靈芝深層培養(yǎng)液成分與保濕增效功能探究

劉鐵平，孫 勇，薛仲華，曹紅森

1.上海禾向健康科技發(fā)展有限公司，上海 201199；2.華東理工大學，上海 200237；3.上海漫虹生物科技有限公司，上海 202154

隨著人民物質生活水平的提高，純天然、多功能、無刺激、無副作用的化妝品越來越受人們的喜愛，具有保濕抗皺美白活性的天然產(chǎn)物在護膚品中應用已成為化妝品行業(yè)未來發(fā)展方向。靈芝中含有豐富的靈芝單、多糖、氨基酸、多肽、三萜類等天然化合物成分，它們具有良好的吸濕保濕功效。具有保濕抗皺美白活性的天然產(chǎn)物在護膚品中應用已成為化妝品行業(yè)未來發(fā)展方向[1-2]。

研究表明靈芝具有抗氧化、延緩衰老、抗皺、美白等護膚作用，目前市場上絕大部分靈芝類護膚品是利用靈芝子實體提取液進行加工的，其活性成分含量低、有效成分少，有重金屬殘留和農(nóng)藥殘留等缺點。靈芝深層培養(yǎng)液是利用靈芝菌種進行深層培養(yǎng)而得，具有小分子功效成分豐富、活性高、含量高、易吸收、純天然、質量穩(wěn)定可控等優(yōu)點[3-4]。

由此可見，靈芝深層培養(yǎng)液將成為靈芝類保濕抗皺美白活性護膚品發(fā)展的未來方向。劉博等對靈芝深層培養(yǎng)液成分及復配的靈芝類護膚品在保濕抗皺增效功效方面做了初步實驗探究[5]。

1 實驗儀器與試劑

1.1 實驗儀器

皮膚水份測試儀Corneometer CM825，德國CK公司。皮膚彈性測試 Cutometer dual MPA580，德國CK公司。皮膚快速光學成像系統(tǒng) PRIMOS lite，德國CK 司。VISIA-CR(CANFIELD,美國)。

1.2 實驗試劑與材料

靈芝Ganodermalucidum(Leyss.ex Fr.)Karst.經(jīng)中國科學院微生物研究所鑒定并保藏于杭州雪域生物技術有限公司(No.2014394)，為深層培養(yǎng)菌種。

2 實驗方法

2.1 靈芝深層培養(yǎng)液的制備[6-8]

2.1.1用杭州雪域生物技術有限公司保藏靈芝菌種(No.2014394)為深層培養(yǎng)菌種，培養(yǎng)基為玉米淀粉1.5%、大豆蛋白1%、酵母膏0.5%、葡萄糖1%、硫酸鎂0.05%、磷酸二氫鉀0.1%等，與一定量水加入生物反應器內(nèi)，蒸汽滅菌后冷卻接種培養(yǎng)。

2.1.2接種靈芝菌種后進行生物反應器內(nèi)液體深層培養(yǎng)，培養(yǎng)參數(shù)為：罐壓0.1 Mp、溫度(26±1)℃、攪拌速度120 r/min～150 r/min、培養(yǎng)時間46 h～50 h。培養(yǎng)后液經(jīng)離心分離所得濾液即為靈芝深層培養(yǎng)液。

2.2 靈芝護膚品性能及對照組比較[9-11]

以靈芝深層培養(yǎng)液代替?zhèn)鹘y(tǒng)護膚品配方中保濕劑組分制成靈芝保濕抗皺套裝，對照組為傳統(tǒng)配方。

2.3 受試人群的選定

選擇臉部為干性肌膚，臉部皮膚角質層水分含量值小于65，眼部皮膚有皺紋，眼角皺紋評分大于等于3分(D0)受試者66名，年齡范圍在45～60周歲。受試者在臉部使用測試產(chǎn)品前、連用14 d后及連用28 d后分別進行皮膚角質層含水量、皮膚彈性、眼角圖像拍攝、臉部成像采集、自我評估問卷、并由1名專家評價員對受試者的眼角皺紋進行視感評估。產(chǎn)品使用前后的評價結果通過統(tǒng)計學檢驗方法進行比較從而判斷是否有統(tǒng)計學差異。

2.4 檢測部位

(1)皮膚角質層含水量：臉頰部位；

(2)皮膚彈性：外眼角兩側；

(3)眼角圖像拍攝：外眼角兩側；

(4)臉部成像采集：整臉；

(5)自我評估問卷：整臉；

(6)專家評估-眼角皺紋：外眼角兩側。

2.5 檢測環(huán)境

本次測試的測試環(huán)境為溫度 21.3 ℃～21.8 ℃，相對濕度 46.0%～55.0%，符合方案設計的要求。

2.6 統(tǒng)計方法

統(tǒng)計分析軟件為SPSS。在不同時間點的測量值與基礎值比較，使用前后比較，如果值為正態(tài)分布，則采用t檢驗方法進行統(tǒng)計分析；如果非正態(tài)分布，可采用秩和檢驗方法進行統(tǒng)計分析；

