利用SSR標(biāo)記構(gòu)建板栗初級(jí)核心種質(zhì)

張馨方 張樹(shù)航 李 穎 郭 燕 王廣鵬

(河北省農(nóng)林科學(xué)院 昌黎果樹(shù)研究所，河北 昌黎 066600)

植物種質(zhì)資源是開(kāi)展遺傳研究和育種工作的關(guān)鍵，世界各國(guó)都高度重視種質(zhì)資源的搜集、保存和研究利用。隨著搜集到的種質(zhì)數(shù)量日益增多，如何對(duì)數(shù)量龐大的資源進(jìn)行整理保存，如何高效利用現(xiàn)有種質(zhì)資源并實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展，是資源管理單位和育種工作者共同面臨的現(xiàn)實(shí)問(wèn)題。鑒于此，F(xiàn)rankel等[1]最早提出核心種質(zhì)的概念，即以最小的資源數(shù)量和遺傳重復(fù)最大限度地代表整個(gè)種質(zhì)資源的多樣性。核心種質(zhì)是進(jìn)行優(yōu)良基因挖掘和資源深入研究的核心子集，能夠有效提高資源的利用率。據(jù)報(bào)道，目前包括桃(Prunuspersica(L.) Batsch.)[2]、核桃(JuglansregiaL.)[3]、木荷(Schimasuperba)[4]和橄欖(Canariumalbum)[5]等木本植物均已構(gòu)建了核心種質(zhì)。

中國(guó)是栗屬(Castanea)植物的起源中心，也是世界上栗屬植物分布最為廣泛的區(qū)域，主要分布有板栗(C.mollissimaBl.)、錐栗(C.henryi(Skam) Rehd. et Wils.)、茅栗(C.seguiniiDode)和日本栗(C.CrenataSieb. & Zucc)4個(gè)種[6]。其中板栗在我國(guó)分布最廣且數(shù)量最多，遺傳多樣性也最為豐富，歷來(lái)是世界栗屬植物遺傳改良和新品種培育重要的基因資源[6]。板栗屬多年生木本植物，樹(shù)體高大，資源保存通常以田間活體種植為主，占地面積大，管理費(fèi)用高。如何從豐富的板栗資源中快速而準(zhǔn)確地挖掘出育種工作所需要的優(yōu)異基因是板栗遺傳育種亟需解決的重要問(wèn)題。據(jù)此，本研究啟動(dòng)了構(gòu)建板栗初級(jí)核心種質(zhì)的策略，優(yōu)先對(duì)核心種質(zhì)進(jìn)行繁殖、交換、評(píng)價(jià)和利用，緩解基因庫(kù)中龐大資源數(shù)量與高效保存之間的矛盾，推進(jìn)優(yōu)異資源利用和優(yōu)良基因挖掘，提高種質(zhì)資源庫(kù)的管理和利用水平。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)核心種質(zhì)的構(gòu)建方法研究較多，包括基于形態(tài)學(xué)指標(biāo)構(gòu)建核心種質(zhì)[7-8]、基于隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記(RAPD)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)記輔助取樣(Marker-assisted sampling)[9]和利用遺傳距離取樣等方法[10]。表型性狀是多種因素綜合作用的結(jié)果，易受外界環(huán)境影響，加之板栗是高大的多年生喬木，要獲得可靠的表型性狀數(shù)據(jù)需要耗費(fèi)較長(zhǎng)年限。而DNA分子標(biāo)記技術(shù)具有高效、快速和穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，一般較少受到外界環(huán)境影響，普遍認(rèn)為是評(píng)價(jià)植物遺傳多樣性和構(gòu)建核心種質(zhì)的有效工具。RAPD、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)和簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)等技術(shù)[11-13]已被廣泛應(yīng)用于栗屬植物遺傳多樣性評(píng)價(jià)方面[14]，Marshall和Brown[15]認(rèn)為位點(diǎn)的等位基因數(shù)是評(píng)價(jià)遺傳多樣性最重要的指標(biāo)。程麗莉[16]利用AFLP分子標(biāo)記對(duì)燕山地區(qū)136份實(shí)生板栗進(jìn)行了遺傳多樣性分析，并初選核心種質(zhì)37份；馬玉敏[17]以板栗野生株系為材料，研究了采用熒光AFLP分子標(biāo)記構(gòu)建中國(guó)野生板栗核心種質(zhì)的方法；Pereira-Lorenzo等[18]利用SSR分子標(biāo)記建立了271份歐洲栗(C.sativaMill.)品種的數(shù)據(jù)信息并篩選出37份核心種質(zhì)。但有關(guān)中國(guó)板栗核心種質(zhì)構(gòu)建的研究還有待進(jìn)一步完善，前期研究所選用的材料樣本取樣量小且取樣范圍相對(duì)狹窄，沒(méi)有涵蓋華北、長(zhǎng)江中下游、西北、東南和西南5個(gè)地方品種群，遺傳信息不夠豐富。SSR標(biāo)記是共顯性遺傳，能直接反映出DNA序列水平上的變化，并提供豐富的等位基因信息，較其他標(biāo)記具有更大優(yōu)勢(shì)[19]。本研究利用SSR標(biāo)記，以品種群分布范圍涵蓋5個(gè)地方的279份板栗資源為材料，利用Simple Matching(SM)遺傳相似系數(shù)和Dice遺傳相似系數(shù)進(jìn)行非加權(quán)算術(shù)平均聚類法(UPGMA)聚類，比較位點(diǎn)優(yōu)先取樣法和隨機(jī)取樣法的不同，確定構(gòu)建板栗初級(jí)核心種質(zhì)的適宜方法，并篩選出板栗初級(jí)核心種質(zhì)，以期為板栗種質(zhì)資源的管理、保存和開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)，有效提高整個(gè)行業(yè)資源利用率和育種效率。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

