臨床骨感染診斷中宏基因組測序的應(yīng)用及發(fā)展

李京元，張紅星，陳宇飛，彭 頁，杜俊杰

骨感染是骨科臨床中極具破壞性且難以治療的并發(fā)癥，在臨床骨科各專業(yè)中均常見，而且治療費(fèi)用昂貴。2018年國際共識(shí)會(huì)議的研究組統(tǒng)計(jì)了北美骨科所有亞專科感染發(fā)生率為0.1%～30.0%，而每位患者為此花費(fèi)的醫(yī)療費(fèi)用為1.7～15.0萬美元[1]。骨感染的危害巨大，可以形成難以根治的慢性骨髓炎，導(dǎo)致長期住院和多次翻修手術(shù)以至于導(dǎo)致內(nèi)植物失敗，甚至截肢等，從而產(chǎn)生高昂的治療費(fèi)用，增加社會(huì)醫(yī)療負(fù)擔(dān)。對骨感染來說，準(zhǔn)確、快速的病原學(xué)診斷以制定適當(dāng)?shù)目股刂委煼桨?，對縮短感染病程乃至增加治愈率至關(guān)重要。微生物培養(yǎng)法一直是骨感染診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，樣本容量大、成本低和易于學(xué)習(xí)等優(yōu)點(diǎn)使其在臨床中廣泛應(yīng)用。然而由于細(xì)菌生物膜等原因，其檢測結(jié)果敏感性低且診斷速度慢，在一些厭氧及苛氧菌感染中還需要特定的培養(yǎng)技術(shù)。尤其在低毒性感染、特殊病原體感染或取樣前應(yīng)用抗生素的情況下，甚至可能出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。在進(jìn)行骨感染病原學(xué)鑒定時(shí)，傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法的缺點(diǎn)尤為突出，在缺乏病原學(xué)診斷指導(dǎo)的情況下，臨床醫(yī)生只能進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)性應(yīng)用廣譜抗生素，常常使患者未能得到及時(shí)、有效的治療，導(dǎo)致其預(yù)后不良。隨著分子診斷方法不斷興起，以PCR為基礎(chǔ)的分子診斷技術(shù)解決了上述部分病原體鑒定的問題。16S rRNA靶向測序是應(yīng)用高通量技術(shù)對細(xì)菌具有高度保守性和特異性的基因序列進(jìn)行測序，可以對病原菌進(jìn)行微量、快速且準(zhǔn)確的鑒定。然而這些方法的敏感性尚有爭議，其次，16S rRNA基因測序是專門針對細(xì)菌的檢測方法，不能檢測到真菌或病毒，而且對于細(xì)菌種水平鑒定的準(zhǔn)確性通常沒有屬水平可靠[2]。而且難以發(fā)現(xiàn)未知病原體的存在，無法根據(jù)病原體的核酸序列設(shè)計(jì)引物，成為這類技術(shù)存在的最大缺陷[3]。近年來，將宏基因組高通量測序法（metagenomics next-generation sequencing，mNGS）用于感染性疾病的診斷是一個(gè)活躍的研究領(lǐng)域。這一方法可直接對臨床樣本中的核酸進(jìn)行高通量測序，而不依賴于傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)，能夠快速、客觀的檢測臨床樣本中的多種病原微生物（包括病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲），尤其適用于急危重癥和疑難感染的診斷，對于骨科臨床中感染性疾病的診斷具有廣闊的應(yīng)用前景。筆者將對宏基因組測序法的原理，在骨感染診斷中的優(yōu)勢和應(yīng)用現(xiàn)狀，以及發(fā)展方向進(jìn)行綜述。

1 宏基因組測序方法的原理

宏基因組是指特定環(huán)境中全部生物(微生物)遺傳物質(zhì)DNA的總和。mNGS是利用新一代高通量測序技術(shù)（next-generation sequencing，NGS）檢測臨床樣品中全部微生物的基因組DNA，然后將其與參考基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較以鑒定病原體。與傳統(tǒng)培養(yǎng)法相比，其無偏倚、快速、全面、準(zhǔn)確等特點(diǎn)尤為突出[4]。

