自噬與非酒精性脂肪性肝病調(diào)控相關(guān)因子的關(guān)系

趙佳鶴，馬欣雨，徐敬婭，段婷婷，張春蕾，李寶龍

1 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 藥物安全性評(píng)價(jià)中心，哈爾濱 150040；2 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 佳木斯學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154000

1 自噬

20世紀(jì)50年代比利時(shí)科學(xué)家Chirstian deDuve發(fā)現(xiàn)了溶酶體，之后在對(duì)大鼠肝細(xì)胞溶酶體的研究中發(fā)現(xiàn)溶酶體中存在大量的包裹細(xì)胞器的吞噬泡，并用自噬對(duì)這種現(xiàn)象命名[1]。東京工業(yè)大學(xué)大隅良典教授利用酵母細(xì)胞展開(kāi)了一系列關(guān)于自噬的研究，發(fā)現(xiàn)了30多個(gè)自噬關(guān)鍵基因(autophagy related gene，ATG)，并于2016年獲得了諾貝爾生理學(xué)獎(jiǎng)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。自噬是細(xì)胞中穩(wěn)定存在的自我降解機(jī)制，通過(guò)自噬途徑可以降解細(xì)胞中衰老死亡的細(xì)胞器、錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)以及其他分子，促進(jìn)了胞內(nèi)物質(zhì)的重新利用并為細(xì)胞生存提供能量。細(xì)胞自噬根據(jù)底物運(yùn)送機(jī)制的不同主要分為3種形式：微自噬、巨自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬 (chaperone-mediated autophagy，CMA)[2]。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中存在的自噬包括巨自噬和CMA。巨自噬主要包括自噬泡的出現(xiàn)、自噬泡包裹降解底物形成自噬體、自噬體與溶酶體結(jié)合降解底物3個(gè)過(guò)程[3]；CMA是依靠熱休克蛋白直接攜帶降解底物至溶酶體降解的過(guò)程[4]。

自噬是人體中重要的保護(hù)機(jī)制，通過(guò)抵抗氧化應(yīng)激發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用[5]，而人體機(jī)能的衰退以及疾病的產(chǎn)生也與自噬受損有關(guān)。心血管疾病、神經(jīng)退行性病、腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6-8]等都與自噬功能受損有關(guān)。在肝臟疾病與自噬的相關(guān)研究進(jìn)展中發(fā)現(xiàn)，自噬與病毒性肝炎、酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝、急性肝損傷、藥物性肝損傷、肝纖維化、肝癌都有關(guān)聯(lián)[9]。因此，自噬途徑(激活或抑制自噬)可能成為相關(guān)疾病治療的新策略。

2 非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)

NAFLD是指以代謝異常為主要致病因素的脂肪性肝病，目前國(guó)際專家共識(shí)建議將其命名改為代謝相關(guān)脂肪性肝病，其診斷主要包括超重或肥胖、2型糖尿病、體型較瘦或體型正常但伴有代謝紊亂[10]。脂肪性肝病的發(fā)病原因主要為肝細(xì)胞中的脂質(zhì)沉積過(guò)度引起脂肪變性[11]，進(jìn)一步發(fā)展可以成為肝纖維化、肝硬化以及肝細(xì)胞癌。我國(guó)NAFLD發(fā)病率在13%～43%，且每年新增患病人數(shù)在4%左右[12]。NAFLD是心血管疾病、糖尿病等的重要危險(xiǎn)因素[13]。根據(jù)精準(zhǔn)醫(yī)療的觀點(diǎn)，目前尚無(wú)有效的專門(mén)治療藥物，探討NAFLD的發(fā)生機(jī)制就顯得尤為重要。

3 自噬與NAFLD的關(guān)系

自噬除了可以降解蛋白質(zhì)、細(xì)胞器之外，還可以降解細(xì)胞中的脂質(zhì)，通過(guò)自噬途徑選擇性降解細(xì)胞中脂質(zhì)的生理過(guò)程稱為“脂噬”[14]。脂噬作為一種特殊類型的自噬，扮演著維持細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)平衡的角色[15]。這一發(fā)現(xiàn)帶來(lái)一個(gè)新的思路，是否可以通過(guò)自噬的途徑減輕細(xì)胞內(nèi)的脂肪堆積，緩解脂質(zhì)代謝紊亂。

