LINC00598靶向調(diào)控miR-381-3p影響宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的機制研究

蔡 晶 巫夢雪 張 婷 王 琳

宮頸癌是一種常見的婦科惡性腫瘤，其發(fā)生率及病死率較高，且發(fā)病年齡有年輕化趨勢[1]。腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移是宮頸癌患者死亡的主要原因[2]。目前，手術(shù)治療、化療、免疫治療、放療等是其主要治療手段，然而部分患者的預(yù)后較差[3]。宮頸癌的發(fā)病機制并未完全闡明，探究宮頸癌進展的分子機制可能對其臨床治療具有重要意義。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度不少于200個核苷酸的內(nèi)源性RNA分子，其在不同腫瘤中的表達(dá)趨勢差異顯著，lncRNA通過參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)過程，影響腫瘤的發(fā)生和進展[4, 5]。

LINC00598在乳腺癌、結(jié)直腸癌、肝癌等腫瘤細(xì)胞系中高表達(dá)，可促進腫瘤細(xì)胞的增殖[6]。LINC00598在宮頸癌發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的作用機制并不清楚。本研究通過DIANA數(shù)據(jù)庫預(yù)測發(fā)現(xiàn)LINC00598與miR-381-3p存在靶向序列。Shang等[7]研究表明，miR-381-3p通過直接靶向成纖維細(xì)胞生長因子7(fibroblast growth factor 7，F(xiàn)GF7)抑制宮頸癌進展。本研究旨在檢測LINC00598在宮頸癌細(xì)胞系中的表達(dá)，通過在宮頸癌細(xì)胞系中沉默LINC00598表達(dá)，驗證LINC00598對miR-381-3p表達(dá)的調(diào)控作用及對宮頸癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響。

材料與方法

1.細(xì)胞與試劑:宮頸癌細(xì)胞C33A、HeLa、SiHa、HCC94及人正常宮頸上皮細(xì)胞H8購自美國標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物保藏中心。雙熒光素酶報告基因試劑盒購自美國Promega公司。胎牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Amresco公司。無意義陰性序列、LINC00598小分子干擾RNA(siRNA:GGAUGUCUACAUAGAUUUAGA)、熒光素酶報告載體(LINC00598野生型載體、LINC00598突變型載體)、miR-381-3p模擬物、miRNA陰性對照購自上海吉瑪生物制藥有限公司。qRT-PCR試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司。MTT試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司。Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司。Matrigel基質(zhì)膠、Transwell小室購自美國Corning公司。一抗FGF7、β-tubulin、RAS、p-ERK1、myc-1及山羊抗兔二抗均購自美國CST公司。

2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組:HeLa、SiHa、HCC94細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，C33A、H8細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。收集對數(shù)生長期HeLa細(xì)胞接種于24孔板，HeLa細(xì)胞生長融合至40%時，隨機分為對照組(轉(zhuǎn)染無意義陰性序列)和siRNA組(轉(zhuǎn)染LINC00598小分子干擾RNA)，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染。48h后，收集對數(shù)生長期HeLa細(xì)胞進行功能實驗。

3. qRT-PCR檢測LINC00598、miR-381-3p和FGF7 mRNA相對表達(dá):利用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成為cDNA。配置qRT-PCR反應(yīng)體系，LINC00598和FGF7 mRNA以GAPDH為內(nèi)參，miR-381-3p以U6為內(nèi)參。LINC00598上游引物為5′-GGGGGAAAACATGCA-GAAT-3′，下游引物為5′-TTCACACTCTGAG-AAGACAAGGAC-3′；U6上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-AACGCTTC-ACGAATTTGCGT-3′；miR-381-3p上游引物為5′-TACTTAAAGCGAGGTTGCCCTT-3′，下游引物為5′-GGCAAGCTCTCTGTGAGTA-3′；GAPDH上游引物為5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，下游引物為5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′；FGF7上游引物為5′-GCAACTGAACTTACTACGAACT-3′，下游引物為5′-ATTGACCTCTTCCTATCTGTGA-3′。采用2-ΔΔCt法計算LINC00598、miR-381-3p和FGF7 mRNA相對表達(dá)。

4.雙熒光素酶報告基因檢測驗證LINC00598的靶基因:運用DIANA數(shù)據(jù)庫預(yù)測LINC00598的靶基因為miR-381-3p。將熒光素酶報告載體(LINC00598野生型載體、LINC00598突變型載體)分別與miR-381-3p、miRNA陰性對照共轉(zhuǎn)染至宮頸癌HeLa細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞，通過雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測每組HeLa細(xì)胞的相對熒光素酶活性。

