高糖環(huán)境下cGAS-STING通路在巨噬細(xì)胞活化中的作用

韓 雪 韓東宛 刁宗禮 黃紅東 劉文虎

研究表明，糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是一種慢性免疫炎性疾病，巨噬細(xì)胞活化在DN炎性過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[1]。巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞信號(hào)及細(xì)胞因子共同參與了DN的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程[2]。

干擾素基因激活蛋白(stimulator of interferon genes，STING)是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白，環(huán)鳥(niǎo)苷酸-腺苷酸合成酶(cyclic GMP-AMP synthase，cGAS)能夠激活STING，cGAS-STING信號(hào)通路可通過(guò)調(diào)控多種細(xì)胞信號(hào)表達(dá)引發(fā)固有免疫應(yīng)答及炎性反應(yīng)，是多種慢性免疫炎性疾病的潛在發(fā)病機(jī)制[3～5]。目前該信號(hào)通路在DN中的作用尚不清楚。

本研究在人體及細(xì)胞水平觀察高糖環(huán)境下，巨噬細(xì)胞cGAS-STING信號(hào)通路的表達(dá)情況，并明確該通路對(duì)巨噬細(xì)胞活化的影響，初步探討cGAS-STING信號(hào)通路在DN慢性炎性反應(yīng)過(guò)程中可能的生物學(xué)功能。

材料與方法

1.主要材料：小鼠單核-吞噬細(xì)胞系RAW264.7購(gòu)自美國(guó)ATCC公司；DMEM培養(yǎng)基等購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；cGAS抗體、STING抗體、p65 NF-κB及p-p65 NF-κB等抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；CD11b、F4/80、CD86、CD206等流式抗體購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司；STING抑制劑C-176購(gòu)自美國(guó)MCE公司；引物購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

2.免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)：以瘤旁正常腎組織為對(duì)照，檢測(cè)DN患者腎組織M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD86及STING的表達(dá)。石蠟切片脫蠟、水化、自來(lái)水沖洗、對(duì)組織進(jìn)行抗原修復(fù)；加用非特異染色阻斷劑室溫孵育10min；除去阻斷劑后加入一抗室溫孵育60min；加入二抗室溫孵育10min；DAB染色液顯色、核固紅復(fù)染、封片。

3.免疫熒光雙染實(shí)驗(yàn)：以瘤旁正常腎組織為對(duì)照，檢測(cè)DN患者腎組織M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD86及STING的表達(dá)。石蠟切片脫蠟、水化、自來(lái)水沖洗、對(duì)組織進(jìn)行抗原修復(fù)；0.5%Triton X-100室溫下通透20min，5%BSA室溫封閉30min；加入STING一抗4℃孵育過(guò)夜；加入二抗室溫孵育60min，5%BSA室溫封閉30min；加入CD86一抗4℃孵育過(guò)夜；再加入二抗室溫孵育60min；沖洗、封片、4℃保存。

4.細(xì)胞培養(yǎng)及分組：細(xì)胞以4×104個(gè)/毫升的濃度接種于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合狀態(tài)時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化進(jìn)行傳代。細(xì)胞分組：①正常對(duì)照組(NG組)：培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為5.5mmol/L；②高糖組(HG組)：培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為30mmol/L;③HG+C-176組：STING抑制劑C-176的濃度為1μmol/L；④NG+C-176 組: C-176濃度為1μmol/L。

5.Western blot法檢測(cè)：胰酶消化細(xì)胞，向細(xì)胞沉淀中加入蛋白酶抑制劑和細(xì)胞裂解液(二者比例為1∶100)，BCA法測(cè)定樣本蛋白濃度；根據(jù)目的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量，配制分離膠、濃縮膠；經(jīng)歷上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜后將膜完全浸沒(méi)于5%脫脂奶粉中，搖床孵育1h；然后將膜與相應(yīng)一抗一起孵育，4℃過(guò)夜；將膜與二抗一起孵育，室溫40min；最后曝光、定影。

6.RT-PCR實(shí)驗(yàn)：應(yīng)用Trizol法提取細(xì)胞總mRNA，采用20 μl反轉(zhuǎn)錄體系獲得cDNA。用RT-PCR法檢測(cè)擴(kuò)增基因片段，反應(yīng)條件：第1步50℃ 2min，第2步95℃ 10min，第3步95℃ 15s，第4步60℃ 1min，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，循環(huán)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制曲線，計(jì)算閾值。cGAS上游引物為5′-ATCTGCCTGCTTCTGCCATTGG-3′，下游引物為5′-GCGTGAGGACTTGAGTTGAGACC-3′；STING上游引物為5′-CCAAGAACCCACAGACGGAAACAG-3′，下游引物為5′-TCAGATGAGGTCAGTGCGGAGTG-3′；p65 NF-κB上游引物為5′-GGCTACACAGGACCAGGAACAGT-3′，下游引物為5′-TTGCTCCAGGT-CTCGCTTCTTCA-3′；TNF-α上游引物為5′-TAACTTAGAAAGGGGATTATGGCT-3′，下游引物為5′-TGGAAAGGTCTGAAGGTAGGAA-3′；IL-1β上游引物為5′-ACAAGGAGAACCAAGCAACGACAA-3′，下游引物為5′-TGTGAGGTGCTGATGTACCAGTTG-3′。