3.1 自噬與NAFLD的發(fā)生發(fā)展 在NAFLD發(fā)生的早期階段肝臟中自噬處于增強(qiáng)狀態(tài)，隨著疾病進(jìn)展到后期階段自噬逐漸被抑制。自噬通量分析結(jié)果也表明自噬合成與降解發(fā)生于早期，隨著時(shí)間推移而逐漸被抑制[16]。由于肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的蓄積得不到有效控制才會(huì)由單純性脂肪肝向非酒精性脂肪性肝炎、肝纖維化進(jìn)展。這一結(jié)果恰恰與自噬活性的改變有關(guān)，表明自噬可能參與肝細(xì)胞脂肪變性的進(jìn)展。

3.2 自噬與脂肪滴(LD)的降解 NAFLD的主要病理表現(xiàn)是肝細(xì)胞中LD的大量蓄積引起脂肪變性，研究[17]表明降解LD可以依靠自噬途徑。臨床以及實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)脂肪變性的肝臟中CMA的功能受損。Plin5參與調(diào)節(jié)細(xì)胞脂滴內(nèi)中性脂肪的合成及分解，在機(jī)體脂質(zhì)代謝平衡中發(fā)揮核心作用[18]。Plin5既是CMA的特異性底物又是LD降解的前提，CMA誘導(dǎo)的Plin5降解的中斷阻礙了LD的分解[19]。另一方面，最終降解脂滴依靠自噬體的產(chǎn)生，而自噬體表面覆蓋的磷脂的缺乏似乎限制了自噬的進(jìn)程。磷酸膽堿胞苷轉(zhuǎn)移酶β3(CCTβ3)是細(xì)胞中磷脂合成的限速酶，在饑餓誘導(dǎo)的長(zhǎng)時(shí)間自噬存在的研究中發(fā)現(xiàn)，磷脂只聚集在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合了CCTβ3的脂滴周?chē)@種脂滴是由細(xì)胞內(nèi)降解后產(chǎn)生的脂肪酸再形成的，參與構(gòu)建新的自噬體，這一點(diǎn)與外源性脂肪酸存在無(wú)關(guān)[20]。這可能解釋了NAFLD中自噬活性降低可能與外源性脂肪酸不斷攝入，自身的脂質(zhì)分解受阻不能產(chǎn)生自噬所需的膜磷脂有關(guān)。

4 自噬與NAFLD調(diào)控因子的相關(guān)性研究

4.1 自噬與NAFLD炎癥進(jìn)展相關(guān)因子

NAFLD的發(fā)生發(fā)展歸因于能量代謝穩(wěn)態(tài)的失衡，這其中涉及能量感受器的變化以及脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)因子的表達(dá)水平變化。因此，自噬與NAFLD的內(nèi)在聯(lián)系就可以從能量調(diào)節(jié)以及蛋白表達(dá)調(diào)控兩方面入手，這包括腺苷酸磷酸化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK)、脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)因子以及非編碼RNA等。

4.1.1 AMPK AMPK是機(jī)體內(nèi)能量代謝的樞紐，被稱為機(jī)體能量感受器，既感受著細(xì)胞內(nèi)能量的變化又可以調(diào)節(jié)下游自噬關(guān)鍵蛋白的活化。

AMPK通路是維持線粒體健康的關(guān)鍵因素，通過(guò)調(diào)控線粒體的融合避免線粒體損傷[21]，而線粒體功能障礙又是NAFLD中脂肪酸分解速率減慢的重要因素。線粒體蛋白電壓依賴性離子通道1(VDAC1)可以調(diào)節(jié)細(xì)胞中AMPK/mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[22]，在NAFLD的進(jìn)展中發(fā)現(xiàn)，VDAC1介導(dǎo)的線粒體膜脂質(zhì)成分中心磷脂的轉(zhuǎn)移導(dǎo)致線粒體功能障礙[23]，而這一原因也是加劇NAFLD向肝癌發(fā)展的重要因素。線粒體功能障礙，其中的脂肪酸β氧化也受到抑制，胞內(nèi)AMP/ATP比值升高可以激活A(yù)MPK途徑啟動(dòng)自噬，修復(fù)線粒體損傷。石斛合劑可通過(guò)活化AMPK提高自噬相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)錄因子EB、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3Ⅱ(LC3Ⅱ)的表達(dá)，激活自噬，逆轉(zhuǎn)高糖高脂對(duì)肝細(xì)胞的損傷[24]。