5.Western blot法檢測FGF7蛋白和RAS/ERK信號通路蛋白蛋白表達(dá):收集各組宮頸癌HeLa細(xì)胞，采用蛋白裂解液提取總蛋白，蛋白煮沸變性，每組取50μg蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜，在7%脫脂牛奶中封閉。稀釋一抗FGF7(1∶2000稀釋)、β-tubulin(1∶2000稀釋)、RAS(1∶2000稀釋)、p-ERK1(1∶2000)、myc-1(1∶2000)，4℃搖床孵育10h。稀釋二抗(1∶5000稀釋)，搖床孵育2h。配置電化學(xué)發(fā)光液，采用凝膠成像系統(tǒng)曝光和顯影。

6.MTT法檢測HeLa細(xì)胞增殖:收集各組宮頸癌HeLa細(xì)胞，消化為單細(xì)胞懸液，以200微升/孔細(xì)胞接種于96孔板。分別于第1、2、3、4、5天，向每孔加入5mg/ml的MTT試劑20μl。培養(yǎng)箱中孵育4h，吸去上清，加入140μl二甲基亞砜，震蕩15min，用全自動酶標(biāo)儀檢測波長450nm處各孔的吸光度(A)值，繪制HeLa細(xì)胞生長曲線。

7.Transwell實驗檢測HeLa細(xì)胞侵襲:采用預(yù)冷的培養(yǎng)基按照8∶1的比例稀釋Matrigel膠，在Transwell小室上室加入30μl稀釋液，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3h。收集各組宮頸癌HeLa細(xì)胞，用不含胎牛血清的培養(yǎng)基稀釋成單細(xì)胞懸液，以200微升/孔加入Transwell小室上室，下室加入含胎牛血清的培養(yǎng)基600μl。培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，采用多聚甲醛溶液固定40min，采用0.2%結(jié)晶紫溶液染色40min，棉簽擦去未侵襲的HeLa細(xì)胞，在100倍倒置顯微鏡下計數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)。

結(jié) 果

1. LINC00598與宮頸癌患者總生存期的關(guān)系:GEPIA在線數(shù)據(jù)庫顯示(圖1)，LINC00598低表達(dá)的宮頸癌患者總生存期明顯長于LINC00598高表達(dá)的患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖1 LINC00598與宮頸癌患者總生存期的關(guān)系

2.LINC00598在宮頸癌細(xì)胞系中低表達(dá):qRT-PCR檢測結(jié)果顯示(圖2)，LINC00598在宮頸癌細(xì)胞(C33A、HeLa、SiHa、HCC94)及正常宮頸上皮細(xì)胞H8的表達(dá)分別為4.96±0.28、7.36±0.46、2.41±0.51、4.30±0.50和1.05±0.10。與H8細(xì)胞比較，宮頸癌細(xì)胞系中LINC00598表達(dá)顯著升高(P<0.05)，其中LINC00598表達(dá)最高的細(xì)胞系是HeLa(P<0.01)。

圖2 LINC00598在宮頸癌細(xì)胞系和正常宮頸上皮細(xì)胞中的表達(dá)與H8細(xì)胞比較，*P<0.05，**P<0.01

3.轉(zhuǎn)染LINC00598小分子干擾RNA抑制HeLa細(xì)胞中LINC00598表達(dá):轉(zhuǎn)染LINC00598小分子干擾RNA后，siRNA組和對照組HeLa細(xì)胞中LINC00598表達(dá)分別為0.27±0.04和1.05±0.19，提示轉(zhuǎn)染成功(P<0.01)。

4.生物信息學(xué)軟件預(yù)測LINC00598的靶基因:DIANA數(shù)據(jù)庫預(yù)測顯示(圖3)，LINC00598與miR-381-3p存在靶向序列。

圖3 DIANA數(shù)據(jù)庫預(yù)測LINC00598的靶基因

5.雙熒光素酶報告基因檢測驗證LINC00598對miR-381-3p的靶向作用:雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示(圖4)，在轉(zhuǎn)染LINC00598野生型載體實驗中，miR-381-3p組相對熒光素酶活性顯著低于miRNA陰性對照組(P<0.01)。

圖4 雙熒光素酶報告基因法驗證LINC00598對miR-381-3p的靶向作用與miRNA陰性對照組比較，*P<0.01

6.沉默LINC00598對miR-381-3p和FGF7 mRNA表達(dá)的影響:qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，siRNA組和對照組HeLa細(xì)胞中miR-381-3p表達(dá)分別為6.74±1.49和1.01±0.22，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。siRNA組和對照組HeLa細(xì)胞中FGF7 mRNA表達(dá)分別為0.28±0.07和0.98±0.09，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

7.沉默LINC00598對FGF7蛋白和RAS/ERK信號通路蛋白表達(dá)的影響:Western blot法檢測結(jié)果顯示(圖5)，沉默LINC00598表達(dá)后，F(xiàn)GF7蛋白表達(dá)降低，RAS/ERK信號通路蛋白RAS、p-ERK1、myc-1表達(dá)增加，間質(zhì)細(xì)胞表型蛋白Twist表達(dá)降低。