2 mNGS臨床感染性疾病應(yīng)用

隨著mNGS 技術(shù)平臺(tái)的完善和臨床研究的增多，mNGS在臨床中感染性疾病的診斷中的運(yùn)用越來越廣泛。2014年，有研究報(bào)道了世界首例通過mNGS診斷的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染病例[5]，患者因頭痛和發(fā)熱在8個(gè)月中反復(fù)入院治療，嘗試了包括培養(yǎng)和活檢在內(nèi)的多種檢驗(yàn)方法仍然無法明確其致病病原體，患者隨后進(jìn)入了昏迷狀態(tài)，最終使用mNGS對患者腦脊液樣本進(jìn)行檢測，明確為鉤端螺旋體感染，隨后的針對性青霉素治療使患者痊愈出院。顯示了mNGS在臨床感染性疾病診斷中的優(yōu)勢，奠定了mNGS在臨床感染性疾病診斷中的應(yīng)用基礎(chǔ)。2019年同一個(gè)研究組發(fā)表了臨床宏基因組病原學(xué)診斷的系統(tǒng)性、多中心研究[6]，應(yīng)用mNGS對腦脊液進(jìn)行檢測，比傳統(tǒng)方法檢測到更多的潛在病原體。其結(jié)果表明mNGS方法在腦膜腦炎的臨床診斷中是一個(gè)具有潛力的方法，在神經(jīng)侵襲性感染的早期診斷和治療中具有重要的指導(dǎo)意義，同時(shí)可以識(shí)別新發(fā)感染和疾病的表型。通過對臨床樣品直接測序而去除培養(yǎng)步驟，可以進(jìn)一步減少診斷所需時(shí)間，并且可以檢測到通過常規(guī)方法未能鑒定到的病原體。因此作為臨床中診斷檢測的一個(gè)組成部分，對臨床標(biāo)本直接進(jìn)行宏基因組測序具有重要的臨床價(jià)值。

3 mNGS在骨感染診斷中的優(yōu)勢

3.1 敏感性高 細(xì)菌種群的多樣性可能是骨感染治療成功率低的原因之一[7]。目前，對骨感染細(xì)菌的多樣性以及厭氧和苛氧微生物對這些感染的作用知之甚少。從理論上講，只要擁有足夠長的測序長度、對微生物基因組的多次測序以及良好的參考數(shù)據(jù)庫，幾乎所有微生物都可以被準(zhǔn)確地識(shí)別[8]，因此其可以廣泛地識(shí)別已知的常見病原體和對未預(yù)料到的罕見病原體進(jìn)行菌株鑒定[9]，甚至發(fā)現(xiàn)新的微生物[10]。

mNGS在骨感染中對培養(yǎng)陰性的病例診斷具有特別的優(yōu)勢。傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法診斷的敏感性低，假陰性問題嚴(yán)重。培養(yǎng)陰性是指臨床上有明確感染征象，而傳統(tǒng)培養(yǎng)方法結(jié)果陰性的病例。假陰性的原因可能是病原體為不易培養(yǎng)的苛氧菌，或存在需要更長培養(yǎng)時(shí)間的病原菌，或術(shù)前進(jìn)行過抗生素治療等。研究發(fā)現(xiàn)，在脊柱椎間盤感染中只有43%～78%的病例的活檢培養(yǎng)陽性[11]，在化膿性關(guān)節(jié)炎中淋球菌性關(guān)節(jié)炎的培養(yǎng)敏感性僅為50%[12]。一篇前瞻性研究中假體周圍感染（periprosthetic joint infection，PJI）常規(guī)組織培養(yǎng)的敏感性為55.73%[13]。也有研究認(rèn)為，關(guān)節(jié)置換假體周圍感染培養(yǎng)假陰性的發(fā)生率估計(jì)高達(dá)25%[14]。24%～68%的急性血源性骨髓炎（AHO）和21%～70%的膿毒性關(guān)節(jié)炎培養(yǎng)陰性[15-16]。Thoendel等[17]報(bào)道了應(yīng)用mNGS在PJI診斷中的大樣本量研究。在細(xì)菌培養(yǎng)陽性的患者中，應(yīng)用mNGS方法94.8%(109/115)的病例能夠檢測出已知病原體，9.6%(11/115)的病例檢測出了其他潛在的致病微生物。在98 例細(xì)菌培養(yǎng)陰性的PJI患者中，43例（43.9%）發(fā)現(xiàn)了新的潛在的致病微生物。假陰性常常困擾臨床醫(yī)生，使抗生素治療缺乏針對性，而經(jīng)驗(yàn)性的廣譜抗生素的應(yīng)用會(huì)增加抗生素相關(guān)不良反應(yīng)和并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)，以及促進(jìn)耐藥感染的發(fā)生。2019年Sigmund等[18]發(fā)表的一篇特殊病例報(bào)道中，一位慢性PJI女性患者在常規(guī)培養(yǎng)及16S rRNA基因PCR檢測結(jié)果均為陰性的情況下，應(yīng)用mNGS檢測出P. micra（微小微單胞菌）的感染，是一種存在于人類口腔和胃腸道的常見的共生專性厭氧球菌。在應(yīng)用針對性的抗生素治療后癥狀明顯好轉(zhuǎn)，成功避免了二期的翻修手術(shù)。因此，mNGS可以有效的避免假陰性的發(fā)生，有助于提高細(xì)菌學(xué)診斷率，使抗生素的應(yīng)用更具針對性，改善臨床治療效果。

