牛miR-2439-5p的轉(zhuǎn)錄因子-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)與組織表達(dá)譜分析

劉 爽 魏大為 李 芬 王興平 羅仍卓么 蔡小艷 馬 云

(寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/寧夏回族自治區(qū)反芻動(dòng)物分子細(xì)胞育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750021)

隨著人們生活水平的不斷提高，高品質(zhì)牛肉是人們消費(fèi)的主導(dǎo)方向，其供不應(yīng)求。在我國(guó)，牛肉的供應(yīng)以黃牛為主，但是我國(guó)黃牛的肌內(nèi)脂肪(Intramuscular fat, IMF)含量低，與國(guó)外優(yōu)秀的品種相比，仍有很大差距。如何提高黃牛的肉品質(zhì)，提高市場(chǎng)占有量，是我國(guó)畜牧業(yè)亟待解決的關(guān)鍵問題。

肌內(nèi)脂肪是一種高遺傳力性狀[1]，通過提高磷脂含量影響風(fēng)味、提高保水能力影響多汁性、降低剪切力影響嫩度，決定了牛肉的品級(jí)和價(jià)格。肌內(nèi)脂肪沉積是一個(gè)復(fù)雜的生物過程，每一步均受基因的精準(zhǔn)調(diào)控，據(jù)統(tǒng)計(jì)有900多個(gè)基因調(diào)控肌內(nèi)脂肪含量[2]。miRNA對(duì)肌內(nèi)脂肪沉積起重要調(diào)控作用，研究其調(diào)控機(jī)制，有利于揭示產(chǎn)肉性狀的分子機(jī)制，為肉牛遺傳改良提供理論基礎(chǔ)。

miRNA是物種進(jìn)化的主要?jiǎng)恿χ?，miR-2439-5p在2009年首次被發(fā)現(xiàn)，并命名為牛特異性miRNA，但其功能未知[3]。先前的研究表明，內(nèi)含子miRNA通常與它們的宿主基因一起轉(zhuǎn)錄，并且可以對(duì)其宿主基因發(fā)揮協(xié)同和拮抗的調(diào)節(jié)作用[4]。miR-2439-5p位于牛MRTFA(Myocardin related transcription factor A，心肌素相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子A)基因的內(nèi)含子區(qū)域，研究表明，MRTFA是決定祖細(xì)胞向脂肪細(xì)胞生成的關(guān)鍵因素之一，MRTFA基因的缺失增加了脂肪生成[5-6]。但miR-2439-5p是否反饋調(diào)節(jié)其宿主基因MRTFA，從而調(diào)控牛脂肪細(xì)胞分化的功能和作用機(jī)制尚不明確。

1 材料與方法

1.1 查詢miR-2439-5p在?；蚪M上的位置

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)提供的牛參考基因組序列(ARS-UCD1.2或bosTau9)和注釋信息，查找miR-2439-5p在?；蚪M上的位置。

1.2 生物信息學(xué)分析方法

使用Reciprocal BLAST定位前體序列bta-mir-2439到牛、人、小鼠、大鼠、狗、豬、馬、綿羊、山羊和雞等動(dòng)物基因組；使用miRbase BLAST(http:∥www.mirbase.org/search.shtml)并對(duì)前體序列bta-mir-2439和加工成熟序列miR-2439-5p進(jìn)行物種間保守性分析；確定在其他物種中沒有檢測(cè)到miR-2439-5p的直向同源物的成熟miRNA。

使用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得前體序列bta-mir-2439和宿主基因MRTFA的上游序列(2kb)，并使用GPMiner軟件(http:∥gpminer.mbc.nctu.edu.tw/index.php)和EMBOSS Cpgplot軟件(https:∥www.ebi.ac.uk/Tools/seqstats/emboss_cpgplot/)進(jìn)行CpG島分析，然后使用Promoter 2.0(http：∥www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/)和Neural Network Promoter Prediction(http:∥fruitfly.org:9005/seq_tools/promoter.html)啟動(dòng)子區(qū)域分析軟件來預(yù)測(cè)啟動(dòng)子區(qū)域，最后PROMO軟件(http:∥alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3)預(yù)測(cè)啟動(dòng)子區(qū)域潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。

使用TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥www.targetscan.org/vert_72/)和miRWalk數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)預(yù)測(cè)miR-2439-5p的靶基因，并用DAVID軟件(https:∥david.ncifcrf.gov/)對(duì)靶基因進(jìn)行GO分析和KEGG分析。

