越鞠丸治療血脂異常機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)及分子對(duì)接驗(yàn)證

常 燕 林建國(guó) 姚魁武

1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院心血管科，北京 100053；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，北京 100029

血脂異常，又稱高脂血癥，是指血清中總膽固醇（total cholesterol，TC）和/或甘油三酯（triglyceride，TG）水平升高，包括低、高密度脂蛋白膽固醇血癥在內(nèi)的各種脂質(zhì)代謝紊亂。流行病學(xué)研究表明，TG 水平升高與動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病風(fēng)險(xiǎn)的增加密切相關(guān)，積極有效地預(yù)防和治療血脂異?？梢悦黠@降低動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病的發(fā)病率和死亡率[1]。目前西藥降脂治療主要以他汀類藥物為主，雖能有效降低患者低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein-choles terol，LDL-C）水平，但在治療過程中需監(jiān)測(cè)其安全性，避免藥物潛在的不良反應(yīng)的發(fā)生[2]。中醫(yī)藥干預(yù)血脂異常具有多靶點(diǎn)、多途徑、多層次、副作用小、藥物依賴性低等特點(diǎn)，治療上具有明顯優(yōu)勢(shì)[3]。

越鞠丸出自朱丹溪的《丹溪心法》，由川芎、梔子、蒼術(shù)、香附、神曲組成，是治療郁證之名方，能解因痰、濕、熱、血、食所致諸郁。中醫(yī)將血脂異常歸于“痰濕”“痰瘀”“血濁”等范疇，認(rèn)為痰、瘀、膏、濁均為水谷精微在病理情況下化生的郁滯產(chǎn)物，發(fā)病與中焦脾胃密切相關(guān)[4]?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)越鞠丸具有降低炎癥因子、提高心肌抗氧化能力、調(diào)節(jié)機(jī)體代謝等功能[5]，其中川芎有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用[6]；梔子具有抑菌抗炎、抗氧化、降糖降脂等藥理活性[7]；蒼術(shù)具有調(diào)節(jié)胃腸的功能，通過抑制組織中前列素E2的生成，從而降低炎癥反應(yīng)，對(duì)心血管有保護(hù)作用[8]；香附可降低血液中的血漿纖維蛋白原及血液黏度，從而糾正血脂紊亂，同時(shí)還具有降糖、抗炎、調(diào)節(jié)胃腸功能等藥理作用[9]；神曲具有降血脂的功效。臨床研究證實(shí)，越鞠丸能夠顯著降低血清TC 水平，提高高密度脂蛋白膽固醇與TC 的比值，在調(diào)控血脂方面有明顯效果，但其具體作用機(jī)制尚不清楚[10]。故在此基礎(chǔ)上，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)越鞠丸的活性成分、作用靶點(diǎn)、信號(hào)通路，分析其治療血脂異常的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 越鞠丸的靶點(diǎn)收集

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）以口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類 藥 性（drug likeness，DL）≥0.18 進(jìn)行條件篩選，檢索川芎、蒼術(shù)、梔子、香附的活性成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，借助Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)基因名稱；神曲的活性成分根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)[11]收集獲取，在PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取活性成分化學(xué)結(jié)構(gòu)，通過Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，最后整合得到越鞠丸活性成分及其作用靶點(diǎn)。

1.2 血脂異常靶點(diǎn)收集

通過GeneCards、DrugBank 和OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)，以“hyperlipidemia” “hypercholesterolemia” “hypertriglyceridemia”為關(guān)鍵檢索詞進(jìn)行查找，并對(duì)檢索得到的基因靶點(diǎn)進(jìn)行處理，將上述3 個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫(kù)的靶點(diǎn)整合，刪除重復(fù)值后獲得最終疾病靶點(diǎn)。

1.3 活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的繪制

獲取藥物活性成分作用靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)，運(yùn)用Cytoscape 3.8.2 軟件繪制活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，利用Network Analyzer 分析功能對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行計(jì)算，根據(jù)結(jié)果篩選出核心活性成分。

1.4 核心蛋白的收集

通過STRING 平臺(tái)對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的繪制，將PPI 網(wǎng)絡(luò)信息導(dǎo)入Cytoscape 中，對(duì)蛋白網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行模塊化聚類處理，核心蛋白由CytoNCA 計(jì)算得出。

1.5 基因本體（GO）與京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（KEGG）富集分析

借助Metascape 平臺(tái)對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析，設(shè)定閾值P ＜0.01，并以富集的基因數(shù)目為篩選標(biāo)準(zhǔn)，選出目標(biāo)數(shù)據(jù)，結(jié)果采用R 語(yǔ)言和Excel 2019 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化。

1.6 分子對(duì)接

將“活性成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖中節(jié)點(diǎn)度值排名前5 的活性成分與PPI 網(wǎng)絡(luò)圖中節(jié)點(diǎn)度值排名前4 的核心蛋白進(jìn)行分子對(duì)接，驗(yàn)證其相互作用強(qiáng)度，活性成分結(jié)構(gòu)通過PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)取得，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)由PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取。隨后利用Autodock Vina 1.1.2軟件實(shí)現(xiàn)分子對(duì)接，并將對(duì)接結(jié)果通過LigPlot 和Pymol 2.4.0 軟件優(yōu)化制圖。

