韓 雪 韓東宛 刁宗禮 黃紅東 劉文虎
研究表明,糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是一種慢性免疫炎性疾病,巨噬細胞活化在DN炎性過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[1]。巨噬細胞浸潤、細胞信號及細胞因子共同參與了DN的發(fā)生、發(fā)展過程[2]。
干擾素基因激活蛋白(stimulator of interferon genes,STING)是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白,環(huán)鳥苷酸-腺苷酸合成酶(cyclic GMP-AMP synthase,cGAS)能夠激活STING,cGAS-STING信號通路可通過調(diào)控多種細胞信號表達引發(fā)固有免疫應(yīng)答及炎性反應(yīng),是多種慢性免疫炎性疾病的潛在發(fā)病機制[3~5]。目前該信號通路在DN中的作用尚不清楚。
本研究在人體及細胞水平觀察高糖環(huán)境下,巨噬細胞cGAS-STING信號通路的表達情況,并明確該通路對巨噬細胞活化的影響,初步探討cGAS-STING信號通路在DN慢性炎性反應(yīng)過程中可能的生物學功能。
1.主要材料:小鼠單核-吞噬細胞系RAW264.7購自美國ATCC公司;DMEM培養(yǎng)基等購自美國Gibco公司;cGAS抗體、STING抗體、p65 NF-κB及p-p65 NF-κB等抗體購自美國CST公司;CD11b、F4/80、CD86、CD206等流式抗體購自美國Biolegend公司;STING抑制劑C-176購自美國MCE公司;引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司。
2.免疫組織化學實驗:以瘤旁正常腎組織為對照,檢測DN患者腎組織M1型巨噬細胞標志物CD86及STING的表達。石蠟切片脫蠟、水化、自來水沖洗、對組織進行抗原修復;加用非特異染色阻斷劑室溫孵育10min;除去阻斷劑后加入一抗室溫孵育60min;加入二抗室溫孵育10min;DAB染色液顯色、核固紅復染、封片。
3.免疫熒光雙染實驗:以瘤旁正常腎組織為對照,檢測DN患者腎組織M1型巨噬細胞標志物CD86及STING的表達。石蠟切片脫蠟、水化、自來水沖洗、對組織進行抗原修復;0.5%Triton X-100室溫下通透20min,5%BSA室溫封閉30min;加入STING一抗4℃孵育過夜;加入二抗室溫孵育60min,5%BSA室溫封閉30min;加入CD86一抗4℃孵育過夜;再加入二抗室溫孵育60min;沖洗、封片、4℃保存。
4.細胞培養(yǎng)及分組:細胞以4×104個/毫升的濃度接種于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基,在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細胞生長至80%融合狀態(tài)時,0.25%胰蛋白酶消化進行傳代。細胞分組:①正常對照組(NG組):培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為5.5mmol/L;②高糖組(HG組):培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為30mmol/L;③HG+C-176組:STING抑制劑C-176的濃度為1μmol/L;④NG+C-176 組: C-176濃度為1μmol/L。
5.Western blot法檢測:胰酶消化細胞,向細胞沉淀中加入蛋白酶抑制劑和細胞裂解液(二者比例為1∶100),BCA法測定樣本蛋白濃度;根據(jù)目的蛋白相對分子質(zhì)量,配制分離膠、濃縮膠;經(jīng)歷上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜后將膜完全浸沒于5%脫脂奶粉中,搖床孵育1h;然后將膜與相應(yīng)一抗一起孵育,4℃過夜;將膜與二抗一起孵育,室溫40min;最后曝光、定影。
6.RT-PCR實驗:應(yīng)用Trizol法提取細胞總mRNA,采用20 μl反轉(zhuǎn)錄體系獲得cDNA。用RT-PCR法檢測擴增基因片段,反應(yīng)條件:第1步50℃ 2min,第2步95℃ 10min,第3步95℃ 15s,第4步60℃ 1min,擴增40個循環(huán)。以熒光強度為縱坐標,循環(huán)數(shù)為橫坐標,繪制曲線,計算閾值。cGAS上游引物為5′-ATCTGCCTGCTTCTGCCATTGG-3′,下游引物為5′-GCGTGAGGACTTGAGTTGAGACC-3′;STING上游引物為5′-CCAAGAACCCACAGACGGAAACAG-3′,下游引物為5′-TCAGATGAGGTCAGTGCGGAGTG-3′;p65 NF-κB上游引物為5′-GGCTACACAGGACCAGGAACAGT-3′,下游引物為5′-TTGCTCCAGGT-CTCGCTTCTTCA-3′;TNF-α上游引物為5′-TAACTTAGAAAGGGGATTATGGCT-3′,下游引物為5′-TGGAAAGGTCTGAAGGTAGGAA-3′;IL-1β上游引物為5′-ACAAGGAGAACCAAGCAACGACAA-3′,下游引物為5′-TGTGAGGTGCTGATGTACCAGTTG-3′。