Lu等[25]通過(guò)比較高脂飲食誘導(dǎo)的野生型小鼠和載脂蛋白E(ApoE)基因敲除鼠的血脂、肝損傷程度、自噬相關(guān)蛋白活性，發(fā)現(xiàn)基因敲除鼠的血脂和肝損傷程度明顯增加，自噬相關(guān)蛋白明顯下調(diào)。加入AMPK后，相關(guān)的病理表現(xiàn)和蛋白表達(dá)情況得到恢復(fù)，表明ApoE可能參與AMPK的活化，ApoE的缺乏通過(guò)抑制AMPK-mTOR途徑抑制自噬過(guò)程，導(dǎo)致肝脂質(zhì)水平和損傷程度明顯增加。Wu等[26]發(fā)現(xiàn)熊去氧膽酸(UDCA)可使B細(xì)胞淋巴瘤因子-2/Bax和B細(xì)胞淋巴瘤因子-2/Beclin1蛋白復(fù)合物解離，抑制細(xì)胞凋亡和改善自噬，改善肝脂肪變性。當(dāng)加入AMPK抑制劑后，其作用效果抵消。這表明UDCA是通過(guò)激活A(yù)MPK進(jìn)而使復(fù)合物解離，達(dá)到抑制肝細(xì)胞凋亡、改善細(xì)胞自噬、減輕肝脂肪變性的目的。蘋(píng)果多酚(APE)是一種天然制劑，可以有效緩解復(fù)合脂肪酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞中脂質(zhì)沉積，其主要作用包括增強(qiáng)自噬活性、恢復(fù)溶酶體酸化、抑制脂質(zhì)合成并可輕度促進(jìn)脂肪酸氧化。進(jìn)一步的研究[27]發(fā)現(xiàn)，APE通過(guò)上調(diào)沉默調(diào)節(jié)蛋白1的表達(dá)，激活肝激酶B1/AMPK途徑，抑制下游mTOR的信號(hào)傳導(dǎo)，啟動(dòng)自噬，從而有效緩解脂肪酸誘導(dǎo)的脂質(zhì)積累。

4.1.2 脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)因子

脂質(zhì)代謝調(diào)控因子，如法尼醇X受體(FXR)與過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)α、碳水化合物反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(ChREBP)與PPARγ、Smad泛素化調(diào)節(jié)因子1(Smurf1)與固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(SREBP-1c)等，主要負(fù)責(zé)脂質(zhì)的合成或分解過(guò)程，正常人體中脂質(zhì)變化處于動(dòng)態(tài)平衡，在這種情況下不會(huì)出現(xiàn)脂質(zhì)過(guò)度蓄積。受環(huán)境因素、飲食因素、外界損傷因素等，脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)遭到破壞，相應(yīng)的代謝調(diào)節(jié)因子的表達(dá)水平發(fā)生異常就會(huì)出現(xiàn)脂質(zhì)代謝紊亂。因此，通過(guò)研究脂質(zhì)代謝調(diào)控因子在脂代謝中如何發(fā)揮作用就可以達(dá)到緩解脂肪變性的目的。

4.1.2.1 FXR與PPARα 肝臟中LD大量積累的原因在于脂肪酸的合成與代謝穩(wěn)態(tài)遭到破壞。PPARα和FXR屬于核受體，在體內(nèi)脂肪酸的代謝中具有交互作用，前者參與脂肪酸氧化進(jìn)程，為機(jī)體提供能量；后者抑制脂肪酸的合成，避免其在細(xì)胞內(nèi)的堆積[28]。進(jìn)食狀態(tài)下FXR被激活，肝臟自噬處于抑制狀態(tài)，F(xiàn)XR基因敲除后自噬增強(qiáng)。禁食狀態(tài)下PPARα被激活，自噬增強(qiáng)，敲除PPARα基因，自噬受到抑制?？梢?jiàn)自噬的表達(dá)也受細(xì)胞內(nèi)脂代謝調(diào)控因子的調(diào)控[29]。

4.1.2.2 ChREBP與PPARγ ChREBP具有恢復(fù)外界刺激引起的肝細(xì)胞ATP穩(wěn)態(tài)受損的作用，這一過(guò)程涉及到ChREBP轉(zhuǎn)錄水平的增加以及AMPK的活化[30]。高碳水化合物飲食通過(guò)提高ChREBP與PPARγ啟動(dòng)子區(qū)的DNA結(jié)合能力，促進(jìn)PPARγ的轉(zhuǎn)錄，顯著增加肝細(xì)胞脂質(zhì)積累誘發(fā)NAFLD產(chǎn)生，同時(shí)激活自噬[31]。PPARγ既是脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵因子，又是自噬的激活因子。PPARγ的表達(dá)增加可以檢測(cè)到LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和AMPK的活化水平均升高；抑制PPARγ的表達(dá)后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和AMPK的活化水平均降低，表明PPARγ可以通過(guò)自噬緩解脂質(zhì)堆積并降低總膽固醇[32]。

