乳化法制備畢赤酵母微膠囊的條件優(yōu)化

周紫薇，項(xiàng)鄭昊，周化嵐，張建國(guó)

上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院 食品科學(xué)與工程研究所，上海 200093

畢赤酵母是一種典型的甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母,已成為較成功的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一[1]。至今已有5 000多種外源蛋白利用畢赤酵母成功表達(dá)[2]。目前畢赤酵母表達(dá)外源蛋白的過程優(yōu)化仍呈現(xiàn)多樣化的態(tài)勢(shì)，而且過程優(yōu)化的效果不夠明顯，其主要原因?yàn)椴捎靡后w培養(yǎng)的方式研究群體重組畢赤酵母的性能掩蓋了菌株之間的差異。而且，不同時(shí)間表征的指標(biāo)來自于不同菌株。為了開展針對(duì)同一菌株的外源蛋白表達(dá)性能直接、有效地表征外源蛋白表達(dá)過程，研制一種無需分離純化產(chǎn)物、低成本的生化微反應(yīng)器作為畢赤酵母的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)的組成部分具有實(shí)際應(yīng)用意義。

微膠囊(Microcapsules)是應(yīng)用天然或人工合成的高分子成膜壁材，將固態(tài)、液態(tài)或氣態(tài)的物質(zhì)作為芯材，包裹成具有半通透性或密封的球形微粒，粒徑尺寸一般為1 μm ～1000 μm。微膠囊可以隔絕外界不良環(huán)境(過高的pH、溫度、酶)保護(hù)芯材，也可以改善芯材性質(zhì)(屏蔽氣味、毒性、顏色)，控制芯材的釋放時(shí)間等作用。目前，微膠囊已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥、化工、食品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。微膠囊制備方法分為物理法、化學(xué)法和物理化學(xué)法三類。物理法通過物理、機(jī)械作用將壁材包覆在小分子芯材上，具體有空氣懸浮法[3]、溶劑揮發(fā)法[4]、噴霧干燥法[5]等?；瘜W(xué)法指化合物單體通過聚合反應(yīng)形成聚合物外殼，再將芯材包覆，例如擠壓法、界面縮聚法[6]、原位聚合法等[7]。物理化學(xué)法通過添加溶劑(無機(jī)鹽、非電解質(zhì))或調(diào)節(jié)pH、改變溫度等措施調(diào)節(jié)聚合物溶解度，使聚合物從溶液中析出并沉積在芯材表面，形成微膠囊，例如相分離法[8,9]、層層組裝法[10]等。目前制備微膠囊的常用方法有噴霧干燥法、擠壓法、乳化法、層層組裝法等。其中乳化法通過海藻酸鈉與交聯(lián)劑進(jìn)行凝膠化得到微膠囊，設(shè)備簡(jiǎn)單，成本低。內(nèi)源乳化法制備微膠囊的過程中，難溶性鈣鹽的種類及濃度、乳化過程中水相和油相的體積比、表面活性劑的類型及濃度和油溶性酸的種類及濃度等因素都會(huì)影響海藻酸鈉微膠囊的包埋效果。對(duì)于畢赤酵母微膠囊化而言，碳酸鈣、檸檬酸鈣、草酸鈣、磷酸鈣和酒石酸鈣都是適用的鈣離子載體。其中，碳酸鈣是最常用的鈣離子載體，其形成的微膠囊成球性好、粒徑分布較窄、性質(zhì)穩(wěn)定[11]。例如，SONG等通過乳化法制備了酵母微膠囊，粒徑為35 μm～863 μm[12]。其中，海藻酸鈉微膠囊的粒徑是影響芯材性質(zhì)、微膠囊降解性、芯材與外界進(jìn)行物質(zhì)交換，及釋放動(dòng)力學(xué)的重要參數(shù)。微膠囊的最佳尺寸也根據(jù)不同芯材和應(yīng)用場(chǎng)景的不同而變化。微膠囊粒度分布影響微膠囊體積、密度、流動(dòng)性、復(fù)水性、溶解性和分散性等性質(zhì)，對(duì)芯材的負(fù)載、聚集和組織滯留有重要的影響。本研究選用分泌表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的重組畢赤酵母菌株GS115-gfp進(jìn)行微膠囊的制備的條件優(yōu)化，為高效表達(dá)外源蛋白的重組畢赤酵母篩選奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