3.2 檢測速度快 mNGS技術(shù)直接對臨床樣本進(jìn)行測序分析，不依賴微生物的培養(yǎng)，使檢測時(shí)間大大縮短，從而使得患者可以盡早選用針對性的抗生素進(jìn)行治療。培養(yǎng)法通常包括采樣、培養(yǎng)、種屬特異性識(shí)別、藥敏試驗(yàn)等步驟，所需時(shí)間從3～14 d不等，而mNGS技術(shù)一般可在24 h內(nèi)給出結(jié)果。有文獻(xiàn)指出在化膿性關(guān)節(jié)炎、骨髓炎及骨折相關(guān)感染的診斷中，感染部位樣本的微生物培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)至少為10 d，高毒力的病原體(如金黃色葡萄球菌)可在1～2 d內(nèi)培養(yǎng)，但低毒力病原體的培養(yǎng)可能需要長達(dá)14 d，分枝桿菌所需時(shí)間更長，同時(shí)如果懷疑存在特殊病原菌感染時(shí)，還需通知實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用特定的培養(yǎng)技術(shù)[18]。2016年Abril等[19]采用mNGS技術(shù)對1例60歲男性膿毒血癥患者的血漿進(jìn)行宏基因組測序，在24 h之內(nèi)給出了嗜二氧化碳噬細(xì)胞菌感染的診斷，迅速且準(zhǔn)確。說明mNGS在病原診斷的特異性及速度方面明顯優(yōu)于傳統(tǒng)方法。對骨感染中病原菌進(jìn)行更加準(zhǔn)確、快速的診斷，將為定向治療提供新的見解，并可能改善臨床預(yù)后。

3.3 耐藥信息 此外，mNGS可以在病原菌的耐藥性預(yù)測方面給出快速準(zhǔn)確的信息[19]。近年來由于抗菌藥物的大量應(yīng)用，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)，耐藥性細(xì)菌廣泛傳播，新型耐藥菌不斷出現(xiàn)。有報(bào)道指出，慢性化膿性骨髓炎所分離出的金黃色葡萄球菌對青霉素和氨芐西林表現(xiàn)出高度耐藥性，耐藥率在90.0%以上，對頭孢噻肟和頭孢唑林等第2代頭孢類藥物的耐藥率在70.0%以上，因此常規(guī)臨床用藥不宜作為慢性化膿性骨髓炎的臨床用藥[20]。2013年，Koser等[21]通過mNGS方法明確了多重耐藥肺結(jié)核分枝桿菌的耐藥情況，得到了共39個(gè)耐藥基因，包括了在標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)室中報(bào)告的9種藥物耐藥，同時(shí)后期的表型實(shí)驗(yàn)證實(shí)了基因組數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。因此，借助mNGS技術(shù)，可以更加完整、快速、準(zhǔn)確地了解臨床微生物的耐藥情況，為臨床病原學(xué)診斷提供依據(jù)，為臨床中治療藥物的選擇提供重要的支持[22]。

3.4 混合感染 mNGS可以提供關(guān)于樣品中微生物濃度的定量或半定量數(shù)據(jù)，在混合性感染疾病的診斷方面表現(xiàn)了較大的潛力與優(yōu)勢。2019年Wang等[23]指出mNGS比傳統(tǒng)檢測方法具有更廣泛的病原體檢測范圍，mNGS在混合肺部感染的診斷中是一項(xiàng)具有前途的技術(shù)，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

