膽類中藥體內(nèi)代謝產(chǎn)物甘氨膽酸硫酸鹽同分異構(gòu)體的區(qū)分△

張珂，李瑋，王艷敏，龔興成，曹麗波，宋月林，宋青青，屠鵬飛

北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院 中藥現(xiàn)代研究中心，北京 100029

膽類中藥（如熊膽、蛇膽、牛黃等）多為名貴中藥，具有清肝明目、利膽通腸、解毒消腫之功效，常用于膽結(jié)石等的臨床治療，療效確切[1-3]。膽汁酸為膽類中藥的主要藥效成分。作為重要的結(jié)合型膽汁酸，甘氨膽酸在膽類中藥中廣泛分布，且同分異構(gòu)體較多，如甘氨熊去氧膽酸（GUDCA）、甘氨鵝去氧膽酸（GCDCA）、甘氨去氧膽酸（GDCA）等。甘氨膽酸硫酸鹽為甘氨膽酸體內(nèi)主要代謝產(chǎn)物類型，也廣泛存在同分異構(gòu)體。研究表明，體內(nèi)膽酸硫酸鹽是膽汁淤積的潛在病理標(biāo)志物群[4]，膽汁淤積屬于中醫(yī)理論的黃疸范疇。因此，準(zhǔn)確鑒定甘氨膽酸硫酸鹽化學(xué)結(jié)構(gòu)不僅有利于膽類中藥體內(nèi)藥效物質(zhì)的闡明，也有助于黃疸的病理進(jìn)程及藥物治療效果的精確評估。膽汁酸類成分同分異構(gòu)體的高分辨多級質(zhì)譜圖幾乎一致，常規(guī)液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS）也難以實(shí)現(xiàn)這些同分異構(gòu)體的有效區(qū)分。本課題組前期通過構(gòu)建在線能量分辨質(zhì)譜法（Online ERMS），采集某個離子對在不同碰撞能量下的響應(yīng)值，進(jìn)一步擬合裂解曲線（breakdown graph），獲得相應(yīng)的最佳碰撞能（OCE），實(shí)現(xiàn)了部分同分異構(gòu)體的區(qū)分[5-8]。然而，僅通過單一離子對的OCE 值區(qū)分同分異構(gòu)體過于片面，無法提供各同分異構(gòu)體碎片離子的整體情況。因此，本研究以甘氨熊去氧膽酸-3-磺酸鹽（GUDCA-3-S）、甘氨鵝去氧膽酸-3-磺酸鹽（GCDCA-3-S）、甘氨去氧膽酸-3-磺酸鹽（GDCA-3-S）為研究對象，利用Online ER-MS 策略研究MS2圖譜中主要離子（包括母離子）的豐度隨碰撞能升高的變化趨勢，構(gòu)建裂解曲線組（breakdown graph set），全面深入分析甘氨膽酸硫酸鹽同分異構(gòu)體多級質(zhì)譜行為的差異，以期為膽類中藥體內(nèi)代謝產(chǎn)物的準(zhǔn)確闡明提供科學(xué)依據(jù)，同時也為基于LC-MS 的同分異構(gòu)體快速區(qū)分提供有效的方法。

1 材料

1.1 試藥

對 照 品GUDCA-3-S（批 號：IR-15693）、GCDCA-3-S（批號：IR-15685）及GDCA-3-S（批號：IR-15689）均購自上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司，以上對照品純度經(jīng)高效液相色譜法（HPLC）檢測均大于98%；質(zhì)譜級乙腈、甲酸和甲酸銨均購自美國Thermo-Fisher 公司；二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma 公司；水為實(shí)驗(yàn)室自制Milli-Q 超純水（18.2 MΩ?cm）。

1.2 儀器

LC-20AD 型分析型高效液相色譜儀（包括二元高壓梯度泵、真空脫氣機(jī)、自動進(jìn)樣器、柱溫箱及控制器，日本島津公司）；ACQUITY UPLC HSS T3型色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm，美國Waters公司）；Tripe TOF 6600+型高分辨質(zhì)譜儀和Qtrap 5500型質(zhì)譜儀（美國Sciex 公司）；Milli-Q 型超純水凈化系統(tǒng)（美國Millipore 公司）；ME204 型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司，精確度為0.1 mg）。