2 結(jié)果

2.1 越鞠丸活性成分及其靶點(diǎn)獲取

通過TCMSP 平臺(tái)將篩選條件定為OB≥30%，DL≥0.18，檢索川芎、蒼術(shù)、梔子、香附的活性成分，通過已發(fā)表的文獻(xiàn)搜索神曲的活性成分，經(jīng)篩選收集到藥物活性成分56 個(gè)，其中川芎7 個(gè)、蒼術(shù)9 個(gè)、梔子15 個(gè)、香附18 個(gè)、神曲7 個(gè)，其中有6 個(gè)為共有活性成分，通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)和Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)活性成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，刪除重復(fù)項(xiàng)，共獲取376 個(gè)靶點(diǎn)基因。

2.2 血脂異常靶點(diǎn)獲取

通過GeneCards、DrugBank、OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)，分別收集到潛在靶點(diǎn)1153、58、129 個(gè)，合并靶點(diǎn)并刪除重復(fù)項(xiàng)后，共獲得潛在靶點(diǎn)1237 個(gè)。對(duì)疾病靶點(diǎn)與活性成分靶點(diǎn)取交集，共獲得113 個(gè)交集靶點(diǎn)。

2.3 活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖分析

將113 個(gè)交集靶點(diǎn)借助Cytoscape 進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)圖繪制，見圖1。應(yīng)用Network Analyzer 進(jìn)行計(jì)算分析，得出159 個(gè)節(jié)點(diǎn)、611 條邊，平均度值為7.69。根據(jù)度值篩選出前5 名的活性成分為槲皮素、山柰酚、木樨草素、豆甾醇、漢黃芩素，見表1。推測(cè)上述化合物可能是越鞠丸治療血脂異常的主要活性成分。

圖1 活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

表1 度值前5 的活性成分

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析

將113 個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)，從中獲取PPI 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)，將其數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 中繪制網(wǎng)絡(luò)圖，使用CytoNCA 插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行分析，得到112 個(gè)節(jié)點(diǎn)、1415 條邊，平均度值為25.3，見圖2。圖中節(jié)點(diǎn)大小與顏色深淺代表其度值大小，度值越大，提示該節(jié)點(diǎn)蛋白與其他蛋白作用越廣泛。其中度值排名較高的有AKT1、IL6、VEGFA、TNF、EGF 等核心靶點(diǎn)。

圖2 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO 富集分析

借助Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)113 個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行基因富集分析，生物過程主要涉及細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)、激素刺激、脂多糖的應(yīng)答等過程，分子功能涉及細(xì)胞核受體活性、類固醇結(jié)合、磷酸酶結(jié)合等功能，細(xì)胞組分涉及膜筏、膜微域、膜區(qū)等成分。根據(jù)校正P 值排序，繪制3 個(gè)聚類分析前10 的條目。見圖3。

圖3 基因本體富集分析圖

2.6 KEGG 富集分析

KEGG 通路得到170 個(gè)條目，根據(jù)校正后P 值進(jìn)行排序，將前20 條通路繪制成氣泡圖，見圖4。結(jié)果顯示與血脂異常密切相關(guān)的信號(hào)通路有AGERAGE、TNF、PPAR、insulin 等。通過整合以上數(shù)據(jù)，以大于平均度值（7.69）的活性成分為核心成分，以大于平均度值（25.3）的作用靶點(diǎn)為核心靶點(diǎn)，校對(duì)P 值前10 的生物過程條目和KEGG 為主要生物過程和信號(hào)通路，通過Cytoscape 軟件繪制成分-靶點(diǎn)-生物功能-通路網(wǎng)絡(luò)圖，見圖5。該圖展示了越鞠丸治療血脂異常的主要作用機(jī)制。

圖4 KEGG 富集氣泡圖

圖5 越鞠丸成分-靶點(diǎn)-生物功能-通路網(wǎng)絡(luò)圖

2.7 分子對(duì)接

利用Autodock Vina 軟件將活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖中節(jié)點(diǎn)度值排名前5 的活性成分和PPI 網(wǎng)絡(luò)圖中4 個(gè)關(guān)鍵核心蛋白進(jìn)行分子對(duì)接，利用LigPlot和Pymol 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行輸出。一般來說配體和受體二者結(jié)合越穩(wěn)定，其結(jié)合能就越低。分子對(duì)接結(jié)果顯示，各活性成分與目標(biāo)受體蛋白對(duì)接的結(jié)合能均＜-6 kJ/mol，說明活性成分能夠與配體自發(fā)結(jié)合，并借助氫鍵等分子間作用力形成較為穩(wěn)定的構(gòu)象，具體結(jié)果見表2。分子對(duì)接構(gòu)像見圖6，其中豆甾醇與AKT1（-11.5 kJ/mol）結(jié)合性最好，對(duì)接最穩(wěn)定。