7.流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)：消化細(xì)胞，離心，PBS重懸，吸取細(xì)胞懸液于流式管內(nèi)，冰上孵育30min，應(yīng)用流式表面抗體F4/80、CD11b、CD86標(biāo)記M1型巨噬細(xì)胞, 應(yīng)用F4/80、CD11b、CD206標(biāo)記M2型巨噬細(xì)胞，添加熒光一抗，避光4℃孵育30min，洗滌，4℃，1000r/min，離心5min除去未結(jié)合的抗體，PBS重懸細(xì)胞沉淀后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

結(jié) 果

1.STING在DN患者腎臟的表達(dá)及定位：免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，與NG組比較，DN患者腎臟CD86+M1型巨噬細(xì)胞明顯浸潤(rùn)、STING表達(dá)量明顯增加(圖1A)；免疫熒光雙染結(jié)果顯示，與NG組比較，DN患者腎臟CD86+M1型巨噬細(xì)胞明顯浸潤(rùn)、STING表達(dá)量明顯增加，且二者存在共定位(圖1B)。

圖1 正常對(duì)照及DN患者腎組織M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD86及STING的表達(dá)A.免疫組織化學(xué)法；B.免疫熒光雙染法(×1000)

2.cGAS-STING信號(hào)通路對(duì)巨噬細(xì)胞活化表型的影響：流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與NG組比較，HG組巨噬細(xì)胞主要向M1型(F4/80、CD11b、CD86陽(yáng)性)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化，其比例明顯增加，STING抑制劑C-176可明顯降低HG組M1型巨噬細(xì)胞的比例，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。各組M2型巨噬細(xì)胞比例比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.cGAS-STING信號(hào)通路對(duì)下游p-p65 NF-κB表達(dá)的影響：Western blot法檢測(cè)及RT-PCR結(jié)果表明，HG組巨噬細(xì)胞cGAS、STING、p-p65 NF-κB的蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)量均明顯高于NG組，STING抑制劑C-176可明顯抑制STING、p-p65 NF-κB的蛋白及mRNA表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3和圖4)。

圖3 STING抑制劑C-176對(duì)cGAS-STING及p-p65 NF-κB蛋白表達(dá)的影響A.Western blot法檢測(cè)結(jié)果；B.cGAS相對(duì)表達(dá)量; C.STING相對(duì)表達(dá)量；D.p-p65 NF-κB相對(duì)表達(dá)量。與NG組比較，*P<0.05；與HG組比較，#P<0.05

圖4 STING抑制劑C-176對(duì)cGAS-STING及p-p65 NF-κB mRNA表達(dá)的影響A.cGAS 相對(duì)表達(dá)量;B.STING相對(duì)表達(dá)量；C.p-p65 NF-κB 相對(duì)表達(dá)量。與NG組比較，*P<0.05；與HG組比較，#P<0.05

4.cGAS-STING信號(hào)通路對(duì)下游炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響：RT-PCR結(jié)果表明HG組巨噬細(xì)胞炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β的mRNA表達(dá)量均明顯高于NG組，STING抑制劑C-176可明顯抑制上述兩種指標(biāo)的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖5)。

圖5 STING抑制劑C-176對(duì)炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響(RT-PCR)A.TNF-α 相對(duì)表達(dá)量; B.IL-1β 相對(duì)表達(dá)量。與NG組比較，*P<0.05；與HG組比較，#P<0.05

討 論

DN是糖尿病最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，DN導(dǎo)致的慢性腎衰竭已成為血液透析和腎移植的首位病因[6]。研究其發(fā)病機(jī)制、尋找新的治療靶點(diǎn)具有重大意義。

DN診斷標(biāo)準(zhǔn)：有明確DM病史，同時(shí)與尿蛋白、腎功能變化存在因果關(guān)系，并排除其他原發(fā)性、繼發(fā)性腎小球疾病與系統(tǒng)性疾病，符合以下3種情況之一者，可診斷DN。3種情況為隨機(jī)尿白蛋白/肌酐比值≥30mg/g或尿白蛋白排泄率≥30mg/24h，且在3～6個(gè)月內(nèi)重復(fù)檢查，3次中有2次達(dá)到或超過(guò)臨界值，并排除感染等其他干擾因素；估算腎小球?yàn)V過(guò)率<60ml/(min·1.73m2) 3個(gè)月以上；腎活檢符合DN病理改變[7]。