1.3 miR-2439-5p的組織表達(dá)譜分析

采集3頭28月齡的郟縣紅牛的心、肝、脾、肺、腎、肌肉、背脂組織；采集3頭28月齡和牛的心、肝、脾、肺、背脂組織；采集3頭28月齡固原黃牛的心、肝、脾、肺、腎、肌肉、背脂和腎周脂組織，快速用手術(shù)剪分離成黃豆大小放入凍存管投入到液氮罐中，帶回實(shí)驗(yàn)室凍存于-80 ℃冰箱，備用。

根據(jù)RT-PCR頸環(huán)引物設(shè)計(jì)原理，并結(jié)合miRbase數(shù)據(jù)庫(kù)上miR-2439-5p序列，設(shè)計(jì)其特異莖環(huán)引物及熒光定量引物，并以U6作為內(nèi)參基因。引物合引物設(shè)計(jì)詳見表1，引物由安徽通用生物有限公司合成。

表1 本研究用到的引物信息Table 1 Information of primers in the study

1.4 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用2-ΔΔCt法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析， SPSS 22.0軟件對(duì)miR-2439-5p表達(dá)量進(jìn)行單因素方差(One-way ANOVA)分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著,P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 miR-2439-5p在?；蚪M的位置分析

由圖1所示，miR-2439-5p位于牛5號(hào)染色體的反義鏈，牛MRTFA基因第三內(nèi)含子，范圍111 845 903至111 845 924，屬內(nèi)含子miRNA，宿主基因是MRTFA。前體序列bta-mir-2439的5’端臂和3’端臂均能加工產(chǎn)生2個(gè)成熟miRNA，分別為miR-2439-5p和miR-2439-3p。

將圖書館總分館制建設(shè)督查評(píng)估納入本地區(qū)公共文化服務(wù)考核指標(biāo)。區(qū)文化部門負(fù)責(zé)對(duì)本區(qū)下轄街鎮(zhèn)分館和居村等各類服務(wù)點(diǎn)建設(shè)及運(yùn)行情況進(jìn)行評(píng)估考核。以落實(shí)意識(shí)形態(tài)工作責(zé)任制為要求，納入街鎮(zhèn)文化管理工作考核。并逐步引入第三方開展公眾滿意度測(cè)評(píng)，完善社會(huì)評(píng)價(jià)體系。認(rèn)真對(duì)照服務(wù)標(biāo)準(zhǔn)，針對(duì)本地本單位實(shí)際，找缺補(bǔ)差，提能提效。

2.2 miR-2439-5p的物種間保守性分析

使用Reciprocal BLAST檢測(cè)牛、人、小鼠、大鼠、狗、豬、馬、綿羊、山羊、和雞等動(dòng)物基因組是否存在前體序列bta-mir-2439直系同源物，僅在?；蚪M定位到bta-mir-2439序列。使用miRbase Blast搜索各物種bta-mir-2439相似序列，在其他物種未發(fā)現(xiàn)其高度相似序列，表明bta-mir-2439是牛特異性microRNA前體分子之一(表2)。同樣，miR-2439-5p不存在與其他物種miRNA高度相似序列，miR-2439-5p是牛特異性miRNA(表3)。

圖1 miR-2439-5p在牛基因組位置示意圖Fig.1 Mapping of miR-2439-5p in bovine genome

表2 bta-mir-2439與各物種前體miRNA的比對(duì)Table 2 Alignment of bta-mir-2439 to precursor miRNAs of various species

表3 miR-2439-5p與各物種成熟miRNA的比對(duì)Table 3 Alignment of miR-2439-5p to mature miRNAs of various species

2.3 miR-2439-5p上游序列CpG島分析

如圖2(a)所示，bta-mir-2439上游序列(2 kb)不存在CpG島，提示其啟動(dòng)子不是典型的GC-rich啟動(dòng)子或是可能主要依靠宿主基因MRTFA轉(zhuǎn)錄生成。

如圖2(b)所示，GPMiner軟件分析顯示，牛MRTFA基因上游序列(2 kb)的CpG島位于上游序列705～2 000 bp；EMBOSS Cpgplot軟件分析顯示，其CpG島位于上游序列1 693～1 942 bp。GPMiner軟件預(yù)測(cè)的CpG島位置與人MRTFA基因啟動(dòng)子多處序列同源(表4)，進(jìn)一步證實(shí)牛MRTFA基因上游序列(2 kb)的CpG島位置存在啟動(dòng)子區(qū)域。