圖6 部分蛋白和活性成分分子對(duì)接圖

表2 核心活性化合物與核心蛋白結(jié)合能（kJ/mol）

3 討論

近年來，我國(guó)人群血脂異常發(fā)病率逐漸呈上升趨勢(shì)，其發(fā)生受肥胖、遺傳因素、飲食、年齡等各個(gè)因素影響?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)血脂異常發(fā)病機(jī)制主要與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、基因多態(tài)性、相關(guān)炎癥因子升高、氧化應(yīng)激增強(qiáng)、腸道菌群失調(diào)相關(guān)[12]。臨床觀察性研究發(fā)現(xiàn)，越鞠丸在降低血清炎癥因子、抗動(dòng)脈粥樣硬化、降脂固斑等方面療效顯著[13-14]。在小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊模型中，通過服用越鞠丸后，小鼠腸道菌群多樣性增多，其血清中TC 和LDL-C 含量明顯降低[15]。

本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析得出，越鞠丸治療血脂異常的藥物活性成分主要有槲皮素、山柰酚、木樨草素、豆甾醇、漢黃芩素。相關(guān)基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞黏附和內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB 信號(hào)通路減輕炎癥過程，降低動(dòng)脈粥樣硬化大鼠的炎癥反應(yīng)，抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展；血漿槲皮素升高后，血清TC 和LDL-C 水平均有降低[16]；木樨草素可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子降低NPC1L1 的表達(dá)，通過調(diào)節(jié)NPC1L1蛋白抑制膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)活性，從而降低血清中膽固醇含量[17]；豆甾醇通過部分阻斷膽固醇的吸收來降低LDL-C 的水平，同時(shí)防止INS-1 細(xì)胞中糖脂毒性誘導(dǎo)的游離膽固醇和活性氧水平的增加，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用[18]。分子對(duì)接提示，上述活性成分與主要核心靶點(diǎn)（AKT1、IL6、VEGFA、TNF）結(jié)合力較強(qiáng)，因此推測(cè)越鞠丸可能通過上述主要活性成分在降低炎癥反應(yīng)、減少脂質(zhì)合成、促進(jìn)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和分布等方面發(fā)揮降脂作用。

通過PPI 網(wǎng)絡(luò)得到AKT1、IL6、VEGFA、TNF 等核心靶點(diǎn)，主要與細(xì)胞代謝、炎癥反應(yīng)、基因表達(dá)、信號(hào)傳導(dǎo)等相關(guān)。其中AKT1 具有調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞（vessel smooth muscle cell，VSMC）的功能，增強(qiáng)VSMC 中AKT1 表達(dá)會(huì)延緩動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的進(jìn)展[19]。VEGFA 作為調(diào)節(jié)脂肪組織血管生成的關(guān)鍵因素，通過調(diào)節(jié)脂肪組織VEGFA 的表達(dá)，對(duì)增強(qiáng)血管生成、減少炎癥反應(yīng)和改善脂肪組織功能有著重要意義[20]。KEGG 富集分析得知，越鞠丸調(diào)治血脂異常主要通過AGE-RAGE、PPAR、insulin 等信號(hào)通路。AGE-RAGE 通過激活NF-κB 誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)氧化應(yīng)激。有學(xué)者認(rèn)為AGE-RAGE 和NF-κB 兩者之間的相互作用與高脂血癥誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，實(shí)驗(yàn)研究表明血清中sRAGE 水平與HDL 呈正相關(guān)，其含量升高可以減弱高脂血癥產(chǎn)生的氧化損傷[21-22]。PPAR 是一種轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)基因表達(dá)以改變組織脂解和血漿脂蛋白代謝，通過激活PPAR 信號(hào)通路調(diào)節(jié)參與脂質(zhì)代謝的PPARα 靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而降低肝細(xì)胞中TG 和TC 水平[23]。腦內(nèi)insulin 信號(hào)通過刺激肝臟TG 分泌而不引起高甘油三酯血癥，來保護(hù)肝臟免受異位脂肪堆積，并且可以改善如肥胖和糖尿病等情況下的肝脂肪變性[24]。

綜上，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)初步預(yù)測(cè)越鞠丸中藥物主要活性成分與核心蛋白結(jié)合，通過調(diào)節(jié)炎癥因子、參與脂質(zhì)代謝和脂肪組織血管生成等方式，調(diào)控AGE-RAGE、PPAR、insulin 等內(nèi)分泌、炎癥信號(hào)通路，以降低氧化損傷，促進(jìn)血脂代謝，改善肝臟功能，糾正機(jī)體脂質(zhì)代謝紊亂。然而，本研究?jī)H從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接層面分析越鞠丸治療血脂異常的作用機(jī)制稍顯單薄，還需進(jìn)一步完善和深入實(shí)驗(yàn)研究的驗(yàn)證，以期為今后的臨床應(yīng)用和基礎(chǔ)研究提供相應(yīng)的藥理依據(jù)。