理中優(yōu)勢屬的種類最少，為 1 171 個。從表 5 和圖 2 中可見，SLX 處理中富集了更多的參與秸稈降解的微生物，菌種組成多樣性較高，菌群結(jié)構(gòu)更加豐富。

圖2 細(xì)菌群落維恩圖Fig.2 Venn diagram of bacterial community

2.2.2 細(xì)菌群落組成分析

從圖3 中可以觀察到，4 個處理中豐度較高的主要類群有：變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、浮霉菌門（Planctomycetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、糖化菌門（Saccharibacteria）等。其中SLA 和SLW 中的細(xì)菌類型，主要包括變形菌門（Proteobacteria）、裝甲菌門（Armatimonadetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、硝化螺菌門（Nitrospirae）；SLX 和 SLZ 主要包括酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Verrucomicrobia）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）等菌群。

圖3 不同處理細(xì)菌群落熱圖Fig.3 Bacterial community heat map of different treatments

與 SLA 相比，SLX 和 SLZ 處理均顯著增加的門為擬桿菌門（Bacteroidetes）分別增加了18.18%和44.69%；浮霉菌門（Planctomycetes）分別增加了 53.74% 和 60.50%；綠彎菌門（Chloroflexi）分別增加了4.79%和12.35%；變形菌門（Proteobacteria）分別增加了 2.51% 和 3.57%。與 SLA 相比，SLX 和SLZ 處理均顯著降低的門糖化菌門（Saccharibacteria）分別降低 27.23% 和 33.98%；放 線 菌 門（Actinobacteria）分 別 降 低 0.58% 和12.34%。與 SLA 相比，酸桿菌門（Acidobacteria）變化幅度較小，SLX 處理增加了3.18%和SLZ 處理降低了1.09%；芽單胞菌門（Gemmatimonadetes），SLX 處 理 降 低 3.18% 和 SLZ 處 理 增 加1.09%。

其中SLA 和SLW 變形菌門相對豐度較高，分別達到 21.4、23.2%，在 SLZ 和 SLX 的處理中，酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）分別比（SLA 和SLW）增加7.86%、2.51%和5.55%。說明以這2個處理，經(jīng)過低溫富集培養(yǎng)，主要增加了酸桿菌門、放線菌門、芽單胞菌門等菌株。

與 SLA 相比，SLX 和 SLZ 處理豐度均顯著增加的屬有溶桿菌屬（Lysobacter）分別增加101.25% 和 168.19%；擬無枝酸菌屬（Amycola?topsis）分別增加了149.88%和48.25%；獨島菌屬（Dokdonella）分別增加了 112.55% 和 69.71%；Gemmatirora分別增加了220.89% 和719.08%；Haliangium分別增加了135.99%和159.66%；與SLA 相比，降低的屬有Rhodoplaner分別降低了54.42% 和 46.48%；Reyranella分 別 降 低 了3.29%和28.07%。其他未分類屬種處理間變化差異亦很顯著，進一步從SLX 發(fā)現(xiàn)，uncultured Acidobacteriaceae，uncultured Sphingomonas 等一些未被鑒定的菌株，分別占細(xì)菌總量的3.7%~8.3%。分析可能是一些現(xiàn)階段未被發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)纖維素酶的新菌株。

從熱圖和基于Beta 多樣性分析，得到的不同處理UPG-MA 聚類結(jié)果見圖4。樣品越靠近，代表樣品物種組成越相似。第一、二主成分軸對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變異解釋量分別為32.42% 和22.77%。SLX 和 SLZ 分布在 PC1 軸正向，SLA和 SLW 分布在 PC1 軸反向；SLA 和 SLW 的 微 生物群落聚為一個類群，SLX 和SLZ 微生物群落為一個類群，表明樣品來源是影響微生物群落劃分的主要因素。

圖4 不同處理UPG-MA 聚類圖Fig.4 Different processing UPG-MA clustering diagram of different treatments

從圖3、圖4 可見，不同處理富集了不同菌群，其中 SLX 和 SLZ、SLA 和 SLW 各聚為一個類群，其中SLX 處理是在各處理中是最豐富的細(xì)菌類群，菌群相對豐度越高，物種和遺傳多樣性越豐富，同時也具有廣泛的生理代謝功能，其中SLX 主要增加了，酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）是降解木質(zhì)素的功能群，芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）可能參與木質(zhì)素和環(huán)境污染物的降解，并發(fā)現(xiàn)了一些新的菌種。由此可知，SLX 處理中保留了菌源土壤中的功能菌，通過限制性培養(yǎng)使其大量擴繁，大大提高功能菌的豐度，從而促進玉米秸稈的降解。