2.4 miR-2439-5p的啟動(dòng)子預(yù)測(cè)

軟件Promoter 2.0預(yù)測(cè)結(jié)果(表5)：bta-mir-2439上游序列(2 kb)存在3個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(Transcriptional start site, TSS)，900 bp處預(yù)測(cè)得分最高，為0.739。軟件Neural Network Promoter Prediction預(yù)測(cè)結(jié)果(表6)：同樣預(yù)測(cè)得到3個(gè)啟動(dòng)子，上游區(qū)域89～139預(yù)測(cè)的啟動(dòng)子得分最高，為0.97。綜合結(jié)果，bta-mir-2439上游序列1 273 bp處是TSS，啟動(dòng)子范圍為773～1 223 bp。

軟件Promoter 2.0預(yù)測(cè)結(jié)果(表7)：牛MRTFA基因上游序列(2 kb)的600 bp處存在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)，預(yù)測(cè)得分為0.505，預(yù)測(cè)結(jié)果可信度低(Marginal prediction)。軟件Neural Network Promoter Prediction預(yù)測(cè)結(jié)果(表8)：預(yù)測(cè)得到1 545～1 595 bp、1 702～1 752 bp和1 710～1 760 bp 啟動(dòng)子區(qū)域。綜合CpG島預(yù)測(cè)結(jié)果，牛MRTFA基因上游序列1 751 bp處是TSS，啟動(dòng)子區(qū)域范圍為1 251～1 801 bp。

(a)bta-mir-2439上游序列CpG島分析；(b)牛MRTFA基因上游序列CpG島分析 (a) CpG island analysis of upstream sequence of bta-mir-2439; (b) CpG island analysis of upstream sequence of bovine MRTFA gene圖2 CpG島分析圖譜Fig.2 CpG island analysis map

表4 牛MRTFA基因啟動(dòng)子序列與Ensembl已知人MRTFA基因 啟動(dòng)子序列(-2 000～第一外顯子端)比對(duì)分析Table 4 Alignment analysis of bovine MRTFA gene promoter sequences to Ensembl known human MRTFA gene promoter sequences (-2 000-first exon end)

表5 bta-mir-2439的Promoter預(yù)測(cè)Table 5 Promoter predictions of the bta-mir-2439 by Promoter 2.0

2.5 miR-2439-5p的轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)

使用軟件PROMO預(yù)測(cè)miR-2439-5p啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，設(shè)置參數(shù)差異(Dissimilar)小于0。結(jié)果顯示，miR-2439-5p啟動(dòng)子共有8個(gè)C/EBPβ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、2個(gè)RARα轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)和1個(gè)AP-2α轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)等。

牛MRTFA基因啟動(dòng)子共有6個(gè)C/EBPβ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)和1個(gè)RARα轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)等。

表6 bta-mir-2439 NNPP預(yù)測(cè)Table 6 Promoter predictions of the bta-mir-2439 using NNPP

表7 牛MRTFA Promoter預(yù)測(cè)Table 7 Promoter predictions of bovine MRTFA by Promoter 2.0

2.6 miR-2439-5p的靶基因預(yù)測(cè)、GO分析和KEGG分析

TargetScanHuman 7.2數(shù)據(jù)庫(kù)共預(yù)測(cè)出3 232個(gè)靶基因；miRWalk 2.0數(shù)據(jù)庫(kù)共預(yù)測(cè)出1 185個(gè)靶基因；2個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)交集靶基因共621個(gè)(圖3(a))。通過對(duì)交集靶基因進(jìn)行GO富集分析(圖4)可知的靶基因顯著富集在激素分泌負(fù)調(diào)節(jié)、長(zhǎng)鏈脂肪酸生物合成和胰島素應(yīng)答等多個(gè)生物學(xué)過程，作用的位置主要在受體復(fù)合物和細(xì)胞質(zhì)囊泡中，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄輔助因子活性和核心啟動(dòng)子結(jié)合的分子作用。其中生物學(xué)過程中的激素分泌負(fù)調(diào)節(jié)、長(zhǎng)鏈脂肪酸生物合成和胰島素應(yīng)答條目下的基因可能會(huì)對(duì)脂肪細(xì)胞分化和代謝產(chǎn)生影響。