4 發(fā)展方向

4.1 進(jìn)一步提高敏感性 由于臨床樣本采集復(fù)雜多樣，臨床標(biāo)本中的大部分核酸來自宿主，這對病原學(xué)檢測的敏感性造成了影響。在分析前階段可以通過使用皂素或其他化學(xué)試劑選擇性地溶解人類白細(xì)胞，然后用脫氧核糖核酸酶處理釋放的人類基因組，從而使病原體微生物DNA相對富集，提高診斷的敏感性[24]。另一種不同的方法是應(yīng)用離心等物理方法，去除與人類基因組物質(zhì)相關(guān)的高分子量遺傳內(nèi)容。一些研究已經(jīng)證明，應(yīng)用此方法后病原體核酸相對富集[25]，有助于診斷。在測序階段可以通過宿主損耗法降低mNGS數(shù)據(jù)中人類宿主背景序列的相對比例，從而提高病原體檢測的分析靈敏度，可以部分改善檢驗(yàn)結(jié)果[26]。

4.2 進(jìn)一步提高特異性 隨著基因庫數(shù)量的增長，數(shù)據(jù)庫不斷更新，常見病原體的基因組數(shù)據(jù)是可用的，然而對于罕見的病原體，通常只有特定基因或有限區(qū)域基因組被測序，導(dǎo)致罕見病原體或新出現(xiàn)的病原體菌株的參考數(shù)據(jù)庫不完整，嚴(yán)重限制了根據(jù)這些序列進(jìn)行比對的檢測準(zhǔn)確性。因此，定期更新完善參考數(shù)據(jù)庫尤為重要，添加新的病原體參考序列將提高mNGS檢測的特異性。同時(shí)，新的參考序列應(yīng)避免其他物種的相應(yīng)序列的污染，減少假陽性的風(fēng)險(xiǎn)[27]。

4.3 規(guī)范操作流程 骨感染的活檢也可能在樣本采集時(shí)在無意中被污染，如細(xì)針穿刺過程中皮膚菌群的污染，但常見的污染物(如不動(dòng)桿菌、鏈球菌、角質(zhì)菌和葡萄球菌等)也是引發(fā)PJI的常見原因[28]，這使情況更加復(fù)雜，難以判斷病原體來源，增加了診斷難度。微生物污染無處不在，可能存在于試劑、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境[29]或正常的人類菌群中[30]。由于mNGS的敏感性，即使是微量的外部污染也會(huì)出現(xiàn)在測序數(shù)據(jù)中。因此，工作流程中的質(zhì)量控制十分重要，以保證盡可能無菌和無核酸的實(shí)驗(yàn)環(huán)境。必要時(shí)可以使用陰性對照、試劑評估等方法，以確保實(shí)驗(yàn)室和樣本的交叉污染不會(huì)產(chǎn)生假陽性結(jié)果[28]。

綜上所述，mNGS是一項(xiàng)革命性的技術(shù)，它的出現(xiàn)在多個(gè)方面顛覆了骨感染的傳統(tǒng)臨床檢測手段，使其成為一項(xiàng)未來潛在的診斷方法。本綜述闡述了這項(xiàng)新技術(shù)用于骨感染診斷的意義及可能性。雖然mNGS技術(shù)的出現(xiàn)令人興奮，因?yàn)槠錂z測速度快、準(zhǔn)確率高、覆蓋面廣等優(yōu)勢，目前廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)及臨床研究當(dāng)中，但其發(fā)展速度往往超過了臨床試驗(yàn)的驗(yàn)證和臨床證據(jù)的收集過程，要進(jìn)入臨床成為主要診斷技術(shù)仍需解決很多問題。與任何新技術(shù)一樣，將mNGS技術(shù)應(yīng)用于骨感染診斷，還需更多高質(zhì)量研究作為支持，在與傳統(tǒng)診斷方法結(jié)果的一致性等方面還需大樣本、系統(tǒng)性的研究加以驗(yàn)證。隨著mNGS技術(shù)成本的降低，操作流程的不斷完善及簡化，其定將成為骨感染診斷的重要組成部分。