2 方法

2.1 對照品溶液的配制

精密稱取對照品GUDCA-3-S、GCDCA-3-S 及GDCA-3-S 適量，分別溶于DMSO 中，配制成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的對照品儲備液。吸取各對照品儲備液適量，用50%乙腈水溶液稀釋成50 μg·mL-1的混合對照品溶液，待用。

2.2 色譜條件

采用Acquity UPLC HSS T3 色譜柱（100 mm ×2.1 mm，1.8 μm），流動相A 為含0.05%甲酸的甲酸銨水溶液（5×10-3mol·L-1），流動相B 為含0.1%甲酸的乙腈，以34%B 等度洗脫10 min；柱溫為35 ℃；流速為0.25 mL·min-1；進(jìn)樣量為2 μL。

2.3 質(zhì)譜條件

Tripe TOF 6600+和Qtrap 5500型質(zhì)譜儀，均配備電噴霧離子源（ESI）；氣簾氣（curtain gas，CUR）壓力為35 psi（1 psi≈6.895 kPa）；霧化氣（nebulizer gas，GS1）壓力為55 psi；輔助氣（auxiliary gas，GS2）壓力為55 psi；噴霧電壓（ionspray voltage，IS）為-4500 V；離子化溫度為550 ℃。Tripe TOF 6600+實(shí)時動態(tài)背景扣除（DBS）觸發(fā)IDA（information-dependent acquisition）模式采集二級圖譜，MS1及MS2采集范圍均為m/z50～700；碰撞能量（CE）為-35 eV；碰撞能量擴(kuò)展值（CES）為-25 eV；Qtrap 5500 采用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式采集數(shù)據(jù)。

2.4 在線能量分辨質(zhì)譜

基于GUDCA-3-S、GCDCA-3-S 及GDCA-3-S 的MS1及MS2高分辨信息，構(gòu)建7對候選離子對，分別為m/z528.3→528.3、528.3→448.3、528.3→404.3、528.3→386.3、528.3→330.2、528.3→97.0，528.3→74.0，進(jìn)一步衍生出7 組擬離子對（PITs），分別為m/z528.300→528.302、528.300→528.301、528.300→528.301 等；m/z528.300→448.300、528.300→448.301、528.300→448.302等；m/z528.300→404.300、528.300→404.301、528.300→404.302 等 ；m/z528.300→386.300、528.300→386.301、528.300→386.302 等；m/z528.300→330.200、528.300→330.201、528.300→330.202 等；m/z528.300→97.000、528.300→97.001、528.300→97.002 等 ；m/z528.300→74.000、528.300→74.001、528.300→74.002 等。每組擬離子對分別以1 eV步長采集CE為-5～-180 eV的質(zhì)譜響應(yīng)。將不同CE 值下的質(zhì)譜響應(yīng)導(dǎo)入GraphPad Prism 7.0 軟件中，通過Gaussian 曲線擬合各離子對的裂解曲線，形成裂解曲線組，而各擬合曲線頂點(diǎn)對應(yīng)的碰撞能為OCE值。

3 結(jié)果

3.1 甘氨膽酸硫酸鹽的質(zhì)譜裂解途徑

負(fù)離子模式下，GUDCA-3-S、GCDCA-3-S 和GDCA-3-S 的MS1圖譜顯示準(zhǔn)分子離子峰均為[MH]-，分別為m/z528.262 0、528.263 9和528.262 7。以GUDCA-3-S 為例，歸屬其二級碎片離子（圖1）。MS2圖譜中基峰離子信號為m/z448.308 6 [M-HSO3]-，表明母離子經(jīng)S-O 鍵斷裂中性丟失SO3，進(jìn)一步中性丟失CO2和H2O，分別產(chǎn)生碎片離子m/z404.313 5[M-H-SO3-CO2]-和386.306 8[M-HSO3-CO2-H2O]-。碎片離子m/z74.025 2（NH2CH2COO-）和96.960 3（HSO4-）分別為結(jié)合型膽酸側(cè)鏈的甘氨酸基團(tuán)以及磺酸基團(tuán)斷裂產(chǎn)生的特征碎片。結(jié)合MS2碎片離子信息和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[4,9-10]，推測GUDCA-3-S、GCDCA-3-S和GDCA-3-S的質(zhì)譜裂解途徑見圖2。由于膽汁酸母核結(jié)構(gòu)中7位羥基相比12 位羥基更容易發(fā)生脫水[9]，在GDCA-3-S 未見碎片離子m/z386.3。