畢赤酵母(Komagataellaphaffii，原名Pichiapastoris)GS115-gfp來自本實(shí)驗(yàn)室。

YPD(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium)培養(yǎng)基：稱取1.0 g酵母粉、2.0 g蛋白胨、2.0 g葡萄糖(如配置固體培養(yǎng)基則再稱取2.0 g瓊脂粉)，加入100 mL去離子水混勻，在115℃條件下高壓滅菌15 min，室溫保存。

檸檬酸鈉溶液(0.06 mol/L)：稱取1.55 g檸檬酸鈉，加入70.0 mL去離子水，混合均勻，定容至100 mL，保存于室溫，備用。

G418遺傳霉素(100 mg/mL)：稱取1.0 g G418，加入7.0 mL去離子水，混合均勻，再定容至10 mL，過濾除菌，分裝保存于-20 ℃，備用。

碳酸鈣溶液：依據(jù)使用濃度稱取碳酸鈣，加入70.0 mL水混合均勻，再定容至100 mL，室溫保存。

1.2 方法

1.2.1菌懸液的制備

將冷凍保藏的畢赤酵母GS115-gfp在YPD固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，經(jīng)48 h培養(yǎng)后，挑取單菌落于5 mL 的YPD液體培養(yǎng)基中，在30 ℃、200 r/min下培養(yǎng)24 h，然后按4.0%的接種量轉(zhuǎn)接到5 mL YPD液體培養(yǎng)基中，連續(xù)傳代2～3次，使菌種完全活化。

將活化好的畢赤酵母GS115-gfp按4.0%的接種量轉(zhuǎn)接到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，20 h后，將處于對(duì)數(shù)期末期的菌懸液在4 ℃，6 000 r/min的條件下離心10 min，去上清液，菌體沉淀用無菌水洗滌兩次后，分散于10 mL無菌水中得到濃縮菌液。

1.2.2海藻酸鈉與畢赤酵母生物相容性的測(cè)定

配制海藻酸鈉質(zhì)量濃度分別為0%、1%和2%的YPD固體培養(yǎng)基，然后將畢赤酵母GS115-gfp菌液經(jīng)梯度稀釋后，點(diǎn)樣于YPD固體培養(yǎng)基中，在30 ℃下培養(yǎng)48 h，統(tǒng)計(jì)菌落總數(shù)后計(jì)算活菌數(shù)。

1.2.3單因素優(yōu)化

將10 mL菌液與20 mL 0.375%海藻酸鈉、0.015%碳酸鈣混合均勻后，加入70 mL含有1% Span 80 的液體石蠟后攪拌20 min，最后加入 0.5 mL乙酸，攪拌30 min；加水洗滌后得到微膠囊。以液體石蠟為油相，分別考察了水油比為1∶9、2∶8、3∶7、4∶6和1∶1時(shí)對(duì)形成微膠囊的影響。乙酸添加量的優(yōu)化考察了鈣離子與乙酸的摩爾質(zhì)量比為1∶1、1∶2、1∶3和1∶4時(shí)對(duì)形成微膠囊的影響。轉(zhuǎn)速優(yōu)化實(shí)驗(yàn)考察了轉(zhuǎn)速為300 r/min、400 r/min、500 r/min、600 r/min和700 r/min時(shí)對(duì)形成微膠囊的影響。碳酸鈣與海藻酸鈉質(zhì)量比分別考察碳酸鈣與海藻酸鈉質(zhì)量比為1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1和4∶1時(shí)對(duì)形成微膠囊的影響。表面活性劑(Span 80)添加量的優(yōu)化考察了Span 80占油相體積0%、1.0%、1.5%和2.0%時(shí)對(duì)形成微膠囊的影響。

1.2.4響應(yīng)面優(yōu)化

基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以轉(zhuǎn)速(A)、Span80添加量(B)、水油比(C)為自變量，以微膠囊的粒徑和包埋率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析對(duì)乳化法制備畢赤酵母海藻酸鈉微膠囊的制備條件進(jìn)行優(yōu)化，通過響應(yīng)面數(shù)據(jù)的處理分析確定其最佳的制備條件。響應(yīng)面分析因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素與水平表