4.1.2.3 Smurf1與SREBP-1c Smurf1的缺失可以減少肝細(xì)胞中脂滴和甘油三酯的積累，SREBP-1c 是介導(dǎo)脂肪從頭合成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，Smurf1通過(guò)阻止SREBP-1c與泛素E3連接酶FBW7A結(jié)合，保護(hù)SREBP-1c免受泛素化和降解，參與肝細(xì)胞中脂質(zhì)的積累過(guò)程[33]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明SREBP-1c可能通過(guò)抑制自噬功能參與大鼠NAFLD發(fā)生。因此Smurf1的作用在于通過(guò)防止SREBP-1c被降解，進(jìn)而抑制自噬，導(dǎo)致脂肪變的發(fā)生[34]。

4.1.3 非編碼RNA

非編碼RNA是細(xì)胞中不參與基因編碼的RNA片段，但是操控著基因從轉(zhuǎn)錄到翻譯的過(guò)程。根據(jù)RNA片段大小可以分為小分子RNA和長(zhǎng)鏈非編碼RNA兩大類，脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)因子的表達(dá)水平的變化受到非編碼RNA的調(diào)控。在脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)過(guò)程中，非編碼RNA既可以調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白，又可以調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。因此非編碼RNA可能作為一個(gè)樞紐參與自噬過(guò)程和肝脂肪變性的調(diào)節(jié)。

4.1.3.1 轉(zhuǎn)運(yùn)RNA片段(tRNA Fraction，tRF)-3001b tRF是來(lái)源于tRNA前體的小分子非編碼RNA片段，其中一部分tRF 通過(guò)作為miRNA發(fā)揮其生物功能。自噬生長(zhǎng)阻滯信號(hào)通過(guò)誘導(dǎo)tRNA半分子(tRF的一種類型)降解和回收閑置的蛋白質(zhì)。有研究[35]表明，tRFs有抵抗肝脂肪變性的作用。Zhu等[36]研究發(fā)現(xiàn)tRF-3001b是病理狀態(tài)下小鼠肝組織中變化最為明顯的tRNA片段，通過(guò)沉默tRF-3001b發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)合成減少，自噬表達(dá)增加。在此基礎(chǔ)上加入自噬抑制劑，結(jié)果與之相反，表明tRF-3001b對(duì)脂質(zhì)合成的影響是依賴于自噬途徑。進(jìn)一步研究tRF-3001b與自噬關(guān)鍵基因的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，tRF-3001b是通過(guò)靶向抑制自噬相關(guān)基因Prkaa1的表達(dá)，促進(jìn)脂質(zhì)的形成，參與肝脂肪變性進(jìn)程。

4.1.3.2 microRNA(miR)-188 miRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的非編碼單鏈RNA分子，在動(dòng)植物中參與轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)的調(diào)控。功能主要包括促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)損傷和調(diào)控自噬與凋亡[37-38]。miR-188作為miRNA的一種類型，具有促進(jìn)癌癥發(fā)生發(fā)展、加重細(xì)胞凋亡程度、緩解神經(jīng)退行性疾病、調(diào)節(jié)與年齡相關(guān)的脂肪細(xì)胞的分化等功能[39-42]。Liu等[43]研究發(fā)現(xiàn)miR-188可以在肝脂質(zhì)代謝中起到負(fù)調(diào)控作用。在高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肝臟中，過(guò)表達(dá)miR-188可以加重肝脂肪變性和胰島素抵抗；抑制miR-188可以起到緩解的效果。其中miR-188在糖脂代謝中作用的發(fā)揮依靠自噬途徑，ATG12是其作用發(fā)揮的靶向基因。miR-188通過(guò)靶向抑制自噬相關(guān)基因ATG12的表達(dá)，阻礙肝臟自噬進(jìn)程，進(jìn)而加重了肝脂肪變性以及胰島素抵抗效果。