圖1 GUDCA-3-S的二級質(zhì)譜圖

圖2 GUDCA-3-S、GCDCA-3-S和GDCA-3-S可能的質(zhì)譜裂解途徑

3.2 在線能量分辨質(zhì)譜分析

基于高分辨質(zhì)譜提供的前體離子和碎片離子信息，構(gòu)建了m/z528.3→528.3、528.3→448.3、528.3→404.3、528.3→386.3、528.3→330.2、528.3→97.0、528.3→74.0 7 對離子對。其中，GCDCA-3-S未檢出m/z528.3→404.3，GDCA-3-S未檢出m/z528.3→386.6，m/z528.3→330.2 僅在GCDCA-3-S 中檢出，但3 對離子對響應(yīng)過低，不宜選作特征碎片區(qū)分同分異構(gòu)體。

為了進(jìn)一步探究離子的穩(wěn)定性及不同化學(xué)鍵解離的能量關(guān)系，考察了目標(biāo)化合物所有離子對在不同碰撞能下的質(zhì)譜響應(yīng)，通過Online ER-MS 采集7 對離子對在不同CE（-5～-180 eV）下的響應(yīng)值，使用GraphPad Prism 7.0 軟件分別擬合3 個同分異構(gòu)體各離子對的裂解曲線。其中，離子對m/z528.3→528.3的裂解曲線如圖3所示，GUDCA-3-S、GCDCA-3-S 和GDCA-3-S的裂解曲線 從-5 eV 起始，響應(yīng)值隨CE 增大而增高，在-18～-19 eV 響應(yīng)達(dá)到峰值，但差異并不明顯（GUDCA-3-S、GCDCA-3-S和GDCA-3-S峰值的CE分別為-18.48、-18.08、-18.39 eV）。在-19 eV 后響應(yīng)值隨CE值增大而逐漸降低，在-70 eV 附近前體離子m/z528.3 全部解離。這與前期研究發(fā)現(xiàn)的離子對（前體離子m/z值與碎片離子相同）的“S”形裂解曲線不同[11]，推測與膽酸類成分結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，膽酸類為甾體類化合物，具有4個緊密連接的脂環(huán)構(gòu)成的剛性疏水骨架，且有不同數(shù)量的-OH、-CH3和-COOH取代基側(cè)鏈，膽酸離子通過疏水作用和氫鍵會形成聚集離子，聚集離子與單體離子處于動態(tài)平衡[12]。因此，膽酸類化合物離子化時可能會產(chǎn)生[M-H]-、[2M-2H]2-、[3M-3H]3-等前體離子同時通過Q1，隨著CE的增加，[2M-2H]2-、[3M-3H]3-等前體離子需克服分子間作用力產(chǎn)生[M-H]-碎片離子，通過Q3 進(jìn)入檢測器；之后隨著CE 的不斷增加，[MH]-離子解離速率大于其生成速率，于是其響應(yīng)值逐漸下降。

圖3 GUDCA-3-S、GCDCA-3-S和GDCA-3-S的離子對m/z 528.3→528.3的裂解曲線

其余各離子對裂解曲線均呈高斯曲線（圖4），計算所得的裂解曲線方程和OCE 值見表1。GUDCA-3-S、GCDCA-3-S 和GDCA-3-S 結(jié)構(gòu)十分相似，僅有1 個羥基取代位點(diǎn)和構(gòu)象存在差異，不同離子對OCE 差值僅在1 eV 左右。因此，進(jìn)一步對比離子對在碰撞能為-5～-180 eV 的質(zhì)譜響應(yīng)比值（圖5）。3 個同分異構(gòu)體中離子對m/z528.3→528.3與m/z528.3→448.3 的質(zhì)譜響應(yīng)比值在-30 eV 時差異較大，GUDCA-3-S 比值為4.83，GCDCA-3-S 為3.87，GDCA-3-S 為4.08；離子對m/z528.3→97.0與m/z528.3→74.0 在-100 eV 碰撞能下的響應(yīng)比值有明顯差異，分別為2.38、2.76 和3.02，可為同分異構(gòu)體的區(qū)分提供參考。