資源植株全部定植于河北省農(nóng)林科學(xué)院昌黎果樹(shù)研究所板栗種質(zhì)資源圃(119°15′ E，39°72′ N)，屬溫帶半濕潤(rùn)大陸性氣候區(qū)，年平均氣溫11 ℃，年平均降水量638 mm，無(wú)霜期186 d。所有資源是在中國(guó)板栗5個(gè)地方品種群分布范圍內(nèi)選取的實(shí)生良種、地方品種或古樹(shù)資源，2004年統(tǒng)一嫁接入圃保存。供試材料為來(lái)自河北、山東、北京、陜西、湖南、湖北、江蘇、浙江、安徽、貴州、廣西和廣東12個(gè)省(市或自治區(qū)) 的279份板栗種質(zhì)。2018年5月，每個(gè)植株選取嫩葉5 ～ 6片，置入裝有硅膠的塑封袋帶回實(shí)驗(yàn)室，置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。供試材料名稱及來(lái)源地見(jiàn)表1。

表1 供試板栗資源名稱及其來(lái)源Table 1 Chestnut materials used in the experiment and their origins

表1(續(xù))

表1(續(xù))

1.2 SSR分析

采用改良的CTAB法[20]提取板栗葉片基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA濃度，于-20 ℃ 保存?zhèn)溆?。本研究?20對(duì)引物中篩選出擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性較高且條帶清晰的21對(duì)引物用于全部樣品分析，引物具體信息、PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件參見(jiàn)文獻(xiàn)[21]。用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物，用銀染法[22]染色。根據(jù)DNA marker大小，按照引物設(shè)計(jì)目標(biāo)產(chǎn)物條帶讀取序列長(zhǎng)度，在相同遷移位置上，有條帶記為“1”，無(wú)條帶記為“0”。

