竹類植物種質資源鑒定技術研究進展

汪之波，許 濤，李曉鴻

(天水師范學院生物工程與技術學院/甘肅省農(nóng)業(yè)固體廢棄物資源化利用重點實驗室，甘肅 天水 741001)

竹類植物是禾本科(Gramineae)竹亞科(Bambusoideae)的統(tǒng)稱。全世界的竹類植物有107屬1 300多種[1]，在非洲、亞洲、拉丁美洲等水。熱條件較好并受季風氣候影響的熱帶、亞熱帶地區(qū)廣泛分布，亞洲是竹類植物的分布中心[2]我國擁有豐富的竹類植物資源，含 34 屬 534 余種(含變種)[3]。從竹類的種類、面積、蓄積等方面我國均居世界首位，其中以江西、福建、湖南、浙江4個省最多，分布面積占全國竹林總面積的 60.7%。

竹子開花周期長，很難采集到經(jīng)典分類學鑒定所需要的花，因此其種質資源的鑒定長期以來是分類學中的難點問題。隨著現(xiàn)代技術的發(fā)展，植物種質鑒定分析技術不斷出現(xiàn)。筆者在查閱國內(nèi)外竹類種質資源鑒定資料的基礎上，整理了學者們在竹類研究方面所運用的各類鑒定方法，并介紹了每類鑒定方法的優(yōu)點及存在的不足，希望為今后竹類植物種質資源鑒定提供借鑒，也為竹類植物資源的保護和可持續(xù)利用提供依據(jù)。

1 分類與鑒定

1.1 形態(tài)學分類法

1.1.1以生殖體(花果形態(tài)和花序)為主要分類依據(jù) 目前以生殖體分類鑒定的主要有兩類：一類是以花部結構和果實類型為依據(jù)的分類系統(tǒng)，主要有：①Munro系統(tǒng)：Munro將全世界竹類植物21屬170種分為Arundinarieae、Bambuseae和Bacciferae 3類，前兩類為木本竹類，后一類為草本竹類[4]；②Bentham系統(tǒng)：Bentham將竹類植物分為北美箭竹族、牡竹族、赤竹亞族和梨竹族4個亞族；③E. G. Camus系統(tǒng)； Hohtum根據(jù)子房解剖結構竹類分為思勞竹型、刺竹與牡竹型、銳藥竹型和北美箭竹型4個類型[5]。

另一類是以真假花序為依據(jù)的分類。如耿以禮根據(jù)花序類型把我國竹類20屬71種分為箭竹系和刺竹系；根據(jù)花序位置把箭竹系分為箭竹亞族和苦竹亞族，把刺竹系依據(jù)果實性狀、小穗含花數(shù)目等一系列特征分為簕竹族、梨竹族、牡竹族和剛竹族[6]。后來耿伯介在1996版的修訂系統(tǒng)中又將中國竹類植物分為2超族6族5亞族37屬[7]。

1.1.2以營養(yǎng)體(根莖)為主要分類依據(jù) 竹類植物很少開花，一旦開花便會造成整片竹林死亡，因此以花果為依據(jù)的分類鑒定非常困難，偏差也較大。所以植物學家更多選擇營養(yǎng)體來做分類研究，主要是以地下莖、稈籜及維管束解剖結構等特征來鑒定竹種。耿伯介等研究了竹類地下莖，有合軸叢生、合軸散生、復軸混生、單軸散生4種類型，是分屬的依據(jù)；稈籜的籜鞘和籜片的形態(tài)與習性也是重要的竹種鑒定特征；稈維管束通常有斷腰型或雙斷腰型、緊腰型和開放型，通過對維管束解剖可對竹種進行鑒別[8]。通過此類特征，耿伯介等制定了中國竹類營養(yǎng)體分屬檢索表。王正平以竹類地下莖、枝、芽、稈籜等為依據(jù)，把我國竹類分為4族8亞族，相比于耿式系統(tǒng)取消了超族這一分類等級[9]；丁雨龍等提出竹葉解剖結構也可為竹子分類提供基礎[10]；溫太輝等研究了竹類 5 族 21 屬 30 種淀粉形態(tài)和果實外部形態(tài)，為竹屬系統(tǒng)分類提供了重要參考[11]。