腎臟慢性微炎性狀態(tài)已被證實(shí)參與了DN的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程[1]。巨噬細(xì)胞活化在DN的炎性過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，DN早期，巨噬細(xì)胞作為最主要的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)在腎臟組織中。在DN中造成腎臟損傷的巨噬細(xì)胞主要是M1型巨噬細(xì)胞，主要表現(xiàn)為促炎、促損傷作用，其標(biāo)志物主要有iNOS、CD11c、CD68、CD86等。M2型巨噬細(xì)胞在主要發(fā)揮抗炎及促進(jìn)組織修復(fù)的作用，標(biāo)志物主要有Arg-1、CD206、CD11b等[2, 8]。NF-κB 信號(hào)通路是參與DN巨噬細(xì)胞活化的主要胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。在體內(nèi)持續(xù)高糖刺激下，成熟巨噬細(xì)胞活化為M1型巨噬細(xì)胞，NF-κB信號(hào)通路被激活后釋放大量炎性細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β等，進(jìn)而誘導(dǎo)腎臟局部慢性炎性反應(yīng)，促使腎小球系膜細(xì)胞基質(zhì)增生、成纖維細(xì)胞增殖、足細(xì)胞損傷等病理過(guò)程，最終加速腎臟纖維化[9, 10]。

STING在多種細(xì)胞中普遍表達(dá)，如巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞等[3]。最初對(duì)STING的研究主要集中在微生物感染性疾病，STING的激活始動(dòng)于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)異常DNA，如細(xì)菌及病毒DNA，cGAS能夠識(shí)別并結(jié)合異常DNA，通過(guò)自身結(jié)構(gòu)改變分解DNA合成環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷酸腺苷酸，隨后激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的STING，活化的STING離開(kāi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，移動(dòng)到細(xì)胞核周圍，誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素表達(dá)，最終引發(fā)固有免疫應(yīng)答及炎性反應(yīng)[4, 11]。此外，STING還可直接激活NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)炎性反應(yīng)[12]。研究表明cGAS-STING通路的激活可能是多種慢性免疫炎性疾病的發(fā)病機(jī)制，如惡性腫瘤、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、急性胰腺炎等[13～15]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明抑制STING活性可明顯改善急性心肌梗死后小鼠的病理性心肌重塑[16]。在脂肪肝炎小鼠模型中，肝臟巨噬細(xì)胞STING表達(dá)增加，STING可通過(guò)介導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化激活NF-κB信號(hào)通路、促進(jìn)炎性細(xì)胞因子表達(dá)，誘發(fā)肝臟炎性及纖維化[17]。

目前cGAS-STING信號(hào)通路是否參與DN的調(diào)控尚不清楚，筆者推測(cè)在DN慢性微炎性狀態(tài)下，腎臟cGAS-STING通路極有可能表達(dá)上調(diào)。為驗(yàn)證該假設(shè)，本研究檢測(cè)DN患者腎組織STING的免疫組織化學(xué)表達(dá)水平，并利用免疫熒光雙染技術(shù)對(duì)STING及巨噬細(xì)胞進(jìn)行定位，結(jié)果表明DN患者腎臟CD86+M1型巨噬細(xì)胞明顯浸潤(rùn)、STING表達(dá)量明顯增加，且二者存在共定位。為進(jìn)一步明確巨噬細(xì)胞cGAS-STING通路在DN中的作用，本研究應(yīng)用Western blot法、RT-PCR等技術(shù)對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，給予高糖刺激，結(jié)果表明高糖環(huán)境下，巨噬細(xì)胞cGAS-STING信號(hào)通路被激活、巨噬細(xì)胞向M1型活化，同時(shí)p-p65 NF-κB信號(hào)蛋白表達(dá)上調(diào)、炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β釋放增加；加入STING抑制劑C-176可明顯抑制M1型巨噬細(xì)胞活化及下游炎性蛋白、炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。以上結(jié)果證實(shí)，高糖環(huán)境下，巨噬細(xì)胞cGAS-STING信號(hào)通路被激活，該通路可進(jìn)一步促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞活化及下游炎性反應(yīng)。但高糖環(huán)境下cGAS-STING被激活的分子生物學(xué)機(jī)制目前仍不清楚。線粒體功能障礙已被證實(shí)參與DN的發(fā)生、發(fā)展，與高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激有關(guān)[18～20]。cGAS-STING通路可被線粒體損傷釋放入胞質(zhì)的線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)所激活[21]。因此推測(cè)，高糖環(huán)境下巨噬細(xì)胞極有可能發(fā)生線粒體功能障礙，隨之mtDNA逃逸至胞質(zhì)激活cGAS-STING信號(hào)通路，進(jìn)而介導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化。今后課題組擬進(jìn)一步完成高糖環(huán)境下巨噬細(xì)胞的線粒體功能檢測(cè)。

綜上所述，本研究在人體水平證實(shí)STING在DN患者腎臟M1型巨噬細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞水平表明高糖環(huán)境下，cGAS-STING通路被激活并介導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞活化，進(jìn)而促進(jìn)下游炎性反應(yīng)。

本研究探索cGAS-STING信號(hào)通路在DN慢性免疫炎性反應(yīng)過(guò)程中的作用，初步闡明cGAS-STING介導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化、促進(jìn)下游炎性反應(yīng)的生物學(xué)功能。今后將繼續(xù)探討該通路介導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化的分子生物學(xué)機(jī)制，并進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步加以驗(yàn)證。該研究擬為DN的分子免疫治療提供新的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。