統(tǒng)計方法均采用雙尾檢驗，檢驗水準=0.05。

安全性評價采用統(tǒng)計描述的方法，分析不良事件程度和不良事件持續(xù)時間。

計算使用前的變化率，公式如下：

使用產(chǎn)品第2周后的Δ(差值)=T2-T0

使用產(chǎn)品第4周后的Δ(差值)=T4-T0

使用產(chǎn)品第2周后：

使用產(chǎn)品第4周后：

式中，T0：使用試樣前受試區(qū)的皮膚參數(shù)本底值。

T2：受試區(qū)使用試樣第 2 周后，皮膚參數(shù)數(shù)值。

T4：受試區(qū)使用試樣第 4 周后，皮膚參數(shù)數(shù)值。

N：受試者人數(shù)。

3 測試依據(jù)

3.1 樣本完成情況

入組 66 名受試者，最終完成 66 名受試者，平均年齡為(48.95+0.07)歲。具體納入標準及排除標準見《附件 3：樣本完成情況》。

3.2 產(chǎn)品使用及耐受性反饋情況

每名受試者在 4 周內(nèi)按要求使用測試樣品，依據(jù)《化妝品安全技術規(guī)范 2015》[12]，根據(jù)不良反應記錄結果顯示無任何不良反應出現(xiàn)。

4 儀器檢測結果及統(tǒng)計分析

4.1 皮膚角質層含水量(Corneometer)：

皮膚含水量(角質層)檢測結果見表1。

表1 皮膚含水量(角質層)檢測

結果解釋：

測試樣品連續(xù)使用第14 d、第28 d后，臉部皮膚(角質層)含水量均有極顯著性上升(p<0.001)。

連續(xù)使用對照區(qū)組產(chǎn)品后，臉部皮膚(角質層)含水量在第 14 d、第 28 d均無顯著性差異(p>0.05)；

測量值：皮膚角質層含水量越高，說明皮膚角質層水分含量越高。

(n.s.”表示無統(tǒng)計學差異，*代表0.01

4.2 皮膚角質層水分含量(Corneometer)測試產(chǎn)品與對照區(qū)域對比情況

皮膚含水量(角質層)檢測結果見表2。

表2 皮膚含水量(角質層)檢測結果

(n.s.”表示無統(tǒng)計學差異，*代表0.01

結果解釋：

連續(xù)使用樣品的區(qū)域使用的第14 d、第28 d后，使用靈芝保濕套裝的臉部皮膚(角質層)含水量均極顯著性高于對照組(p<0.001)。

測量值：皮膚(角質層)含水量值越高，角質層水分含量就越高。

4.3 皮膚彈性值(Cutometer R2)

皮膚彈性值檢測結果見表3。

表3 皮膚彈性值檢測結果

連續(xù)使用測試樣品后的第14 d(見圖3)，臉部皮膚彈性值在無顯著性差異(p>0.05)，在產(chǎn)品使用的第 28 d有非常顯著性上升(0.001

(n.s.表示無統(tǒng)計學差異，*代表0.01

連續(xù)使用對照組產(chǎn)品后，臉部皮膚彈性值在使用第14 d、第28 d均無顯著性差異(p>0.05)。

測量值：產(chǎn)品試樣的皮膚彈性值越接近 1,皮膚彈性就越好。

4.4 皮膚彈性值(Cutometer)測試產(chǎn)品與對照區(qū)域對比情況

皮膚彈性值檢測結果見表4。

表4 皮膚彈性值檢測結果

連續(xù)使用測試樣品區(qū)域的第14 d和28 d(見圖4)，測試樣品對臉部皮膚彈性值與對照組對比無顯著性差異(p>0.05)。

(n.s.表示無統(tǒng)計學差異，*代表0.01

4.5 測試樣品對眼角皺紋(Sa)影響

眼角皺紋檢測結果見表5。

表5 眼角皺紋(Sa)檢測結果

連續(xù)使用測試產(chǎn)品靈芝保濕套裝后(見圖5)，眼角皺紋在產(chǎn)品使用的第14 d、第28 d均有下降，但均無顯著性差異(p>0.05)。

(n.s.表示無統(tǒng)計學差異，*代表0.01

連續(xù)使用測試樣品區(qū)域的第14 d和28 d，測試樣品對眼角皺紋與對照組對比無顯著性差異(p>0.05)。

測量值：產(chǎn)品試樣的Sa 值越小，眼角皺紋粗糙度就越小。

連續(xù)使用測試產(chǎn)品靈芝保濕套裝 14 d后(見表6)，有57.58%的受試者感到肌膚緊實光滑，57.58%的受試者感到肌膚細膩有光澤，42.42%的受試者感到肌膚更柔軟了，51.52%的受試者感到細紋有改善，42.42%的受試者感到皺紋有改善，60.61%的受試者感到皮膚彈性有提升，66.67%的受試者感到皮膚有水潤感，有 66.67%的受試者覺得總體有改善，72.73%的受試者對產(chǎn)品的總體感到滿意。