1.3 初級(jí)核心種質(zhì)構(gòu)建

利用NTSYS Version 2.10軟件，根據(jù)SM遺傳相似系數(shù)和Dice相似系數(shù)采用UPGMA法對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行聚類分析。SM系數(shù)和Dice系數(shù)是一種相似性配對(duì)系數(shù)，即相似匹配數(shù)與總匹配數(shù)的比值[23]，具體計(jì)算方法見(jiàn)表2。

表2 遺傳相似系數(shù)計(jì)算方法Table 2 Calculation methods of two genetic similarity coefficients

本研究采取多次聚類的方法，以隨機(jī)取樣法[26]為對(duì)照，應(yīng)用位點(diǎn)優(yōu)先取樣策略[27]構(gòu)建初級(jí)核心種質(zhì)。位點(diǎn)優(yōu)先取樣策略即根據(jù)聚類樹(shù)狀圖，在最低分類水平的2份遺傳材料中選取稀有等位基因數(shù)較多的材料進(jìn)入下一輪聚類。若2份材料稀有等位基因數(shù)目相等，則優(yōu)先選擇稀有等位基因頻率值更小的材料，如果這2個(gè)值仍相等則隨機(jī)選擇1份材料，若組內(nèi)只有1份材料則直接進(jìn)入下一輪聚類。隨機(jī)取樣法即在最低分類水平的2份材料中隨機(jī)選取1份進(jìn)入下一輪聚類。

1.4 初級(jí)核心種質(zhì)有效性分析檢驗(yàn)

對(duì)原種質(zhì)、保留種質(zhì)和初級(jí)核心種質(zhì)的有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(H)和Shannon’s信息指數(shù)(I)進(jìn)行t檢驗(yàn)，以此評(píng)價(jià)初級(jí)核心種質(zhì)的代表性。Ne是反映群體遺傳變異程度的指標(biāo)，與等位基因頻率有關(guān)，而H和I都是反映群體遺傳多樣性水平的重要參數(shù)。以上數(shù)據(jù)采用POPGENE Version 1.32和SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析。

1.5 主坐標(biāo)分析與表型特征確認(rèn)

基于SSR數(shù)據(jù)信息，利用NTSYS Version 2.10軟件中的EIGEN模塊對(duì)初級(jí)核心種質(zhì)的代表性進(jìn)行主坐標(biāo)分析，判定初級(jí)核心種質(zhì)是否在主坐標(biāo)圖中均勻分布。

初級(jí)核心種質(zhì)基本形態(tài)學(xué)指標(biāo)檢測(cè)按照《板栗種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》[28]進(jìn)行，從樹(shù)姿、枝干顏色、皮孔大小和皮孔密度、葉片顏色和形狀、葉緣形狀、花芽形態(tài)和大小以及邊果形狀方面對(duì)初級(jí)核心種質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)，以此評(píng)價(jià)初級(jí)核心種質(zhì)的代表性。樹(shù)姿包括直立、半開(kāi)張、開(kāi)張和披垂；枝干顏色包括紅褐、灰褐和綠褐；皮孔大小和花芽大小包括小、中和大3種類型；皮孔密度包括稀、中和密；葉片顏色分為濃綠、灰綠、黃綠和紫紅色；葉片形狀分為橢圓形、闊披針形和披針形；葉緣形狀分為鋸齒形和鈍齒形；花芽形態(tài)包括扁圓形和圓形；邊果形狀包括橢圓形、圓形和三角形。

使用數(shù)顯游標(biāo)卡尺(精確度為0.01 mm)和電子天平(精確度為0.01 g)對(duì)原種質(zhì)和初級(jí)核心種質(zhì)的堅(jiān)果縱徑、堅(jiān)果橫徑、堅(jiān)果厚度、單粒質(zhì)量、果殼質(zhì)量和果殼厚度6個(gè)性狀進(jìn)行測(cè)定。參照Hu等[26]評(píng)價(jià)方法，若均值差異百分率(MD)<20%，同時(shí)極差符合率(CR)>80%，可認(rèn)為核心種質(zhì)能代表原種質(zhì)資源的遺傳多樣性。