1.3 分析方法

1.3.1畢赤酵母微膠囊粒徑分布的測(cè)定

將微膠囊置于載玻片上，用生物顯微鏡進(jìn)行觀察并拍照，使用Image Pro Plus軟件測(cè)定微膠囊尺寸，并進(jìn)行粒徑分布統(tǒng)計(jì)。

1.3.2包埋率的測(cè)定

稱取1.0 g微膠囊置于10 mL的0.06 mol/L檸檬酸鈉溶液中，30 ℃震蕩1 h，使海藻酸鈉微膠囊溶解并釋放包埋的畢赤酵母，采用稀釋平板法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。微膠囊的包埋率計(jì)算公式如下：

1.3.3畢赤酵母微膠囊的GFP誘導(dǎo)表達(dá)

分別設(shè)置了甲醇的添加量為0.5%、1.0%和1.5%，在BMMY培養(yǎng)基中培養(yǎng)畢赤酵母微膠囊。

2 結(jié)果與分析

2.1 海藻酸鈉與畢赤酵母的生物相容性

海藻酸鈉與酵母菌的生物相容性決定著酵母菌在微膠囊內(nèi)的活性。圖1為不同海藻酸鈉添加量的YPD固體培養(yǎng)基上畢赤酵母GS115-gfp的生長(zhǎng)情況。添加了1%和2%的海藻酸鈉的培養(yǎng)基中，活菌數(shù)分別達(dá)到了7.3 lg CFU/mL和7.6 lg CFU/mL，分別為對(duì)照組的97.3%和101.3%，說明海藻酸鈉與畢赤酵母GS115-gfp生物相容性好(P>0.05)。

圖1 海藻酸鈉添加量對(duì)畢赤酵母GS115-gfp活細(xì)胞數(shù)的影響

2.2 乳化法制備畢赤酵母海藻酸鈉微膠囊的單因素優(yōu)化

2.2.1水相和油相體積比(水油比)對(duì)微膠囊性質(zhì)的影響

當(dāng)水油比小時(shí)，單位體積內(nèi)液體石蠟中分散的海藻酸鈉較少，在磁力攪拌的作用下，介質(zhì)中會(huì)產(chǎn)生較小的分散液滴，從而得到粒徑較小的海藻酸鈉微膠囊。由表2可以看出，隨著水油比的增大，微膠囊的平均粒徑逐漸增大，在水油比為1∶9時(shí)達(dá)到最大值，為(417±33)μm。水油比的改變對(duì)微膠囊的包埋率沒有顯著性的影響(P>0.05)。

表2 水油比對(duì)微膠囊性質(zhì)的影響

2.2.2乙酸添加量對(duì)微膠囊性質(zhì)的影響

乙酸在乳化法制備微膠囊中起到至關(guān)重要的作用，當(dāng)乙酸的添加量多時(shí)，碳酸鈣能夠釋放更多的鈣離子，使海藻酸鈉形成高強(qiáng)度的海藻酸鈉微膠囊，可以提高微膠囊的包埋率，降低微膠囊的粒徑，但是在體系中添加過量的乙酸會(huì)降低體系的pH，可能會(huì)造成體系內(nèi)酵母菌存活率的下降；當(dāng)乙酸的添加量少時(shí)，碳酸鈣釋放的鈣離子減少，其通過油/水界面的擴(kuò)散速率降低，碳酸鈣釋放的鈣離子減少，導(dǎo)致無法形成結(jié)構(gòu)致密的海藻酸鈉微膠囊。因此，本研究分別考察了鈣離子與乙酸的摩爾質(zhì)量比為1∶1、1∶2、1∶3和1∶4時(shí)對(duì)微膠囊性質(zhì)的影響。

由表3可以看出，當(dāng)鈣離子和乙酸的摩爾質(zhì)量比在的1∶2～1∶4的范圍內(nèi)時(shí)，微膠囊的粒徑在1∶3時(shí)達(dá)到最小值，為(359±65)μm，包埋率也達(dá)到最高值，為87.6%。

