血清趨化素Chemerin及相關炎性細胞因子在非酒精性脂肪性肝病中的作用

吳明奇 楊晴柔 徐素美 陳芝蕓

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種與肥胖及胰島素抵抗相關的代謝性慢性肝臟損傷疾病。目前，NAFLD在全球各地的平均發(fā)生率約為24%[1]。其中，20%～30% NAFLD患者會進展成非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，嚴重者可導致進行性肝纖維化和肝硬化甚至肝細胞癌[2]。趨化素Chemerin是新發(fā)現(xiàn)的一個脂肪細胞因子，有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝功能，并可通過刺激巨噬細胞上調(diào)CCL2、TNF-α等炎性介質(zhì)的表達，誘發(fā)或加劇肝內(nèi)的炎性反應[3,4]。本研究觀察NAFLD患者血清趨化素Chemerin、CCL2、TNF-α水平變化，并分析其與肝細胞損傷、糖脂代謝等的關系，探討血清趨化素Chemerin及其相關炎性細胞因子在NAFLD發(fā)生、發(fā)展中的作用和意義。

對象與方法

1.研究對象：收集2018年4～6月浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院下沙院區(qū)體檢中心受檢并診斷為脂肪肝，且符合診斷標準、納入標準及排除標準的患者110例，患者平均年齡為42.8±9.0歲，對入選患者進行流行病學問卷調(diào)查。同期納入50例體檢指標無異常，且除外相關肝病、可導致脂肪肝的相關疾病，以及各種嚴重慢性疾病的體檢人群作為對照組，平均年齡為42.4±9.1歲。NAFLD組納入標準：①年齡：18～65周歲；②符合NAFLD診斷標準，即參考中華醫(yī)學會肝臟病學分會脂肪肝和酒精性肝病學組編寫的《中國非酒精性脂肪性肝病診療指南(2010年修訂版)》[5]。對照組納入標準：①年齡：18～65周歲；②同一批體檢人群中，明確排除NAFLD的健康體檢者，且不飲酒者(無飲酒史或飲酒折合乙醇量男性<140克/周，女性<70克/周)。排除標準：①無病毒性肝炎、藥物性肝炎等肝病；②自身免疫性疾病、胃腸外營養(yǎng)疾病、甲狀腺功能減退等可導致脂肪肝的疾病；③心功能不全、腎功能不全、免疫缺陷性等各種嚴重慢性疾病；④不配合調(diào)查或資料不全者。研究方案經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會審批并備案。

2.主要試劑：Human Premixed Multi-Analyte(Chemerin、CCL2、TNF-α)Kit，購自美國Bio-Techne公司(目錄號LXSAHM-07)；葡萄糖檢測試劑盒(產(chǎn)品號05168791190)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶檢測試劑盒(ALT)(產(chǎn)品號05850819190)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)檢測試劑盒(產(chǎn)品號05850797190)、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)檢測試劑盒(產(chǎn)品號37435801)、甘油三酯(TG)檢測試劑盒(產(chǎn)品號35652201)、總膽固醇(TC)檢測試劑盒(產(chǎn)品號37225401)購自羅氏診斷產(chǎn)品有限公司；高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)檢測試劑盒(產(chǎn)品號92649105)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)檢測試劑盒(產(chǎn)品號92650120)購自中生北控生物有限公司。

3.主要儀器：Bio-Plex 200液相懸浮芯片系統(tǒng)為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；DX800型全自動血細胞分析儀型號為美國貝克曼公司產(chǎn)品；羅氏cobas8000全自動生化儀為瑞士羅氏診斷公司產(chǎn)品；LOGIG 500型超聲診斷儀為美國GE公司產(chǎn)品。