表1 GUDCA-3-S、GCDCA-3-S和GDCA-3-S中各離子對的擬合曲線方程和最佳碰撞能

圖4 GUDCA-3-S、GCDCA-3-S和GDCA-3-S的裂解曲線

圖5 GUDCA-3-S（tR=2.4 min）、GCDCA-3-S（tR=5.7 min）和GDCA-3-S（tR=6.5 min）的質(zhì)譜響應(yīng)比值

4 討論

質(zhì)譜法可提供化合物多級質(zhì)譜信息用于結(jié)構(gòu)解析，但無法對具有相似質(zhì)譜行為的同分異構(gòu)體進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。本課題組前期建立的Online ERMS 通過改變碰撞能量，依據(jù)目標(biāo)離子對OCE 與斷裂相關(guān)化學(xué)鍵的鍵長、鍵能關(guān)系實(shí)現(xiàn)同分異構(gòu)體的區(qū)分。相較于傳統(tǒng)能量分辨質(zhì)譜法[13]，將針泵注射對照品方式轉(zhuǎn)換為與HPLC 聯(lián)用，一方面實(shí)現(xiàn)了進(jìn)樣的自動化和高通量，另一方面可以實(shí)現(xiàn)不依賴對照品的離子對質(zhì)譜響應(yīng)值的獲取，更適用于復(fù)雜基質(zhì)中同分異構(gòu)體的區(qū)分鑒定。隨著對Online ER-MS 應(yīng)用的擴(kuò)大及對能量和離子對響應(yīng)關(guān)系的進(jìn)一步理解，發(fā)現(xiàn)分析不同碰撞能下所有子離子質(zhì)譜響應(yīng)差異更有利于同分異構(gòu)體的區(qū)分。本研究通過建立主要碎片離子隨碰撞能變化的趨勢圖，即建立了X軸、Y軸、Z軸分別為m/z、離子豐度、碰撞能的三維二級質(zhì)譜圖（3D MS2spectrum）。通過三維二級質(zhì)譜圖，可以獲得化合物在任何CE值的二級質(zhì)譜圖，為構(gòu)建化合物全息質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫提供思路[14]。通過分析大量已知化合物，獲得目標(biāo)離子對的最佳碰撞能，結(jié)合量子化學(xué)計算，構(gòu)建定量結(jié)構(gòu)-最佳碰撞能關(guān)系模型，可以實(shí)現(xiàn)基于LC-MS 的化學(xué)結(jié)構(gòu)精準(zhǔn)鑒定。

本研究采用HPLC-MS采集GUDCA-3-S、GCDCA-3-S和GDCA-3-S 的MS1和MS2離子信息，構(gòu)建離子對，基于Online ER-MS 策略，全面構(gòu)建各離子對的裂解曲線。研究發(fā)現(xiàn)，離子對m/z528.3→528.3（Q1=Q3）響應(yīng)隨CE 值增大先升高后下降（-18～-19 eV 碰撞能范圍內(nèi)達(dá)峰值），推測是由于膽酸類化合物為四環(huán)甾體類化合物，分子間的范德華力易導(dǎo)致多分子離子的產(chǎn)生，需要較高的能量破壞[2M-2H]2-、[3M-3H]3-等前體離子間作用力，進(jìn)而會生成2 倍或者3 倍數(shù)量的[M-H]-。進(jìn)一步分析-5～-180 eV 碰撞能范圍內(nèi)各離子對豐度比值，發(fā)現(xiàn)離子對m/z528.3→528.3 與m/z528.3→448.3、m/z528.3→97.0與m/z528.3→74.0 的質(zhì)譜響應(yīng)比值的差異可為同分異構(gòu)體的區(qū)分提供參考。本研究通過深入比較GUDCA-3-S、GCDCA-3-S 和GDCA-3-S在不同碰撞能下的質(zhì)譜行為，建立裂解曲線組，實(shí)現(xiàn)了甘氨膽酸硫酸鹽同分異構(gòu)體的區(qū)分，為準(zhǔn)確闡明膽類中藥體內(nèi)代謝產(chǎn)物及進(jìn)一步揭示其在體內(nèi)的藥效物質(zhì)和作用機(jī)制提供參考。