表3 乙酸添加量對(duì)微膠囊性質(zhì)的影響

2.2.3轉(zhuǎn)速對(duì)微膠囊性質(zhì)的影響

轉(zhuǎn)速過小(實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)為小于300 r/min)時(shí)，形成的微膠囊聚集嚴(yán)重，成球性交叉，包埋率低，提高轉(zhuǎn)速，乳狀液中受到剪切應(yīng)力增大，形成的微膠囊粒徑變小，但轉(zhuǎn)速過大(實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)為大于600 r/min)時(shí)，乳狀液中受到的剪切應(yīng)力不均勻，形成的微膠囊較大。由表4可以看出，隨著磁力攪拌轉(zhuǎn)速的提高，微膠囊的粒徑逐漸減小。粒徑在轉(zhuǎn)速為600 r/min時(shí)達(dá)到最小，為(308±23)μm。在轉(zhuǎn)速為300 r/min～500 r/min的區(qū)間內(nèi)，包埋率在轉(zhuǎn)速為500 r/min時(shí)達(dá)到最大，為74.5%，在轉(zhuǎn)速為500 r/min～700 r/min的區(qū)間內(nèi)，包埋率隨著轉(zhuǎn)速的提高而下降。

表4 轉(zhuǎn)速對(duì)微膠囊性質(zhì)的影響

2.2.4鈣離子與海藻酸鈉的摩爾質(zhì)量比(鈣膠比)對(duì)微膠囊性質(zhì)的影響

碳酸鈣含量的增加使得混合液中鈣離子的濃度增大，促使海藻酸鈉和鈣離子之間進(jìn)行凝膠化反應(yīng)，形成的微膠囊結(jié)構(gòu)更加致密，導(dǎo)致粒徑和減小，但鈣膠比超過一定程度，混合液中的海藻酸鈉濃度過低，使得形成的結(jié)構(gòu)變得松散，包裹的畢赤酵母容易流失，導(dǎo)致包埋率下降。由表5可知，隨著鈣膠比的增加，微膠囊的粒徑有下降的趨勢(shì)，當(dāng)鈣膠比為3∶1時(shí)微膠囊的粒徑平均粒徑最小為(309±49)μm；微膠囊的包埋率在1∶3時(shí)最高，為90.5%。

表5 鈣膠比對(duì)微膠囊性質(zhì)的影響

2.2.5表面活性劑添加量對(duì)微膠囊性質(zhì)的影響

在表面活性劑的添加量較低時(shí)，不能很好的覆蓋分散相表面，微膠囊的穩(wěn)定性低，聚集生成較大的微膠囊，而在表面活性劑的添加量足夠高時(shí)，表面活性劑降低了水相和油相之間的表面張力，同時(shí)高濃度的Span 80使油/水界面上Span 80分子排列更加緊密，降低了通過油/水界面擴(kuò)散到海藻酸鈉溶液中乙酸的量和速度，從而得到粒徑較小的微膠囊。但當(dāng)表面活性劑的添加量過多(Span 80的濃度大于臨界膠束濃度(CMC)，實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)為Span 80濃度超過1.5%)時(shí)，混合液中Span 80的親水基團(tuán)與海藻酸鈉分子相互吸引，使得原本自由伸展的海藻酸鈉長(zhǎng)鏈分子向膠束中心彎曲，溶液收縮應(yīng)力增大，表面張力增大，微膠囊的粒徑也隨之增大。由表6可以看出，隨著Span 80添加量的增加，微膠囊的粒徑逐漸減小，當(dāng)Span 80添加量為1.5%時(shí)粒徑最小，為168±18 μm。微膠囊的包埋率在0.5%～1.0%的區(qū)間內(nèi)隨著Span 80添加量的增多而提高，隨后包埋率隨Span 80添加量的提高而降低，當(dāng)Span 80添加量為1.0%時(shí)包埋率最高，為86.5%。

表6 Span 80的添加量對(duì)微膠囊性質(zhì)的影響

2.3 乳化法制備畢赤酵母海藻酸鈉微膠囊的響應(yīng)面優(yōu)化

以乳化過程中磁力攪拌器的轉(zhuǎn)速(A)、表面活性劑Span 80添加量(B)、水油比(C)為自變量，微膠囊的粒徑和包埋率為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，共17組試驗(yàn)方案。響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果見表7。