7.流式細胞術(shù)實驗:消化細胞,離心,PBS重懸,吸取細胞懸液于流式管內(nèi),冰上孵育30min,應(yīng)用流式表面抗體F4/80、CD11b、CD86標記M1型巨噬細胞, 應(yīng)用F4/80、CD11b、CD206標記M2型巨噬細胞,添加熒光一抗,避光4℃孵育30min,洗滌,4℃,1000r/min,離心5min除去未結(jié)合的抗體,PBS重懸細胞沉淀后上流式細胞儀檢測。
1.STING在DN患者腎臟的表達及定位:免疫組織化學結(jié)果顯示,與NG組比較,DN患者腎臟CD86+M1型巨噬細胞明顯浸潤、STING表達量明顯增加(圖1A);免疫熒光雙染結(jié)果顯示,與NG組比較,DN患者腎臟CD86+M1型巨噬細胞明顯浸潤、STING表達量明顯增加,且二者存在共定位(圖1B)。
圖1 正常對照及DN患者腎組織M1型巨噬細胞標志物CD86及STING的表達A.免疫組織化學法;B.免疫熒光雙染法(×1000)
2.cGAS-STING信號通路對巨噬細胞活化表型的影響:流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,與NG組比較,HG組巨噬細胞主要向M1型(F4/80、CD11b、CD86陽性)巨噬細胞轉(zhuǎn)化,其比例明顯增加,STING抑制劑C-176可明顯降低HG組M1型巨噬細胞的比例,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖2)。各組M2型巨噬細胞比例比較,差異無統(tǒng)計學意義。
3.cGAS-STING信號通路對下游p-p65 NF-κB表達的影響:Western blot法檢測及RT-PCR結(jié)果表明,HG組巨噬細胞cGAS、STING、p-p65 NF-κB的蛋白表達及mRNA表達量均明顯高于NG組,STING抑制劑C-176可明顯抑制STING、p-p65 NF-κB的蛋白及mRNA表達水平,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖3和圖4)。
圖3 STING抑制劑C-176對cGAS-STING及p-p65 NF-κB蛋白表達的影響A.Western blot法檢測結(jié)果;B.cGAS相對表達量; C.STING相對表達量;D.p-p65 NF-κB相對表達量。與NG組比較,*P<0.05;與HG組比較,#P<0.05
圖4 STING抑制劑C-176對cGAS-STING及p-p65 NF-κB mRNA表達的影響A.cGAS 相對表達量;B.STING相對表達量;C.p-p65 NF-κB 相對表達量。與NG組比較,*P<0.05;與HG組比較,#P<0.05
4.cGAS-STING信號通路對下游炎性細胞因子表達的影響:RT-PCR結(jié)果表明HG組巨噬細胞炎性細胞因子TNF-α和IL-1β的mRNA表達量均明顯高于NG組,STING抑制劑C-176可明顯抑制上述兩種指標的表達,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖5)。
圖5 STING抑制劑C-176對炎性細胞因子表達的影響(RT-PCR)A.TNF-α 相對表達量; B.IL-1β 相對表達量。與NG組比較,*P<0.05;與HG組比較,#P<0.05
DN是糖尿病最嚴重的微血管并發(fā)癥之一,DN導致的慢性腎衰竭已成為血液透析和腎移植的首位病因[6]。研究其發(fā)病機制、尋找新的治療靶點具有重大意義。
DN診斷標準:有明確DM病史,同時與尿蛋白、腎功能變化存在因果關(guān)系,并排除其他原發(fā)性、繼發(fā)性腎小球疾病與系統(tǒng)性疾病,符合以下3種情況之一者,可診斷DN。3種情況為隨機尿白蛋白/肌酐比值≥30mg/g或尿白蛋白排泄率≥30mg/24h,且在3~6個月內(nèi)重復檢查,3次中有2次達到或超過臨界值,并排除感染等其他干擾因素;估算腎小球濾過率<60ml/(min·1.73m2) 3個月以上;腎活檢符合DN病理改變[7]。
