基于密度調(diào)節(jié)的液液微萃取結(jié)合高效液相色譜測定藥茶、陳醋、汾酒中的雙酚A

荊旭 ，蔣海娟 ，白冰 ，王騰飛 ，武文英

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801；2.臨汾市公安司法鑒定中心，山西 臨汾 041000；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，山西 太谷 030801）

山西藥茶有著悠久歷史，是我國傳統(tǒng)醫(yī)藥學(xué)庫中藥茶的重要組成部分之一［1］，作為中國茶葉品牌的新成員，推出后便受到極大地關(guān)注。山西老陳醋是我四大名醋之首［2］，產(chǎn)銷量排名全中國第一，行業(yè)產(chǎn)值達(dá)30 多億元。汾酒作為中國“老四大名酒”之一，奠定了中國的白酒產(chǎn)業(yè)［3］。近年來汾酒的營收增幅很快，已經(jīng)引起全行業(yè)的廣泛關(guān)注。

雙酚A，由于其耐久性和熱穩(wěn)定性，通常用于制造作食品包裝、儲(chǔ)存和消費(fèi)的塑料容器［4］，是世界上使用量最多的工業(yè)化合物之一［5］，預(yù)期到2022年使用量將達(dá)到1 060 萬噸［6］。在高溫、酸性或堿性條件下，雙酚A 可從食品接觸材料及制品中浸出遷移進(jìn)入食品，最終隨食品進(jìn)入人體［7］。雙酚A具有難降解性，低劑量效應(yīng)和較強(qiáng)的親脂性，易于在生物體內(nèi)富集［8］。微量乃至痕量的雙酚A 能對(duì)人類造成長期的甚至多代的危害［9］，雙酚A 是一種典型的內(nèi)分泌干擾物。通常雙酚A 含量較低，儀器不易直接檢出，對(duì)其檢出的關(guān)鍵在于樣品前處理的效果［10］。

目前，許多新的食品樣品前處理技術(shù)被開發(fā)出來。液液微萃取是一種微型化的萃取技術(shù)，其優(yōu)點(diǎn)有操作速度快、溶劑使用量少、萃取高效等，在樣品制備領(lǐng)域得到了越來越多的應(yīng)用［11］，尤其是對(duì)于復(fù)雜基質(zhì)的痕量分析［12］。但是，傳統(tǒng)的液液微萃取技術(shù)往往使用氯仿、二氯乙烷等有害有機(jī)溶劑作為萃取劑，還需要使用超聲、渦旋、微波等儀器設(shè)備輔助提取，不僅對(duì)環(huán)境造成污染，危害人類的身體健康，而且具有耗時(shí)、步驟繁瑣的缺點(diǎn)［13］。因此，建立環(huán)境友好、快速高效的液液微萃取技術(shù)十分必要。

本文建立了一種環(huán)境友好、快速高效的基于密度調(diào)節(jié)的液液微萃取前處理分析方法。以生物衍生溶劑愈創(chuàng)木酚為環(huán)境友好的萃取劑，以鹽和水作為密度調(diào)節(jié)劑，通過調(diào)節(jié)密度實(shí)現(xiàn)萃取劑的“上浮-下沉”，促使萃取劑與樣品溶液充分反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)快速高效的萃取。萃取完成后，萃取劑位于下層，便于收集，使用高靈敏度的高效液相色譜-熒光檢測器測定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

安捷倫1260 高效液相色譜儀（配熒光檢測器）購買自美國安捷倫科技有限公司；

雙酚A（純度＞99.8%）、愈創(chuàng)木酚、氯化鉀、氯化鈉、硫酸銨、硝酸鈉、色譜純甲醇、乙腈購買自上海阿拉丁科技公司；

連翹藥茶樣品經(jīng)磨碎混勻后，準(zhǔn)確稱取0.5 g，加水100 mL，在80 ℃振搖恒溫水浴鍋中浸提45 min，冷卻后將浸提液離心、過濾，上清液混勻待用。山西老陳醋和汾酒樣品經(jīng)離心、過濾，上清液混勻待用。

1.2 色譜條件

進(jìn)樣量為20 μL，色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫為20 ℃，流動(dòng)相為乙腈∶水（40∶60 v/v），流速為0.5 mL·min-1，激發(fā)（發(fā)射）波長 282（313）nm，雙酚 A的保留時(shí)間為12 min。