表7 乳化法制備畢赤酵母海藻酸鈉微膠囊的響應(yīng)面方案及結(jié)果

利用Design-Expert軟件對(duì)表7的數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析，擬合得到微膠囊的粒徑和包埋率關(guān)于A、B、C的三元二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=82.28+3.51A+0.783 4B+0.279 6C+5.45AB+3.85AC+0.987 2BC+39.28A2+6.21B2+27.28C2

(1)

Y=79.02-0.387 5A-1.15B-2.55C+0AB-4.13AC-3.62BC-4.44A2-2.24B2-3.76C2

(2)

式(1)和式(2)分別為粒徑和包埋率的回歸方程。

對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析與顯著性檢驗(yàn)。模型的P值均小于0.05，表明模型差異顯著；失擬項(xiàng)均大于0.05，說明模型具有較好的擬合度，表面模型能較準(zhǔn)確的反映了轉(zhuǎn)速、Span 80添加量、水油比對(duì)微膠囊粒徑和包埋率的影響。因此可以用回歸模型對(duì)實(shí)際的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

回歸方程中各項(xiàng)系數(shù)絕對(duì)值的大小能直接反映各因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度，其正負(fù)表示影響的方向。由式(1)和式(2)的各項(xiàng)系數(shù)可知，各因素影響微膠囊粒徑的顯著性大小為：水油比>Span 80添加量>轉(zhuǎn)速；各因素影響微膠囊包埋率的顯著性大小為：轉(zhuǎn)速>Span 80添加量>水油比。采用Design-Expert軟件優(yōu)化回歸方程模型，最佳制備條件為：轉(zhuǎn)速為529.09 r/min、Span 80添加量為1.48%和水油比為0.41。得到的微膠囊最小粒徑為88.02 μm，包埋率為79.53%。

圖2為乳化法制備微膠囊中轉(zhuǎn)速、Span 80添加量和水油比三者之間交互作用對(duì)微膠囊粒徑的響應(yīng)面圖。由圖2(a、b)可知，水油比為0.466 5，轉(zhuǎn)速固定，微膠囊的粒徑隨著Span 80添加量的增大呈緩慢下降趨勢(shì)；固定Span 80添加量時(shí)，微膠囊的粒徑隨著轉(zhuǎn)速的增大呈先下降后上升趨勢(shì)，微膠囊粒徑的最小值在轉(zhuǎn)速為500 r/min ～600 r/min和Span 80添加量為1.0%～1.5%的范圍內(nèi)，且存在最低點(diǎn)，即為圖2(b)等高線中的點(diǎn)5。由圖2(c、d)可知，Span 80添加量為1.5%，轉(zhuǎn)速固定，微膠囊的粒徑隨著水油比的增大呈先下降后上升趨勢(shì)；水油比固定，微膠囊的粒徑隨著轉(zhuǎn)速的增大呈先下降后上升趨勢(shì)，微膠囊粒徑的最小值在轉(zhuǎn)速為500 r/min ～600 r/min和水油比為0.439 8～0.493 2的范圍內(nèi)，且存在最低點(diǎn)，即為圖2(d)等高線中的點(diǎn)5。由圖2(e、f)可知，轉(zhuǎn)速為500 r/min，Span 80添加量固定時(shí)，微膠囊的粒徑隨著水油比的增大呈先下降后上升趨勢(shì)；水油比固定時(shí)，微膠囊的粒徑隨著Span 80添加量的增大呈緩慢下降后緩慢上升趨勢(shì)，微膠囊粒徑的最小值在Span 80添加量為1%～2%和水油比為0.439 8～0.493 2的范圍內(nèi)，且存在最低點(diǎn)，即為圖2(f)等高線中的點(diǎn)5。