表8 牛MRTFA NNPP預(yù)測(cè)Table 8 Promoter predictions of bovine MRTFA by NNPP

為了探究miR-2439-5p的生物學(xué)功能，本研究在GO分析的基礎(chǔ)上，利用已有生物通路數(shù)據(jù)對(duì)交集靶基因進(jìn)行了KEGG富集分析。結(jié)果顯示，靶基因顯著富集的信號(hào)通路中，mTOR信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路、胰島素抵抗信號(hào)通路、Hippo信號(hào)通路、脂肪細(xì)胞分泌因子信號(hào)通路和不飽和脂肪酸生物合成信號(hào)通路調(diào)控牛脂肪細(xì)胞分化和代謝(圖3(b))。

2.7 miR-2439-5p的組織表達(dá)譜分析

miRbase數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，miR-2439-5p和miR-2439-3p深度測(cè)序表達(dá)豐度分別為7 reads(4 experiments)和44 reads(3 experiments)。二者表達(dá)豐富度均偏低，依據(jù)目前對(duì)miRNA和miRNA*的定義[7]，miRNA和miRNA*同時(shí)產(chǎn)生，miR-2439-3p測(cè)序豐度較高，屬于miRNA；miR-2439-5p測(cè)序豐度較低，屬于miRNA*。miRNA*易被降解、在體內(nèi)遠(yuǎn)小于miRNA的積累水平，但有其特殊使命。

由圖5(a)所示，測(cè)序結(jié)果表明，miR-2439-5p在郟縣紅牛心、脾、肺、腎、肌肉和背脂組織均有表達(dá)，而在肝臟組織中不表達(dá)。其在腎組織中相對(duì)高表達(dá)，與肌肉和背脂組織存在顯著性差異(P<0.01)。

由圖5(b)和圖5(c)所示，使用TAKARA公司熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)miR-2439-5p在和牛、固原黃牛各組織中的表達(dá)差異，結(jié)果顯示：miR-2439-5p在和牛各組織廣泛表達(dá)，在心、肺和背脂高表達(dá)，在背脂中表達(dá)量最高，與肝和脾的表達(dá)量有顯著性差異(P<0.05)；miR-2439-5p同樣在固原黃牛各組織廣泛表達(dá)，但各組織表達(dá)量無顯著性差異(P>0.05)。

(a)miR-2439-5p靶基因預(yù)測(cè)；(b)miR-2439-5p靶基因KEGG分析 (a) miR-2439-5p target genes prediction; (b) KEGG analysis of miR-2439-5p target genes圖3 miRNA-2439-5p下游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的生物信息學(xué)分析Fig.3 Bioinformatics analysis of downstream regulatory networks of miRNA-2439-5p

3 討 論

從進(jìn)化的角度看，大多數(shù)miRNA在不同動(dòng)物之間高度保守，但仍存在少數(shù)動(dòng)物物種特異性miRNA。本研究通過對(duì)miR-2439-5p進(jìn)行物種間保守性分析，發(fā)現(xiàn)miR-2439-5p是牛特異性miRNA。miRNA以其快速的進(jìn)化動(dòng)力學(xué)而聞名，調(diào)控動(dòng)物體內(nèi)30%基因的表達(dá)，miR-2439-5p的出現(xiàn)可能會(huì)影響數(shù)百種基因的表達(dá)，加速了牛的進(jìn)化過程。

哺乳動(dòng)物約有50%的miRNA屬于內(nèi)含子miRNA(Intergenic miRNA)[8]，本研究確定miR-2439-5p在?；蚪M上的位置，發(fā)現(xiàn)miR-2439-5p是內(nèi)含子miRNA，宿主基因是MRTFA。研究表明，MRTFA是決定祖細(xì)胞向脂肪細(xì)胞生成的關(guān)鍵因素之一，MRTFA基因的缺失增加了脂肪生成[5-6]。內(nèi)含子miRNA通常協(xié)同/拮抗宿主基因發(fā)揮生物學(xué)功能[9]，因此推斷，miR-2439-5p可能反饋調(diào)控宿主基因MRTFA，抑制或促進(jìn)牛脂肪細(xì)胞分化。