1.3 萃取步驟

將150 μL 愈創(chuàng)木酚加入含有5 mL 樣品溶液的玻璃離心管中，隨后加入1 400 mg 氯化鉀，由于樣品溶液密度的改變，萃取劑愈創(chuàng)木酚在2 min 內(nèi)上浮到離心管的上端。隨后向溶液中加入4 mL水，萃取劑會(huì)在兩分鐘內(nèi)下沉到離心管的底部。完成萃取后，收集離心管底部的萃取劑，進(jìn)高效液相色譜-熒光檢測器檢測分析（圖1）。

圖1 基于密度調(diào)節(jié)的液液微萃取結(jié)合高效液相色譜測定雙酚A 的流程示意圖Fig.1 Schematic representation of the density-adiusted liquid-liquid microextraction combined with HPLC for the determination of bisphenol A

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

使用 SPSS 軟件（IBM SPSS Statistics 25）計(jì)算每個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，并在95%置信水平下進(jìn)行方差分析（ANOVA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取條件優(yōu)化

2.1.1 萃取劑體積的影響

萃取劑用量過少，會(huì)降低萃取效率；萃取劑用量過多，會(huì)降低富集倍數(shù)［14］。試驗(yàn)研究了愈創(chuàng)木酚體積分別為 100、150、200、250、300 和 350 μL 時(shí)對(duì)雙酚A 峰面積的影響（圖2）。結(jié)果表明，隨著萃取劑體積的增加，峰面積先增大后減少。當(dāng)愈創(chuàng)木酚的體積為150 μL 時(shí)，峰面積達(dá)到最大值。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇150 μL 作為萃取劑的體積。

圖2 萃取劑體積對(duì)峰面積的影響Fig.2 Effect of the volume of extractant on the peak areas

2.1.2 鹽種類的影響

在密度調(diào)節(jié)過程中，加鹽對(duì)于萃取劑的“上浮”起著決定性的作用。本實(shí)驗(yàn)研究了氯化鉀、氯化鈉、硫酸銨和硝酸鈉對(duì)雙酚A 峰面積的影響（圖3）。結(jié)果表明，使用氯化鉀時(shí)峰面積最大。這可能是由于鹽析作用和密度等因素共同影響了目標(biāo)物的萃?。?5］。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇氯化鉀作為最佳的密度調(diào)節(jié)劑。

圖3 鹽的種類對(duì)峰面積的影響Fig.3 Effect of types of salt on the peak areas

2.1.3 加鹽用量的影響

在調(diào)節(jié)密度的過程中，加鹽的用量會(huì)影響萃取效果。本實(shí)驗(yàn)研究了氯化鉀用量分別為1 300、1 400、1 500、1 600、1 700 和 1 800 mg 時(shí)，加鹽用量對(duì)雙酚A 峰面積的影響（圖4）。結(jié)果表明，隨著氯化鉀用量的增加，峰面積先上升后下降，當(dāng)氯化鉀用量為1 400 mg 時(shí)，峰面積最大。這可能是由于鹽的加入加快了萃取劑上浮的速度，而過多鹽的加入增加了溶液的粘度，產(chǎn)生了粘性阻力效應(yīng)［16］。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇1 400 mg 作為氯化鉀的用量。

圖4 加鹽用量對(duì)峰面積的影響Fig.4 Effect of the amount of salt added on the peak areas

2.1.4 加水體積的影響

在調(diào)節(jié)密度的過程中，加水體積是影響萃取劑“下沉”及分配的重要因素。本實(shí)驗(yàn)研究了加水體積分別為 3、4、5、6、7 和 8 mL 時(shí)，加水體積對(duì)雙酚A 峰面積的影響（圖5）。結(jié)果表明，當(dāng)加水體積為4 mL 時(shí)，峰面積最大。這可能是由于水體積的增大加快了提取劑的下沉的速度。當(dāng)加水的體積過多時(shí)，萃取劑中的目標(biāo)化合物重新分配進(jìn)入水中，從而峰面積變小。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇4 mL 作為加水的體積。

