石杉堿甲對膿毒癥大鼠腦病的作用機(jī)制

周海銀 隆彩霞 羅 蘭 陳艷瑛 劉萍萍 肖政輝 張樹菊

1.湖南省兒童醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，湖南長沙 410007；2.湖南省兒童醫(yī)院檢驗科，湖南長沙 410007

膿毒癥相關(guān)性腦病是一種彌散性腦功能障礙的疾病，曾被稱為“感染中毒性腦病”“膿毒癥腦病”等[1]。自噬是真核生物中一種進(jìn)化上高度保守的物質(zhì)分解代謝途徑，參與細(xì)胞代謝、蛋白質(zhì)分泌和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)[2-3]。研究報道，膿毒癥相關(guān)性腦病大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞存在自噬現(xiàn)象[4]，但這種自噬與膿毒癥腦病之間的關(guān)系仍不清楚。

石杉堿甲（Huperzine A，HupA）是一種新型石松類生物堿有效單體，具有多靶點(diǎn)作用，除抑制乙酰膽堿酯酶活性外，還能對抗多種因素誘發(fā)的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等神經(jīng)元毒性作用。本研究擬觀察HupA 對膿毒癥大鼠腦病的保護(hù)作用，以及HupA 是否通過核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信號通路調(diào)節(jié)膿毒癥時海馬細(xì)胞自噬。

1 方法與材料

1.1 儀器與試劑

HupA（美國Sigma 公司）；細(xì)胞裂解液和BCA 蛋白含量測定試劑（江蘇碧云天公司，批號：P0013B，K11606D）；NF-κB、LC-3、Beclin1、Rab7 和LAMP-1抗體（美國Abcam 公司，批號：ab320376，ab327450，ab326510，ab326327，ab109390）；熒光倒置顯微鏡（日本Olympus）。

1.2 動物分組與模型建立

選用健康雄性Wistar 大鼠60 只，體重250～300 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗動物有限公司提供，動物合格證號為：SYXK（湘）2018-0011。大鼠在溫度為22～25℃、相對濕度為55%～60%，12 h/12 h 明暗交替的動物房中飼養(yǎng)。

將Wistar 大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分成3 組：假手術(shù)組、模型組和治療組，每組20 只。模型組[盲腸結(jié)扎穿孔（cecal ligation and puncture，CLP）]。依據(jù)參考文獻(xiàn)[5]進(jìn)行CLP 制作膿毒癥模型。假手術(shù)組大鼠盲腸沒有結(jié)扎也沒有被刺穿，其余步驟與模型組均相同，治療組術(shù)前2 h 大鼠腹腔注射HupA[6]（0.04 mg/kg，1 ml）。本研究中動物處置方法符合動物倫理學(xué)3R 標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 生理檢查

將大鼠麻醉后，在股動脈內(nèi)放置留置管，連接iWorx 生物信號記錄儀提供靜脈通道，用于監(jiān)測術(shù)后12 h 各組大鼠平均動脈壓（mean arterial pressure，MAP）和心率（heart rate，HR）。

1.4 HE 染色觀察海馬組織病理改變

建模后第12 小時，取各組大鼠腦組織，于4℃下用4%多聚甲醛固定24 h，行常規(guī)蘇木精、伊紅染色[6]，用倒置光學(xué)顯微鏡拍攝圖像。

1.5 免疫熒光染色觀察海馬組織中LC3 陽性細(xì)胞數(shù)

切片常規(guī)脫蠟至水，檸檬酸鹽緩沖液熱修復(fù)，洗滌切片，滴加10%山羊血清，37℃孵育1 h，同時滴加兔抗LC3 多克隆抗體（1∶200），4℃孵育過夜，洗片后滴加FITC 標(biāo)記的IgG 熒光二抗，濕孵1 h，觀察采用單盲、雙人計算每個視野陽性細(xì)胞個數(shù)[7]。

1.6 Western blot 檢測海馬區(qū)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)

將海馬組織置于預(yù)冷的RIPA 裂解液中進(jìn)行裂解，用BCA 法檢測蛋白濃度，隨后采用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，然后轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST 溶液封閉1 h，分別加入NF-κB、LC-3、Beclin1、Rab7 和LAMP-1 一抗（1∶1000 稀釋），室溫孵育2 h，洗滌，再加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗，ECL法顯色，采用凝膠成像技術(shù)進(jìn)行分析[8]。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組術(shù)后12 h 生命體征

術(shù)后12 h 模型組MAP 低于假手術(shù)組，HR 高于假手術(shù)組（P ＜0.05）。治療組MAP 值高于模型組，HR低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 各組術(shù)后12 h 生命體征比較（）