由于竹類少開花，大多營養(yǎng)體特征不穩(wěn)定且易變，又加之學者們對于竹種分類標準不同，許多竹類的歸屬都存在爭議，就連一些常見種也常出現(xiàn)在不同歸屬位置，因此僅靠利用形態(tài)特征來進行竹種鑒定困難重重，也很容易發(fā)生分類上的混亂[12]。為了更好地對竹種進行鑒定，利用現(xiàn)代分類技術就顯得很有必要。

1.2 現(xiàn)代分類技術

1.2.1細胞分類學方法 國內(nèi)外現(xiàn)有200多種竹子進行過細胞學研究[13]。一部分學者研究認為，散生竹的染色體數(shù)目為48，叢生竹的染色體數(shù)目為72，且認為竹類是以染色體基數(shù)X=12的六倍體或四倍體。方偉等對10種散生竹的染色體進行研究，結果表明散生竹染色體數(shù)目大多數(shù) 為48[14]；張光楚等發(fā)現(xiàn)部分叢生竹染色體數(shù)目變異較大，有48、56、64、70、72、84、96這幾種類型[15]；李秀蘭等對94種叢生竹的染色體研究表明，雖然其染色體數(shù)目不恒定，但有一定規(guī)律可循，一般以2n=70±2的形式來表示，同時發(fā)現(xiàn)其體細胞在有絲分裂時有染色體著絲粒融合現(xiàn)象[16]，從而導致其染色體數(shù)目不穩(wěn)定。

1.2.2數(shù)量分類法 數(shù)量分類法對于植物分類非常有用，因與結果的正確性有直接關系，所以在性狀選取是否完善和準確方面要求很高[2]。竹類植物在數(shù)量分類學方面的研究相對較少。陳守良等利用數(shù)量分類法以53個特征性狀對中國13屬21種散生竹進行分類研究，提出茶稈竹屬應該從苦竹亞族中分離出來，并入赤竹亞族，赤竹屬和華箬竹屬應該歸并，短穗竹屬、苦竹屬以及青籬竹屬應獨立存在，并說明利用數(shù)量分類時要合理選擇原始性狀[17]；李德銖等選用了60個性狀對15種竹子進行了分析，支持廣義牡竹屬的劃分[18]；高智慧等利用Fuzzy聚類分析對17種散生竹的15個維管束特征進行研究，得出與傳統(tǒng)分類基本一致的結果[19]；張漢堯等對14個竹種的41個性狀(形態(tài)標記)進行研究，，在竹種資源的數(shù)量分類方面提供了值得借鑒的資料[20]；李林等也使用數(shù)量分類對竹類植物的類群關系進行了研究，得到了可信的結果[5]。這些研究表明，數(shù)量分類學在竹類植物的屬種關系研究中具有較高的價值。