2.3 細(xì)菌群落綱水平與纖維素酶活性響應(yīng)關(guān)系

不同纖維素酶活因子用帶有箭頭的黑色線段表示，響應(yīng)變量用帶有箭頭的藍(lán)色虛線線段表示，其長短代表其在排序空間內(nèi)的變化量。本研究通過冗余分析探究細(xì)菌群落綱水平下4 種不同纖維素酶因子變化趨勢。如圖5 所示，結(jié)果表明不同微生物細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)對纖維素酶活性對有顯著影響，并可以解釋微生物群落結(jié)構(gòu)總變異的34.15%。如圖 3B 所示 FPA、CMCase、C1 和 BG酶。C1、BG 位于第四象限，C1 與α-變形菌綱（Deltaproteobacteria）、BG 與 β-變形菌綱（Betapro?teobacteria）表現(xiàn)正相關(guān)；CMCase 和 FPA 位于第二象限，與酸桿菌門（Acidobacteria）表現(xiàn)正相關(guān)。

圖5 綱水平細(xì)菌菌群與不同纖維素酶活冗余分析Fig.5 Redundancy analysis（RDA）of l microbial community structure and different types of cellulase

2.4 固體培養(yǎng)正交實驗

通過上述分析，確定以SLX 為下一步試驗菌群，通過正交試驗明確該菌群的固體培養(yǎng)方案，從表6 和表7 對于FPA 酶酶活各因素按極差大小主次順序為：C＞B＞A。與FPA 酶活對應(yīng)的R 值分別為 R1=1.02；R2=1.45；R3=2.37，表明接種量的比例對FPA 酶活的影響最大，F(xiàn)B=28.82＞F0.05=19，F(xiàn)c=68.89＞F0.05=19，表明 B、C 因素對 FPA酶活影響顯著。綜合以上分析，得到最佳培養(yǎng)基配方為A1B3C2。

表6 固體發(fā)酵正交試驗結(jié)果Table 6 Results of orthogonal solid fermentation

表7 固體發(fā)酵正交試驗方差分析結(jié)果Table 7 Analysis of variance of the orthogonal experiment of solid fermentation

正交試驗結(jié)果表明，麥麩∶秸稈粉的比例7∶3時為最佳配比，水料比的最佳比例為1∶1 時，接種量的最佳值為5%。

3 討論

3.1 不同處理對纖維素酶活性及秸稈降解率的影響

自然界中玉米秸稈的降解是由多種微生物菌株分泌多種木質(zhì)纖維酶協(xié)同完成的［29］。純培養(yǎng)單一的菌株產(chǎn)生的木質(zhì)纖維素酶種類較少［30］?，F(xiàn)階段，國內(nèi)外對人工復(fù)配菌群的研究主要集中于1~3 種純菌混合培養(yǎng)［31］，超過 4 種菌種混合培養(yǎng)的報道很少。同時，約有99%的微生物目前無法培養(yǎng)，所以人工復(fù)配的復(fù)合菌群并不完全符合自然狀態(tài)下木質(zhì)纖維素的分解條件和規(guī)律，其降解效率也不高。有一些學(xué)者，采集自然界原生態(tài)環(huán)境樣品為接種物，采用限制性富集培養(yǎng)條件，構(gòu)建了高效降解濾紙、水稻秸稈和紙漿廢物等的復(fù)合菌群［32~34］。目前對能夠高效降解玉米秸稈的低溫復(fù)合菌群的報道較少。

本試驗通過限制性培養(yǎng)條件和連續(xù)繼代培養(yǎng)，篩選獲得了一組高效穩(wěn)定分解玉米秸稈的復(fù)合菌群SLX。與馬欣雨等［19］分離篩選到的纖維素分解菌最適生長條件下（溫度：30 ℃、pH：7.5），液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)15 天秸稈降解率達到53.88%。進行比較本實驗篩選到復(fù)合菌群在溫度10 ℃條件下，玉米秸稈的分解率達到58.97%，具有更高的分解效率。SLX 菌群在15 d 內(nèi)產(chǎn)復(fù)合酶系，與陳晶晶［15］分離篩選到高活性纖維素分解菌菌株的CMC 酶活力最高，達25 U·mL-1，比較本試驗篩選到復(fù)合菌群CMC 酶活力達到10.48 U·mL-1，F(xiàn)PA酶活力達到 9.33 U·mL-1，C1 酶活力達到 5.24 U·mL-1，BG 酶活力達到 1.03 U·mL-1，酶活并不太高，屬于中等水平，這可能與培養(yǎng)溫度有關(guān)，目前對10 ℃低溫條件下獲得的產(chǎn)高纖維素酶活的菌株的研究報道較少。