圖5 加水的體積對(duì)峰面積的影響Fig.5 Effect of the volume of water added on the peak areas

2.1.5 pH 的影響

pH 決定目標(biāo)分析物的電離程度，從而影響分配行為［17］。本試驗(yàn)研究了 pH 分別為 1、3、5、7、9 和11 時(shí)，pH 對(duì)雙酚A 峰面積的影響。結(jié)果表明，pH對(duì)萃取效果并沒有顯著的影響，因此樣品不需要調(diào)節(jié)pH。

2.2 方法評(píng)價(jià)

在最優(yōu)萃取條件下，對(duì)所建立方法的線性、檢出限和定量限進(jìn)行了評(píng)估。以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=60.648x+3.762，決定系數(shù)R2為 0.999，雙酚 A 在0.04~16 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。按照 3倍和10 倍信噪比分別計(jì)算雙酚A 的檢出限和定量限 ，雙 酚 A 在 3 種 基 質(zhì) 中 的 定 量 限 為 0.04 μg·mL-1，檢出限為 0.01 μg·mL-1。

2.3 實(shí)際樣品分析

應(yīng)用所建立的方法對(duì)藥茶、陳醋、汾酒3 種基質(zhì)中的雙酚A 含量進(jìn)行測定，結(jié)果顯示雙酚A 在空白基質(zhì)中均未檢出。為了考察方法的適用性，設(shè)置添加濃度為 0.1 和 10 μg·mL-1對(duì)雙酚 A 進(jìn)行測定（n=3）。由表 1 可知，雙酚 A 在藥茶、陳醋、汾酒3 種基質(zhì)中的加標(biāo)回收率為73.0%~87.5%，RSD 均在0.9%~3.5%之間，表明本方法正確度和精密度良好。

表1 樣品的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 1 Recovery and relative standard deviation of real samples

3 討論

民以食為天，隨著人們生活水平的提高，食品安全問題受到越來越多的關(guān)注［18］。預(yù)防并降低食品安全問題的發(fā)生有助于保障消費(fèi)者的身體健康。目前，山西藥茶、陳醋、汾酒已經(jīng)受到國內(nèi)外商客的廣泛青睞，安全性也備受廣大消費(fèi)者關(guān)注。雙酚A 屬于典型的內(nèi)分泌干擾物［19~21］，在食品包裝容器中廣泛存在［22］，但雙酚A 不易監(jiān)測，關(guān)鍵步驟在于樣品的前處理。因此，開發(fā)山西特色食品中雙酚A 前處理分析方法具有重要意義，建立環(huán)境友好、快速高效的有害物質(zhì)的前處理分析檢測方法十分必要。

本文以山西特色產(chǎn)品為樣品基質(zhì)，利用密度調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)萃取劑的“上浮-下沉”，檢測藥茶、陳醋、汾酒樣品中雙酚A 的含量。采用環(huán)境友好的生物衍生溶劑愈創(chuàng)木酚為萃取劑，利用密度調(diào)節(jié)的方法快速高效地完成萃取，不需要額外的輔助提取設(shè)備。所建立的方法是一種適用于食品樣品的環(huán)境友好、快速高效的前處理方法，為食品中有害物質(zhì)的前處理技術(shù)提供了新思路。

通過優(yōu)化萃取劑體積、鹽種類、加鹽用量、加水體積和pH 等影響因素，得到了最佳的萃取條件。雙酚 A 在 0.04~16 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出限為 0.01 μg·mL-1，回收率為 73.0%~87.5%，RSD 均在0.9%~3.5%之間，證明了本方法正確度和精密度良好，并已成功應(yīng)用于藥茶、陳醋和汾酒樣品中雙酚A 的測定。

4 結(jié)論

本文建立了一種基于密度調(diào)節(jié)的液液微萃取-高效液相色譜檢測雙酚A 含量的分析方法，并成功應(yīng)用于藥茶、陳醋和汾酒樣品。選取生物衍生溶劑愈創(chuàng)木酚作為環(huán)境友好的萃取劑，利用密度調(diào)節(jié)的方法實(shí)現(xiàn)了雙酚A 快速高效的提取，該方法具有良好的線性關(guān)系、正確度、精密度和實(shí)用價(jià)值。為食品中雙酚A 分析方法的開發(fā)提供了依據(jù)，為建立食品中有害物質(zhì)的環(huán)境友好、快速高效的前處理方法提供了參考。