腎臟慢性微炎性狀態(tài)已被證實參與了DN的發(fā)生、發(fā)展過程[1]。巨噬細胞活化在DN的炎性過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,DN早期,巨噬細胞作為最主要的炎性細胞浸潤在腎臟組織中。在DN中造成腎臟損傷的巨噬細胞主要是M1型巨噬細胞,主要表現(xiàn)為促炎、促損傷作用,其標志物主要有iNOS、CD11c、CD68、CD86等。M2型巨噬細胞在主要發(fā)揮抗炎及促進組織修復的作用,標志物主要有Arg-1、CD206、CD11b等[2, 8]。NF-κB 信號通路是參與DN巨噬細胞活化的主要胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路。在體內(nèi)持續(xù)高糖刺激下,成熟巨噬細胞活化為M1型巨噬細胞,NF-κB信號通路被激活后釋放大量炎性細胞因子如TNF-α、IL-1β等,進而誘導腎臟局部慢性炎性反應(yīng),促使腎小球系膜細胞基質(zhì)增生、成纖維細胞增殖、足細胞損傷等病理過程,最終加速腎臟纖維化[9, 10]。
STING在多種細胞中普遍表達,如巨噬細胞、內(nèi)皮細胞、上皮細胞等[3]。最初對STING的研究主要集中在微生物感染性疾病,STING的激活始動于細胞質(zhì)內(nèi)異常DNA,如細菌及病毒DNA,cGAS能夠識別并結(jié)合異常DNA,通過自身結(jié)構(gòu)改變分解DNA合成環(huán)磷酸鳥苷酸腺苷酸,隨后激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的STING,活化的STING離開內(nèi)質(zhì)網(wǎng),移動到細胞核周圍,誘導Ⅰ型干擾素表達,最終引發(fā)固有免疫應(yīng)答及炎性反應(yīng)[4, 11]。此外,STING還可直接激活NF-κB信號通路促進炎性反應(yīng)[12]。研究表明cGAS-STING通路的激活可能是多種慢性免疫炎性疾病的發(fā)病機制,如惡性腫瘤、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、急性胰腺炎等[13~15]。動物實驗表明抑制STING活性可明顯改善急性心肌梗死后小鼠的病理性心肌重塑[16]。在脂肪肝炎小鼠模型中,肝臟巨噬細胞STING表達增加,STING可通過介導巨噬細胞活化激活NF-κB信號通路、促進炎性細胞因子表達,誘發(fā)肝臟炎性及纖維化[17]。
目前cGAS-STING信號通路是否參與DN的調(diào)控尚不清楚,筆者推測在DN慢性微炎性狀態(tài)下,腎臟cGAS-STING通路極有可能表達上調(diào)。為驗證該假設(shè),本研究檢測DN患者腎組織STING的免疫組織化學表達水平,并利用免疫熒光雙染技術(shù)對STING及巨噬細胞進行定位,結(jié)果表明DN患者腎臟CD86+M1型巨噬細胞明顯浸潤、STING表達量明顯增加,且二者存在共定位。為進一步明確巨噬細胞cGAS-STING通路在DN中的作用,本研究應(yīng)用Western blot法、RT-PCR等技術(shù)對小鼠巨噬細胞RAW264.7進行體外實驗,給予高糖刺激,結(jié)果表明高糖環(huán)境下,巨噬細胞cGAS-STING信號通路被激活、巨噬細胞向M1型活化,同時p-p65 NF-κB信號蛋白表達上調(diào)、炎性細胞因子TNF-α和IL-1β釋放增加;加入STING抑制劑C-176可明顯抑制M1型巨噬細胞活化及下游炎性蛋白、炎性細胞因子的表達。以上結(jié)果證實,高糖環(huán)境下,巨噬細胞cGAS-STING信號通路被激活,該通路可進一步促進M1型巨噬細胞活化及下游炎性反應(yīng)。但高糖環(huán)境下cGAS-STING被激活的分子生物學機制目前仍不清楚。線粒體功能障礙已被證實參與DN的發(fā)生、發(fā)展,與高糖誘導的氧化應(yīng)激有關(guān)[18~20]。cGAS-STING通路可被線粒體損傷釋放入胞質(zhì)的線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)所激活[21]。因此推測,高糖環(huán)境下巨噬細胞極有可能發(fā)生線粒體功能障礙,隨之mtDNA逃逸至胞質(zhì)激活cGAS-STING信號通路,進而介導巨噬細胞活化。今后課題組擬進一步完成高糖環(huán)境下巨噬細胞的線粒體功能檢測。
綜上所述,本研究在人體水平證實STING在DN患者腎臟M1型巨噬細胞中表達上調(diào)。進一步通過細胞水平表明高糖環(huán)境下,cGAS-STING通路被激活并介導M1型巨噬細胞活化,進而促進下游炎性反應(yīng)。
本研究探索cGAS-STING信號通路在DN慢性免疫炎性反應(yīng)過程中的作用,初步闡明cGAS-STING介導巨噬細胞活化、促進下游炎性反應(yīng)的生物學功能。今后將繼續(xù)探討該通路介導巨噬細胞活化的分子生物學機制,并進行動物實驗進一步加以驗證。該研究擬為DN的分子免疫治療提供新的理論依據(jù)和實驗數(shù)據(jù)。