1.2.3生化分析法 生化分析主要是指應用同工酶，同工酶是基因的直接表達產(chǎn)物。目前應用同工酶鑒定種質在禾本科植物中已較為普遍。 如黃敏仁等于1983年對14個竹種進行同工酶分析，支持將剛竹屬分為剛竹組、哺雞竹組和水竹組，同時發(fā)現(xiàn)剛竹屬的酯酶同工酶(EST)和過氧化物酶同工酶(POD)穩(wěn)定，且具有顯著的種屬專一性[21]；袁文海等分析了20種3變種8變型剛竹屬的淀粉酶同工酶，指出淀粉酶同工酶在竹種鑒定上具有重要參考價值[22]。李升峰等利用EST和POD對青籬竹族8屬16種竹種進行分析，得出POD對營養(yǎng)體特性比較敏感，EST可以很好地反映花部特征，也表明同工酶研究在竹類植物鑒定中較為可靠[23]；1990年，李升峰利用黃酮化合物對散生竹9屬18種竹子做了分析研究，結果表明黃酮在散生竹分類方面具有指導意義[24]； 1黃承才等也研究了9 屬 27 種散生竹的EST和POD，表明POD譜存在明顯的種間差異，因此可以利用酶譜特征及酶譜距離作為竹種鑒定依據(jù)，而EST譜種間差異小，不適用于做竹種分類的鑒別特征，但能反映出種間的親緣關系[25]；方偉等對叢生竹5屬28種竹子的谷氨酸草酰乙酸轉氨酶(GOT)進行了研究，發(fā)現(xiàn)GOT穩(wěn)定，可以用于竹種分屬鑒定，而且EST 和 POD 種間分化大，可作為種的鑒定依據(jù)[26]。

1.2.4DNA分子標記法 分子標記技術是 DNA 水平遺傳多態(tài)性的直接反映，是繼形態(tài)學、細胞學、生物化學等之后發(fā)展起來的一類新型研究手段。20世紀80年代分子標記已應用于竹類植物研究，通過分析竹種的遺傳變異規(guī)律，可為竹種鑒定提供科學的理論依據(jù)。目前竹類研究中主要使用的有 SSR、RFLP、AFLP和RAPD等分子標記技術[27]。DNA分子標記憑借多態(tài)性高、數(shù)量多、不受環(huán)境與季節(jié)條件的限制、不影響目標性狀表達、能夠鑒別出純合體和雜合體以及可以提供完整的遺傳信息等優(yōu)勢，成為了該領域的研究熱點[28]。

(1)SSR標記。SSR標記具有共顯性、高多態(tài)性、選擇性中性和多等位基因的特點，因此在竹種鑒定中常被選用。李淑嫻等利用水稻SSR引物對青籬竹屬分子系統(tǒng)做了研究，他們將DNA進行隨機擴增，得到了一些特異性條帶，對青籬竹屬相關屬及屬下一些竹種的關系提供了新的研究結果[29]；對印度箣竹進行基因文庫篩選和Southern雜交，將得到了6個SSR引物并對18個竹種進行了擴增分析[30]；為研究澳洲竹種開花現(xiàn)象，設計了9對SSR引物并測序了擴增產(chǎn)物[31]；利用EST-SSR標記對11屬的44個竹種間的遺傳變異做了檢測，將這些竹種分為兩類，即叢生竹和散生竹，與形態(tài)學根據(jù)地下莖合軸與單軸的分類結果一致，之后又將曲竿竹和淡竹從紅邊竹中檢測出來；盧江杰等利用SSR標記對3個散生竹雜交竹種的真?zhèn)芜M行了鑒定[32]。

(2)RFLP標記。RFLP標記目前多用于剛竹屬的研究。如應用RFLP標記對剛竹屬26種的36個不同基因型進行了遺傳變異和分類研究，根據(jù)種間親緣關系遠近將它們分為兩類，得出與形態(tài)學分類中以花序為依據(jù)的分類方法相同的結果[33]；在細胞器層面RFLP標記也有應用，如利用15種限制性內(nèi)切酶研究了亞洲竹亞科16屬的葉綠體 DNA，以便確定這些屬之間的系統(tǒng)發(fā)育關系，最終得出與營養(yǎng)體和雄蕊為分類依據(jù)大體一致的分類結果，可見葉綠體DNA在竹類植物系統(tǒng)發(fā)育研究很有價值；還有通過對日本剛竹屬 13個竹種的線粒體 DNA研究，發(fā)現(xiàn)9個種存在明顯的多態(tài)性，從而證實了這些竹種線粒體 DNA與系統(tǒng)發(fā)育的關系[34]。