圖5 沉默LINC00598對HeLa細(xì)胞FGF7蛋白和RAS/ERK信號通路蛋白表達(dá)的影響

8.沉默LINC00598對HeLa細(xì)胞增殖活力的影響:MTT法結(jié)果顯示(圖6)，在第2、3、4、5天，siRNA組HeLa細(xì)胞A值明顯低于對照組(P<0.05)。

圖6 沉默LINC00598對HeLa細(xì)胞增殖活力的影響與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

9.沉默LINC00598對HeLa細(xì)胞侵襲能力的影響:Transwell實驗結(jié)果顯示，siRNA組和對照組HeLa細(xì)胞的穿膠細(xì)胞數(shù)分別為95.47±13.18個和192.14±18.72個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖7)。

圖7 沉默LINC00598對HeLa細(xì)胞侵襲能力的影響A.Transwell實驗穿膠細(xì)胞(結(jié)晶紫染色，×100)；B.Transwell實驗定量結(jié)果

討 論

既往研究表明，部分lncRNA如LINC00116、MIAT、FTH1P3、PVT1在宮頸癌組織中異常高表達(dá)，通過調(diào)控抑癌基因的失活，增強宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，促進宮頸癌的惡性進展[8～11]。部分lnRNA如PTENP1、HAND2-AS1、UBE2R2-AS1、PTCSC3在宮頸癌組織中異常低表達(dá)，通過抑制癌基因的激活，降低細(xì)胞增殖活性，促進宮頸癌細(xì)胞凋亡[12～15]。因而，積極研究lncRNA在宮頸癌發(fā)生和發(fā)展過程中的作用機制，對改善宮頸癌臨床治療效果具有重要意義。Ghatnatti等[16]研究表明，LINC00598在垂體泌乳素瘤中高表達(dá)，其可能成為垂體泌乳素瘤發(fā)病機制的新型生物學(xué)標(biāo)志物。Jeong等[6]研究表明，LINC00598在多種腫瘤細(xì)胞系中高表達(dá)，其可通過促進細(xì)胞周期蛋白2轉(zhuǎn)錄的穩(wěn)定性，促進腫瘤細(xì)胞的增殖。本研究通過GEPIA在線數(shù)據(jù)庫分析顯示，LINC00598低表達(dá)的宮頸癌患者總生存期明顯長于LINC00598高表達(dá)的患者，LINC00598低表達(dá)與患者生存期存在相關(guān)性。同時，本研究結(jié)果顯示不同宮頸癌細(xì)胞系中LINC00598表達(dá)均明顯增加，提示LINC00598在宮頸癌發(fā)生過程可能起到關(guān)鍵作用。細(xì)胞實驗結(jié)果進一步顯示，沉默LINC00598表達(dá)可抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖和侵襲能力，提示LINC00598能夠抑制宮頸癌進展。

lnRNA主要通過與miRNA的相互作用，抑制miRNA對下游靶基因表達(dá)的干擾，參與宮頸癌的進程[17]。本研究通過DIANA數(shù)據(jù)庫預(yù)測顯示，LINC00598與miR-381-3p存在結(jié)合位點。同時，雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實LINC00598可靶向調(diào)控miR-381-3p表達(dá)。miR-381-3p在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌、骨肉瘤等腫瘤中低表達(dá)，發(fā)揮抑癌作用[18,19]。miR-381-3p在宮頸癌組織和細(xì)胞系中呈低表達(dá)，miR-381-3p通過抑制靶基因FGF7表達(dá)，抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，促進宮頸癌細(xì)胞的凋亡[7]。本研究結(jié)果顯示，沉默LINC00598表達(dá)后，宮頸癌HeLa細(xì)胞中miR-381-3p表達(dá)顯著增加，說明沉默LINC00598通過上調(diào)miR-381-3p表達(dá)改善宮頸癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。本研究結(jié)果顯示，沉默LINC00598表達(dá)可顯著促進宮頸癌HeLa細(xì)胞中FGF7基因的表達(dá)，進一步證明LINC00598通過調(diào)節(jié)miR-381-3p表達(dá)發(fā)揮作用。RAS/ERK信號通路在宮頸癌細(xì)胞中激活，促進宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展[20]。FGF7基因表達(dá)降低后，RAS/ERK信號通路激活受到抑制。

綜上所述，LINC00598在宮頸癌細(xì)胞系中高表達(dá)，沉默LINC00598表達(dá)可靶向上調(diào)miR-381-3p表達(dá)并且下調(diào)FGF7基因表達(dá)，抑制RAS/ERK信號通路激活，進而影響宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖及侵襲過程。LINC00598有望成為宮頸癌診斷和治療的分子靶點。