發(fā)酵條件優(yōu)化試驗常用的設(shè)計方法有正交試驗設(shè)計法、響應(yīng)面設(shè)計法等，一般是由單因素試驗確定試驗因素與水平，后經(jīng)多因素設(shè)計試驗得出多因素試驗條件下的最優(yōu)組合，本實驗通過固體正交發(fā)酵培養(yǎng)實驗結(jié)果顯示：麥麩∶秸稈比例7∶3時為最佳配比，水料比最佳比例為1∶1，接種量最佳值為5%。本研究為菌系的后續(xù)固體發(fā)酵試驗奠定一了良好的基礎(chǔ)。

3.2 不同處理對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

本研究結(jié)果表明富集可以增加功能微生物的豐富度和多樣性［34~36］，4 個富集菌群豐度較高的主要類群有：變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、疣微菌門（Verruco-microbia）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、浮霉菌門（Planctomycetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、糖化菌門（Saccharibacteria）。

4 個 處 理 聚 類 為 2 大 類 ，以 SLA 和 SLW 為 一類，以 SLX 和 SLZ 分為一類，其中 SLX 種群豐富度在不同處理中最高，主要含有酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）擬桿菌門（Verrucomicrobia）的微生物菌株。其中放線菌門（Actinobacteria）的菌株具有優(yōu)異的纖維素水解能力，厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）是降解木質(zhì)素的功能群，芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）可能參與木質(zhì)素和環(huán)境污染物的降解，綠彎菌門（Chloroflexi）的菌種相對耐低溫，對冬季秸稈的降解具有促進作用。在屬分類上uncultured Acidobacteriaceae，uncultured Sphingomonas，為優(yōu)勢菌株。這說明可能存在某些新的菌種。

冗余分析結(jié)果表明不同微生物細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)對纖維素酶活性對有顯著影響，并可以解釋微生物群落結(jié)構(gòu)總變異的34.15%。C1、BG 位于第四象限，C1 與α-變形菌綱（Deltaproteobacteria）、BG與β-變形菌綱（Betaproteobacteria）表現(xiàn)正相關(guān)，其中變形菌綱是土壤細(xì)菌中的優(yōu)勢菌種，在森林土壤中是最豐富的細(xì)菌類群，相對豐度越高，物種和遺傳多樣性越豐富，具有廣泛的生理代謝功能，在土壤有機物質(zhì)分解、循環(huán)和能量轉(zhuǎn)化中起到了重要作用；CMCase 和FPA 位于第二象限，與酸桿菌門（Acidobacteria）表現(xiàn)正相關(guān)，其中酸桿菌門（Acidobacteria）的菌株具有優(yōu)異的纖維素水解能力，說明上述菌株是產(chǎn)生纖維素酶的主要菌綱。

4 結(jié)論

本試驗通過對4 組菌源樣品的不同纖維素酶活性、秸稈分解效率以及Alpha 多樣性、OTU 豐度和差異度、菌群種群結(jié)構(gòu)及含量進行測定，結(jié)果表明復(fù)合菌群SLX 具有高效穩(wěn)定分解玉米秸稈的能力。該菌群在15 d 內(nèi)產(chǎn)生復(fù)合纖維素酶系，對玉米秸稈的分解率達到58.97%。在限制性富集繼代培養(yǎng)過程中菌種組成多樣性較高，菌群結(jié)構(gòu)更加豐富、均勻。菌株主要為酸桿菌門（Acidobacteria）、放 線 菌 門（Actinobacteria）和 芽 單 胞 菌 門（Gemmatimonadetes），在種分類上，uncultured Ac?idobacteriaceae，uncultured Sphingomonas等 為 優(yōu)勢菌株。它們均直接或間接參與秸稈降解進程中的酶促反應(yīng)，外切β-葡聚糖酶（C1）與α-變形菌綱（Deltaproteobacteria）、β-葡萄糖苷酶（BG）與β-變形菌綱（Betaproteobacteria）表現(xiàn)正相關(guān)；內(nèi)切β-葡聚糖酶（CMCase）和濾紙酶（FPA）位于第二象限，與酸桿菌門（Acidobacteria）表現(xiàn)正相關(guān)。這可以解釋微生物群落結(jié)構(gòu)總變異的34.15%，菌群通過菌種之間的協(xié)同作用，共同維持了體系的穩(wěn)定。固體發(fā)酵培養(yǎng)試驗結(jié)果顯示：麥麩、秸稈粉的比例7∶3 時為最佳配比，水料比的最佳比例為 1∶1 時，接種量的最佳值為5%。研究結(jié)果為明確低溫秸稈降解菌群降解機理和提高纖維素降解效率提供了理論基礎(chǔ)。