表6 14 d后受試者自我評估

連續(xù)使用測試產(chǎn)品靈芝保濕套裝28 d后(見表7)，有 60.61%的受試者感到肌膚緊實光滑，57.58%的受試者感到肌膚細膩有光澤，51.52%的受試者感到肌膚更柔軟了，63.64%的受試者感到細紋有改善，60.61%的受試者感到皺紋有改善，51.52%的受試者感到皮膚彈性有提升，60.61%的受試者對產(chǎn)品的總體感到滿意。

表7 28 d后受試者自我評估

5 保濕基礎物質與保濕機理

據(jù)文獻報道，對靈芝深層發(fā)酵液進行高壓液相分析，對照各類化合物標準峰及特征峰，可大致得出靈芝深層發(fā)酵液中有較多的糖類、氨基酸或多肽類等，靈芝發(fā)酵液中多糖等物質的含量要比空白基液及培養(yǎng)基多，對保濕增濕效果明顯。

5.1 靈芝多糖保濕機理 [13-14]

靈芝多糖一般由D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、D-木糖、L-巖藻糖、L-阿拉伯糖等單糖組成多糖。保濕作用機理：① 單與多糖分子中的羥基、羧基等極性基團可與水形成氫鍵而結合大量的水分。多糖分子之間各種鏈相互交織成網(wǎng)狀結構，有很強的固水作用。另外在多糖與皮膚中纖維狀蛋白質共同組成含大量水分的膠狀基質。② 多糖具有良好的成膜性能?？稍谄つw表面形成一層均勻的薄膜．減少皮膚表面的水分蒸發(fā)，使得水分從基底組織彌散到角質層，保存皮膚自身的水分而完成潤膚作用。因此多糖的高吸水性和良好的成膜性完美結合，能為皮膚提供很好的保濕增濕效果。③ 多糖具有良好的成膜性能。靈芝深層發(fā)酵液中多糖等物質能使水分從皮膚基底組織彌散到角質層，保存皮膚自身的水分而起到潤膚作用，為皮膚提供很好的保濕增濕效果。

5.2 討論

(1)靈芝深層發(fā)酵液保濕效果明顯好于空白對照液。通過體內(nèi)法和體外法保濕效果綜合評價，及利用皮膚分析系統(tǒng)，進行保濕效果對比，結果顯示靈芝深層發(fā)酵液保濕效果明顯優(yōu)于空白對照液。體外法中實驗結果表明靈芝深層深層發(fā)酵液保濕率高于未發(fā)酵液，表明靈芝深層發(fā)酵液保濕效果更加好，可進一步加以利用和研究。

(2)靈芝深層中深層發(fā)酵液有較多的糖類、氨基酸或多肽類，且比未發(fā)酵液多，這些物質中部分還有羥基與水分子形成氫鍵，達到鎖住水分達到保濕效果。靈芝發(fā)酵液具體成分及其保濕機理仍有待進一步的研究。靈芝在發(fā)酵過程中發(fā)生怎樣的物質變化，對皮膚保濕作用機理，起保濕作用的具體物質，有待進一步用實驗方法來論證。

6 展望

實驗證明靈芝經(jīng)過深層發(fā)酵后保濕效果有很大的提高，但對靈芝深層發(fā)酵液的深度開發(fā)還需進一步研究和論證。有以下幾方面：

(1)可將靈芝發(fā)酵液以一定的形式和配比制成保濕水、保濕潤滑霜、面膜、抗皺增白霜等，發(fā)揮靈芝深層發(fā)酵液保濕增濕性能。為化妝品市場提供含中草藥成分的系列護膚品，物美價廉，安全可靠。

(2)通過高壓液相分析，靈芝深層發(fā)酵液中有效成分有糖類、氨基酸或多肽類等，但它們具體含量和結構型式尚未完全清楚。應繼續(xù)深入研究靈芝深層發(fā)酵前后具體成分變化，檢測其化學結構，探討靈芝深層發(fā)酵液保濕機理。

(3)進一步開發(fā)化妝品保濕功效評價方法，更能科學解釋皮膚保濕性能，完善評價方法，制定相關保濕標準。