圖3為乳化法制備微膠囊中轉(zhuǎn)速、Span 80添加量、水油比三者之間交互作用對(duì)微膠囊包埋率的響應(yīng)面圖。由圖3(a、b)可知，水油比為0.466 5，轉(zhuǎn)速固定，微膠囊的包埋率隨著Span 80添加量的增大呈先上升后下降趨勢(shì)；固定Span 80添加量時(shí)，微膠囊的包埋率隨著轉(zhuǎn)速的增大呈先上升后下降趨勢(shì)，微膠囊包埋率的最大值在Span 80添加量為1%～2%和轉(zhuǎn)速為400 r/min ～600 r/min的范圍內(nèi)，且存在最高點(diǎn)，即為圖3(b)等高線中的點(diǎn)5。由圖3(c、d)可知，Span 80添加量為1.5%，轉(zhuǎn)速固定，微膠囊的包埋率隨著水油比的增大呈下降趨勢(shì)；水油比固定，微膠囊的包埋率隨著轉(zhuǎn)速的增大呈先上升后下降趨勢(shì)，微膠囊包埋率的最大值在水油比為0.439 8～0.493 2和轉(zhuǎn)速為400 r/min ～600 r/min的范圍內(nèi)，且存在最高點(diǎn)，即為圖3(d)等高線中的點(diǎn)5。由圖3(e、f)可知，轉(zhuǎn)速為500 r/min，Span 80添加量固定時(shí)，微膠囊的包埋率隨著水油比的增大呈下降趨勢(shì)；水油比固定時(shí)，微膠囊的包埋率隨著Span 80添加量的增大呈上升趨勢(shì)，微膠囊包埋率的最大值在Span 80添加量為1%～2%和水油比為0.439 8～0.493 2的范圍內(nèi)，且存在最高點(diǎn)，即為圖3(f)等高線中的點(diǎn)5。

結(jié)合實(shí)際條件，將最佳制備參數(shù)調(diào)整為轉(zhuǎn)速500 r/min、水油比0.466 5和Span 80添加量為1.5%，制備所得微膠囊的粒徑為93.032 μm，包埋率為80.1%，實(shí)際值與理論值接近。因此，證實(shí)該模型能較好地模擬并預(yù)測(cè)微膠囊的粒徑和包埋率。

(a)

(a)

2.4 畢赤酵母海藻酸鈉微膠囊的形態(tài)觀察及其GFP誘導(dǎo)表達(dá)

乳化法制備所得的海藻酸鈉畢赤酵母微膠囊，呈規(guī)整的球形結(jié)構(gòu)，微膠囊之間存在相互粘連的現(xiàn)象，在內(nèi)部清晰可見畢赤酵母的聚集存在(圖4a)。經(jīng)過0.5%、1.0%和1.5%甲醇添加量的24 h誘導(dǎo)后，微膠囊內(nèi)的畢赤酵母GS115-gfp均在微膠囊內(nèi)表達(dá)了綠色熒光蛋白。其中，在甲醇添加量為1.0%時(shí)的微膠囊綠色熒光最為顯著，此時(shí)誘導(dǎo)作用最好(圖4b、c、d)。

(a)畢赤酵母微膠囊

3 結(jié)果

本研究對(duì)畢赤酵母GS115-gfp以海藻酸鈉為壁材，通過乳化法制備了微膠囊并對(duì)其進(jìn)行了優(yōu)化，降低了微膠囊的粒徑，提高了微膠囊的包埋率，同時(shí)以甲醇為誘導(dǎo)劑，對(duì)GFP進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)。海藻酸鈉與畢赤酵母的生物相容性良好，可以作為畢赤酵母微膠囊的壁材。使用乳化法制備畢赤酵母海藻酸鈉微膠囊并對(duì)其制備條件進(jìn)行單因素及響應(yīng)面優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，最佳制備參數(shù)為轉(zhuǎn)速500 r/min、水油比0.466 5、Span 80添加量為1.5%，鈣離子與乙酸的摩爾質(zhì)量比為1∶3，鈣離子與海藻酸鈉的摩爾質(zhì)量比為1∶3，制備所得微膠囊的粒徑為(93.032±11)μm，粒徑分布區(qū)間為85 μm ～105 μm，包埋率為80.1%。乳化法制備畢赤酵母微膠囊的GFP誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果表明，在不同濃度甲醇的誘導(dǎo)下，畢赤酵母海藻酸鈉微膠囊均表達(dá)了綠色熒光蛋白GFP，這表示該微膠囊具有比較好的物質(zhì)通透性，可以將甲醇輸送給內(nèi)部的畢赤酵母對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，這為單細(xì)胞蛋白的測(cè)量提供了一種可行的方法，對(duì)后續(xù)研究單細(xì)胞的個(gè)體差異，了解細(xì)胞個(gè)體對(duì)于樣品異質(zhì)性的精確貢獻(xiàn)，促進(jìn)對(duì)細(xì)胞表達(dá)過程的理解有重要意義。