表1 各組術(shù)后12 h 生命體征比較（）

注：與假手術(shù)組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05；MAP：平均動脈壓；HR：心率。1 mmHg=0.133 kPa

2.2 HupA 對各組大鼠海馬組織病理學(xué)影響

假手術(shù)組與治療組海馬神經(jīng)元基本正常，模型組海馬細(xì)胞紊亂，結(jié)構(gòu)不清楚，神經(jīng)元出現(xiàn)急性創(chuàng)傷性改變，治療組病理改變減輕。見圖1。

圖1 第12 小時各組海馬組織病理學(xué)改變（HE 染色，100×）

2.3 HupA 對大鼠海馬組織中LC3 表達(dá)的影響

第12 小時，假手術(shù)組、模型組和治療組每視野LC3平均陽性細(xì)胞數(shù)分別為：（3.5±0.3）、（16.8±1.5）、（30.4±2.4）個，治療組LC3 陽性細(xì)胞數(shù)高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖2。

圖2 各級組海馬組織中 LC3 表達(dá)（免疫熒光，400X

2.4 海馬組織中NF-κB、LC-3、Beclin1、Rab7 和LAMP-1蛋白表達(dá)

第12 小時，模型組Beclin1，LAMP-1 和Rab7 表達(dá)水平均低于假手術(shù)組，NF-κB、LC3 表達(dá)水平高于假手術(shù)組，治療組Beclin1、Rab7 和LAMP-1 表達(dá)水平高于模型組（P ＜0.05）。見圖3。

圖3 石杉堿甲對大鼠CLP 后12 h 海馬LC3、Beclin1、LAMP-1和Rab7 蛋白表達(dá)的影響（）

3 討論

膿毒癥發(fā)生時線粒體損傷、ATP 生成減少、氧自由基增多等均可導(dǎo)致細(xì)胞自噬增多[9-10]。課題組依據(jù)文獻(xiàn)[5]建立大鼠膿毒癥模型，生命體征檢測發(fā)現(xiàn)：模型組MAP 水平逐漸下降，12 h 到達(dá)底部，說明12 h時膿毒癥發(fā)病最嚴(yán)重，因此后續(xù)應(yīng)對術(shù)后12 h 進(jìn)行研究分析。

HupA 是一種高選擇性、高效的乙酰膽堿脂酶抑制劑，作為治療阿爾茨海默病的潛在藥物備受關(guān)注[11-14]。本研究術(shù)前2 h 大鼠腹腔注射HupA，治療組MAP 水平高于模型組，而HR 下降（P ＜0.05），提示HupA 能減輕大鼠膿毒癥相關(guān)性腦病，生命體逐漸征恢復(fù)；HE染色及免疫熒光觀察發(fā)現(xiàn)，治療組病理改變減輕，提示腹腔注射石杉堿甲能促進(jìn)海馬組織細(xì)胞自噬，減輕病理性改變。

多種細(xì)菌或菌體成分激活巨噬細(xì)胞NF-κB 通路是膿毒癥形成的中心環(huán)節(jié)[15-17]。研究發(fā)現(xiàn)隨著NF-κB表達(dá)量上調(diào)，自噬泡會隨之增加，細(xì)胞增殖卻相應(yīng)減少[18]。LC3 被廣泛用于監(jiān)測自噬體的形成或指示自噬體[19]，LC3 分為LC3Ⅰ和LC3Ⅱ，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值可反映自噬水平。除LC3 外，Beclin1、Rab7 和LAMP-1在動態(tài)自噬過程中起著關(guān)鍵作用[20-22]。免疫熒光觀察發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組海馬組織中LC3 陽性細(xì)胞增多（P ＜0.05），提示膿毒癥使大鼠腦內(nèi)自噬明顯增加；Western blot 檢測結(jié)果，與模型組比較，治療組大鼠NF-κB 蛋白表達(dá)下降，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、LAMP-1、Beclin1 及Rab7 蛋白表達(dá)增加。盡管LAMP-1、Beclin1、Rab7 的增加機(jī)制尚不清楚，但推測海馬組織神經(jīng)細(xì)胞損傷會進(jìn)一步增加自噬發(fā)生[23-25]，誘導(dǎo)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)。此外，免疫熒光檢測也顯示，與模型組比較，治療組LC3 陽性細(xì)胞數(shù)增加（P ＜0.05），這些提示石杉堿甲可能通過抑制NF-κB 表達(dá)，上調(diào)自噬相關(guān)蛋白LAMP-1、Beclin1、Rab7 表達(dá)，提高自噬發(fā)生，發(fā)揮腦神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，石杉堿甲能抑制NF-κB 表達(dá)，促進(jìn)膿毒癥大鼠海馬自噬的發(fā)生，具有神經(jīng)保護(hù)作用，這為膿毒癥腦病提供新的治療策略。