4.1.3.3 結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1 肝X受體(liver X receptor，LXR)是一種配體依賴的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控著脂類、膽固醇等的代謝與穩(wěn)態(tài)。hsa-miR-613在LXRα的自動(dòng)調(diào)整中發(fā)揮著重要作用，通過(guò)靶向LXRα的3′端非轉(zhuǎn)錄區(qū)，調(diào)控內(nèi)源性LXRα的表達(dá)情況[44]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1作為與miR-613競(jìng)爭(zhēng)的內(nèi)源性RNA以LXR反應(yīng)元件依賴性的方式，抑制miR-613增加LXRα的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)肝臟中脂滴的形成和NAFLD的發(fā)生[45]。LXRα是let-7a和miR-34a的轉(zhuǎn)錄因子，ATG4B和Rab-8B參與自噬體和自噬溶酶體的形成，LXRα通過(guò)誘導(dǎo)let-7a和miR-34a的表達(dá)下調(diào)ATG4B和Rab-8B的水平，抑制自噬，從而引起線粒體中的氧消耗量和線粒體跨膜電位的降低即線粒體損傷，最終引起肝脂肪變性[46]。

4.2 自噬與NAFLD纖維化進(jìn)展相關(guān)因子

NAFLD所導(dǎo)致的炎性反應(yīng)如果得不到有效的遏制就會(huì)繼續(xù)向肝纖維化進(jìn)展，而肝纖維化也是肝損傷的一種常見(jiàn)病理表現(xiàn)。在緩解肝纖維化方面自噬也起到了重要的參與作用。肝纖維化的產(chǎn)生與許多蛋白表達(dá)有關(guān)，而這些蛋白多是通過(guò)損傷自噬發(fā)揮促纖維化作用，其中包括骨橋蛋白(osteopontin，OPN)和環(huán)氧化物酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)等。靶向促纖維化關(guān)鍵蛋白可以有效減慢肝脂肪變性進(jìn)程，發(fā)揮肝細(xì)胞保護(hù)作用。

4.2.1 OPN OPN是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，具有促纖維化的作用，與NAFLD的發(fā)病密切相關(guān)。研究[47]表明，OPN通過(guò)與受體結(jié)合素αVβ3和αVβ5結(jié)合抑制NAFLD小鼠模型中自噬體與溶酶體的結(jié)合，損傷自噬。抗OPN治療可以有效緩解肝脂肪變性以及自噬損傷。

4.2.2 COX-2 COX-2過(guò)表達(dá)引起的炎癥可以誘導(dǎo)纖維化的產(chǎn)生，在NAFLD中COX-2的水平也發(fā)生了改變[48]。NS398是COX-2的抑制劑，可以誘發(fā)自噬的產(chǎn)生[49]，表明COX-2對(duì)自噬具有抑制作用。COX-2引起的肝細(xì)胞損傷的加劇可能與抑制自噬有關(guān)。

5 小結(jié)

AMPK、脂代謝調(diào)控因子、非編碼RNA等既參與肝臟中的脂質(zhì)代謝過(guò)程又參與了自噬關(guān)鍵蛋白的調(diào)控，這些NAFLD調(diào)控的相關(guān)因子可以通過(guò)自噬途徑緩解肝脂肪變性。此外，借助自噬的方法也可以使某些蛋白表達(dá)下調(diào)，阻止肝脂肪變性向肝纖維化進(jìn)展。因此，自噬與NAFLD具有明顯的相關(guān)性，通過(guò)靶向相關(guān)因子改善自噬可以達(dá)到緩解肝脂肪變性的目的。隨著人們對(duì)NAFLD的深入了解，一系列的關(guān)鍵機(jī)制將會(huì)被發(fā)現(xiàn)。自噬作為進(jìn)化中高度保守的存在也將會(huì)在NAFLD的精準(zhǔn)治療中發(fā)揮作用。自噬在NAFLD中由激活變?yōu)橐种疲@個(gè)臨界狀態(tài)可能是臨床治療的一個(gè)關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)。同時(shí)，自噬介導(dǎo)的肝臟中脂質(zhì)降解產(chǎn)物的后續(xù)代謝過(guò)程也是不可忽視的問(wèn)題。此外，自噬作為一把雙刃劍，如何更加充分有效發(fā)揮它的有益功能也是需要解決的問(wèn)題。因此，自噬在NAFLD中發(fā)揮作用的研究?jī)H僅是一個(gè)開(kāi)始，仍需深入研究。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：李寶龍、趙佳鶴負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，資料分析，撰寫(xiě)論文，修改論文；馬欣雨、徐敬婭、段婷婷參與收集分析文獻(xiàn)資料；李寶龍、張春蕾負(fù)責(zé)擬定寫(xiě)作思路，指導(dǎo)撰寫(xiě)文章并最后定稿。