4.研究方法：形體學參數(shù)檢測：受檢者脫鞋帽、穿單衣，由專人使用同一工具采用標準方法測量其體重、身高，分別精確到0.1kg和0.1cm，并計算體重指數(shù)(BMI)=體重(kg)/身高2(m2)。血壓測定：使用啟達QD-YTJ-A血壓監(jiān)測工作站測定血壓，以坐立位休息5min以上，測定收縮壓(systolic blood pressure，SBP)和舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)。肝臟B超檢測：采用LOGIG 500型超聲診斷儀[探頭頻率(3.5～5.0)MHz]行肝臟 B 超檢查。生化指標檢測：受檢者在禁食8～12h后，次日晨采集空腹靜脈血，采用全自動生化儀檢測血糖、血脂(TC、TG、HDL-C、LDL-C)和肝功能(ALT、AST、GGT)。采用 Luminex液相芯片法Bio-Plex 200 system高通量分析平臺(Bio-Rad公司)檢測血清中Chemerin、CCL2、TNF-α水平，操作步驟嚴格按照試劑盒提供的說明書進行規(guī)范化、標準化操作，通過配套的Bio-Plex Manager 軟件包進行數(shù)據(jù)測定及分析，根據(jù)試劑盒提供的標準品做標準曲線(圖1～圖3)，根據(jù)標準曲線得出最終數(shù)值，保證結(jié)果的可靠性、準確性。

圖1 Chemerin標準曲線

圖2 CCL2標準曲線

圖3 TNF-α標準曲線

結(jié) 果

1.NAFLD患者性別、BMI、血壓、血糖、血脂、肝功能變化的變化：NAFLD組男性患者占較高比例，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；NAFLD組BMI、血糖、血壓(收縮壓及舒張壓)、TG、TC、LDL-C、ALT、AST、GGT、水平顯著高于對照組(P<0.01)，HDL-C水平則顯著低于對照組(P<0.01)，詳見表1。

表1 NAFLD患者性別、BMI、血壓、血糖、血脂、肝功能變化

2.NAFLD患者血清趨化素Chemerin、CCL2、TNF-α水平的變化：NAFLD組血清趨化素Chemerin、CCL2、TNF-α水平均顯著高于對照組(P<0.01)，詳見表2。

表2 NAFLD患者Chemerin、CCL2、TNF-α的變化

討 論

液相芯片是一種非常靈活的多功能技術平臺，可進行蛋白、核酸等生物大分子檢測及酶學分析、受體和配體識別分析等研究，被喻為后基因組時代的芯片技 術。與傳統(tǒng)的ELISA法比較，具有快速、經(jīng)濟、高效的特點，對于以人群為目標臨床大樣本取樣的研究，更是具有節(jié)省樣體量的優(yōu)勢。本研究所使用的Bio-Plex Pro 200系統(tǒng)整合了雙激光、激流系統(tǒng)和實時數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，特有的系統(tǒng)校正和校驗工具，以進行內(nèi)部質(zhì)控，確保實驗數(shù)據(jù)的精確性。

本組研究對象為浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院體檢人群，職業(yè)以公務員、企事業(yè)單位人員為主，研究結(jié)果提示，NAFLD組男女性別之比為97∶13，男性占比88.2%，明顯高于女性，性別之間發(fā)生率的差異可能與男性、女性之間體內(nèi)不同的激素調(diào)控相關[6]。

根據(jù)世界衛(wèi)生組織全球衛(wèi)生觀察站2014年的數(shù)據(jù)表明，NAFLD發(fā)生率與肥胖指數(shù)密切相關[7]。本組資料也發(fā)現(xiàn)，NAFLD組較對照人群有更高的BMI指數(shù)。本研究NAFLD組較對照人群有更高的空腹血糖、TG、TC及LDL-C水平，而HDL-C較對照人群明顯下降，提示NAFLD患者存在機體糖、脂代謝功能異常；同時，NAFLD組較對照組有更高的血壓水平；這些結(jié)果也進一步表明NAFLD與代謝綜合征關系密切，是代謝綜合征在肝臟的表現(xiàn)[8]。