內(nèi)含子miRNA一般隨宿主基因共同轉(zhuǎn)錄，共享相同的啟動(dòng)子和調(diào)節(jié)元件[10]。CpG島主要位于基因的外顯子區(qū)域和啟動(dòng)子(Promoter)區(qū)域，是鑒別啟動(dòng)子區(qū)域的重要條件之一。本研究發(fā)現(xiàn)，牛MRTFA基因啟動(dòng)子區(qū)域存在CpG島，并與已知人MRTFA基因啟動(dòng)子存在同源性。因此，miR-2439-5p可能同宿主基因MRTFA共享啟動(dòng)子元件。miR-2439-5p的上游序列不存在明顯CpG島區(qū)域，表明牛MRTFA基因可能更容易被轉(zhuǎn)錄激活。但也有研究者發(fā)現(xiàn)，內(nèi)含子miRNA也有自己獨(dú)立的啟動(dòng)子，不依靠宿主基因獨(dú)自轉(zhuǎn)錄[11]。鑒于miR-2439-5p上游含有豐富的堿基序列，極有可能擁有獨(dú)立的啟動(dòng)子區(qū)域，提示miR-2439-5p的啟動(dòng)子不是典型的GC-rich啟動(dòng)子。使用NNPP軟件和Promoter2.0進(jìn)一步提高啟動(dòng)子預(yù)測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)告核心啟動(dòng)子區(qū)域在TSS上游500 bp、下游50 bp[12]，本研究預(yù)測(cè)牛MTRFA基因上游1 751 bp處為TSS，啟動(dòng)子區(qū)域?yàn)樯嫌? 251～1 801 bp。miR-2439-5p上游1 273 bp處是TSS，啟動(dòng)子范圍為773～1 323 bp。

篩選和鑒定miRNA及其靶基因是研究miRNA功能機(jī)制的關(guān)鍵一步。借助生物信息學(xué)方法可以對(duì)miRNA靶基因鑒定提供理論指導(dǎo)，對(duì)研究miRNA的功能機(jī)制有著重要指向作用。本研究使用TargetScanHuman 7.2數(shù)據(jù)庫(kù)和miRWalk 2.0數(shù)據(jù)庫(kù)篩選得到了miR-2439-5p的621個(gè)靶基因，顯著富集的信號(hào)通路中，mTOR信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路和AMPK信號(hào)通路能夠促進(jìn)脂肪合成、脂肪細(xì)胞分化及影響脂肪細(xì)胞穩(wěn)定[13-15]；TGF-β信號(hào)通路和Hippo信號(hào)通路能夠抑制成熟脂肪細(xì)胞的生成[16-17]；胰島素抵抗信號(hào)通路、脂肪細(xì)胞分泌因子信號(hào)通路和不飽和脂肪酸生物合成信號(hào)通路參與脂肪細(xì)胞的代謝和應(yīng)答[18-19]。

(a)GO富集分析-生物學(xué)過程;(b)GO富集分析-分子功能;(c)GO富集分析細(xì)胞組分 (a) GO-Analysis-BP(Biological process); (b) GO-Analysis-MF(Molecular function); (c) GO-Analysis-CC(Cellular component)圖4 miRNA-2439-5p靶基因GO富集分析Fig.4 GO enrichment analysis of miRNA-2439-5p target genes

圖5 miR-2439-5p在郟縣紅牛(a)、和牛(b)和固原黃牛(c)各組織表達(dá)譜Fig.5 Expression difference of miR-2439-5p in different tissues in Jiaxian Red cattle (a), Wagyu (b) and Guyuan cattle (c)

此外，分析miRNA在不同組織的相對(duì)表達(dá)量有助于進(jìn)一步探究其生物學(xué)功能[20]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-2439-5p在和牛的背脂中表達(dá)量最高，與肝和脾的表達(dá)量有顯著性差異(P<0.05)，表明miR-2439-5p可能調(diào)控牛脂肪沉積。

4 結(jié) 論

miR-2439-5p是牛特異性miRNA、內(nèi)含子miRNA和miRNA*(相對(duì)低表達(dá)miRNA)。miR-2439-5p上游可能受C/EBPβ和RARα等轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，既可能同宿主基因MRTFA共享啟動(dòng)子元件，也可能擁有獨(dú)立的啟動(dòng)子區(qū)域。miR-2439-5p下游可能通過mTOR信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路、胰島素抵抗信號(hào)通路、Hippo信號(hào)通路、脂肪細(xì)胞分泌因子信號(hào)通路和不飽和脂肪酸生物合成信號(hào)通路等，反饋調(diào)節(jié)其宿主基因MRTFA，從而調(diào)控牛脂肪細(xì)胞分化與代謝。miR-2439-5p在郟縣紅牛、和牛和固原黃牛的心、脾、肺、背脂組織均有表達(dá)，但在體內(nèi)積累水平較低，其特殊的生物學(xué)功能有待進(jìn)一步研究。