(3)RAPD標記。方偉等用RAPD標記對不同栽培型的雷竹及其近緣種進行分析，結果表明不同栽培型雷竹之間的親緣關系密切，且明顯聚在一起[35]；吳益民等對鳳尾竹、孝順竹、白綠竹、綠竹4個竹種進行多態(tài)性分析，構建了RAPD指紋圖譜[36]；師麗華發(fā)現(xiàn)利用RAPD標記可以很好地區(qū)分毛竹的栽培型與近緣種，從而認為分子標記在今后將成為種內(nèi)分類的重要工具[37]。余學軍等利用RAPD技術區(qū)分了綠竹的不同栽培型[38]。楊光耀等分析了幾種苦竹的種間遺傳相似性，結果表明：宜興苦竹與苦竹關系密切，不支持形態(tài)學分類中將中國苦竹與日本苦竹分為兩類[39]。

(4)AFLP標記。AFLP被稱為“最有力的分子標記”或“下一代分子標記”[33]，由于可在一次實驗中檢測多段多態(tài)性片段，因而被廣泛使用。如根據(jù)AFLP產(chǎn)生的特異性條帶得出了麻竹屬、巨竹屬、竹屬和泰竹屬的15個竹種之間的親緣關系[40]；還有對15個竹種AFLP多態(tài)性進行研究，對不同的竹種進行區(qū)分，鑒別了特殊竹種的基因型；通過考察剛竹屬竹種之間系統(tǒng)發(fā)育關系，得到了大量可用來區(qū)別竹種的AFLP標記，并將這些竹種分成了3個大類；運用3對選擇性引物組合對日本矮竹進行AFLP研究，鑒定出22個無性系[32]。

1.2.5其他技術 除了上述形態(tài)、生化和分子標記技術外，越來越多的其他新技術應用到竹類植物的分類鑒定中，如李倫應用傅里葉變換紅外光譜結合主成分分析和聚類分析技術對竹類植物進行分類研究結果表明 FTIR 結合統(tǒng)計分析能夠在種水平對部分竹亞科植物鑒別分類[41]。論文作者應用此技術鑒定了華西箭竹、缺苞箭竹、糙花箭竹和巴山木竹，結果很好地映證了形態(tài)鑒定的結論。沈逸通過采集青神縣竹林濕地的共 17 屬 70 種竹類植物葉片，運用多特征融合的竹葉圖像處理技術進行分類，表明圖像處理技術能為竹亞科植物分類識別提供切實可行的科學依據(jù)[42]。

2 問題與展望

由于竹類植物生長發(fā)育的特殊性，使得在種屬鑒定方面依然面臨諸多困難，造成分類上的混亂問題，主要原因在于：①至今尚未建立一個權威的竹類植物分類系統(tǒng)；②學者們對于分屬的標準認定不一致，導致重復發(fā)表新種的情形較為普遍[12]。因此，在前人研究的基礎上，綜合多學科、多技術證據(jù)，消除屬種分類的混亂現(xiàn)象，建立一套科學嚴謹?shù)闹耦愔参锓诸愊到y(tǒng)將成為今后的重點研究目標。

現(xiàn)代生物技術的發(fā)展為竹類植物鑒定與系統(tǒng)學研究提供了豐富的技術手段，特別是分子標記在竹類親緣關系的鑒定和遺傳圖譜的構建方面有著巨大的潛力。相對而言SSR標記和AFLP標記在揭示種內(nèi)遺傳變異和親緣關系上分辨率高、穩(wěn)定性較好，是比較高效的研究方法。但是僅僅依靠現(xiàn)代生物技術對竹種進行鑒別依然存在費時、費錢等缺陷，但是現(xiàn)代生物技術與傳統(tǒng)形態(tài)分類方法相比具有高效、可靠、精準等優(yōu)點。所以以經(jīng)典的竹類植物鑒定方法為基礎，結合現(xiàn)代生物技術特別是基因測序等手段將是今后竹類分類鑒定必然的趨勢。