Chemerin主要由白色脂肪組織釋放，在肝臟和肺中高度表達；通過刺激、誘導脂肪細胞和血管內(nèi)皮細胞的增值、分化，以影響體內(nèi)脂肪組織代謝平衡[9]。本研究發(fā)現(xiàn)NAFLD組較對照組血清趨化素Chemerin水平明顯增高。Kajor等[10]研究發(fā)現(xiàn)，與體重指數(shù)≤40kg/m2的患者比較，體重指數(shù)>40kg/m2的患者血清趨化素Chemerin水平明顯升高，說明血清趨化素Chemerin與肥胖關系密切。由于本組NAFLD患者中，BMI均≤40kg/m2(最高為35.22kg/m2)，為了評估BMI與血清趨化素Chemerin相關性，本研究根據(jù)中國肥胖問題工作組建議，將BMI值分為3組，即18.5～23.9kg/m2為正常組，24～27.9kg/m2為超重組，≥28kg/m2為肥胖組，結(jié)果提示血清趨化素Chemerin水平隨BMI值的增高而增高(正常組為615.3±420.6pg/ml；超重組為1014.6±825.9pg/ml；肥胖組為1284.9±838.3pg/ml)，且正常組明顯低于超重組和肥胖組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，但超重組(n=65)與肥胖組(n=42)之間比較，差異無統(tǒng)計學意義[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，MS相關標志物BMI(R=0.269，P<0.01)、TG(R=0.318，P<0.01)、SBP(R=0.310，P<0.01)、DBP(R=0.282，P<0.01)、血糖(R=0.242，P<0.05)與血清趨化素Chemerin呈正相關，HDL-C(R=-0.335，P<0.01)與血清趨化素Chemerin呈負相關，說明MS與血清趨化素Chemerin可能存在相關性。Kim等[12]研究發(fā)現(xiàn)通過改變飲食或加強鍛煉可降低體重超重者、肥胖2型糖尿病患者血清趨化素Chemerin水平，也支持MS與血清趨化素Chemerin可能存在相關性這一觀點。

CC趨化因子2(C-C motif chemokineligand 2，CCL2)又稱單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)是與CC趨化因子2受體 (C-C motif chemokineligand receptor2，CCR2)的主要配體，兩者高親和力的結(jié)合、活化后，能誘導肝內(nèi)發(fā)生免疫和炎性反應[13]。動物實驗證明，腸源性脂多糖和游離脂肪酸通過激活巨噬細胞表面的TLR-4，激活巨噬細胞的促炎程序，誘導巨噬細胞分泌CCL2、TNF-α等細胞因子[14]。趨化素Chemerin與其趨化因子樣受體1(CMLKR-1)的結(jié)合促進巨噬細胞和自然殺傷細胞向組織損傷部位的活化，參與炎性反應[15]。本實驗發(fā)現(xiàn)，NAFLD組較對照組有更高的CCL2、TNF-α水平，同時發(fā)現(xiàn)血清趨化素Chemerin與CCL2(R=0.490，P<0.01)、TNF-α(R=0.308，P<0.01)均呈正相關。由此，進一步分析了血清趨化素Chemerin與肝細胞損傷的相關指標的關系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清趨化素Chemerin與ALT(R=0.275，P<0.01)、AST(R=0.233，P<0.01)、GGT(R=0.359，P<0.01)均呈正相關，表明血清趨化素Chemerin可能參與了NAFLD的炎性反應。

筆者觀察到，血清趨化素Chemerin、CCL2、TNF-α等炎性細胞因子水平在不同的NAFLD患者中個體差異比較大，分析原因可能與本組資料均為體檢患者，未進行單純性脂肪肝、NASH的分組分析有關。若需進一步的研究，需要擴大樣本量，同時有必要通過超聲、磁共振彈性成像等技術進行NAFLD嚴重程度分級，這樣可望得出更能反映NAFLD炎性細胞因子與肝臟不同程度脂肪變相對比的結(jié)果。迄今為止的大多數(shù)研究表明，血清趨化素Chemerin與NAFLD有關聯(lián)，但血清趨化素Chemerin和肝趨化素Chemerin mRNA之間尚未發(fā)現(xiàn)可靠的相關性，需要在未來的研究中加以關聯(lián)和擴展。