(1)

式中：n為數(shù)量性狀總數(shù)；St為核心種質(zhì)與原種質(zhì)t測(cè)驗(yàn)得到的均值差異顯著的性狀數(shù)。

(2)

式中：n為數(shù)量性狀總數(shù)；RC(i)為核心種質(zhì)某個(gè)性狀的極差；RI(i)為原種質(zhì)同個(gè)性狀的極差。

2 結(jié)果與分析

2.1 初級(jí)核心種質(zhì)構(gòu)建

由表3可知，除根據(jù)Dice系數(shù)第1輪聚類后隨機(jī)取樣法取得的樣本Ne值略高于位點(diǎn)優(yōu)先取樣法，其他無(wú)論利用SM系數(shù)還是Dice系數(shù)聚類，均為位點(diǎn)優(yōu)先取樣法得到的種質(zhì)Ne、H和I高于隨機(jī)取樣法。因此，構(gòu)建板栗初級(jí)核心種質(zhì)時(shí)位點(diǎn)優(yōu)先取樣法要優(yōu)于隨機(jī)取樣法。此外，隨著聚類次數(shù)的增加，聚類抽樣得到的樣本數(shù)越來(lái)越少，占原種質(zhì)比例越來(lái)越低，而Ne、H和I卻隨聚類次數(shù)的增加越來(lái)越大。

應(yīng)用位點(diǎn)優(yōu)先取樣法，279個(gè)樣本使用SM系數(shù)經(jīng)過(guò)3次聚類抽樣后(表3)，得到了由68份種質(zhì)組成的核心樣本群SA3，占原種質(zhì)的24.37%，Ne、H和I分別為1.539、0.329和0.502；利用Dice系數(shù)聚類，全部樣本經(jīng)3次聚類，得到一個(gè)由31份種質(zhì)組成的核心樣本群DA3，占原種質(zhì)的11.11%，Ne、H和I分別為1.562、0.341和0.517。

2個(gè)核心樣本群SA3和DA3遺傳多樣性各指標(biāo)與原種質(zhì)的t檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。SA3和DA3樣本群的Ne、H和I在概率0.05水平上顯著大于原種質(zhì)，說(shuō)明篩選出的2個(gè)核心樣本群遺傳多樣性較豐富。從資源來(lái)源地看，樣本群DA3包括的種質(zhì)數(shù)量較少，地理來(lái)源較單一；而樣本群SA3種質(zhì)來(lái)源更豐富，包括原資源來(lái)源地10個(gè)省(市或自治區(qū))，由此初選種質(zhì)SA3為板栗核心種質(zhì)。綜上，采用位點(diǎn)優(yōu)先取樣法，利用SM相似系數(shù)進(jìn)行3次聚類選取的68份種質(zhì)，范圍涵蓋了原材料各主要來(lái)源地，經(jīng)檢驗(yàn)?zāi)軌虼?79份原種質(zhì)的遺傳多樣性，確定為板栗初級(jí)核心種質(zhì)的最佳取樣策略。

2.2 初級(jí)核心種質(zhì)有效性分析檢驗(yàn)

保留種質(zhì)指從原種質(zhì)中去除核心種質(zhì)后剩余的部分，它可以作為核心種質(zhì)的后備資源。對(duì)初級(jí)核心種質(zhì)與原種質(zhì)和保留種質(zhì)的遺傳多樣性進(jìn)行評(píng)價(jià)，以此判定初級(jí)核心種質(zhì)代表性。初級(jí)核心種質(zhì)和保留種質(zhì)遺傳多樣性各指標(biāo)見(jiàn)表5。結(jié)果顯示，初級(jí)核心種質(zhì)保留了原種質(zhì)24.37%的樣品，Ne、H和I分別為1.539、0.329和0.502，均高于原種質(zhì)各遺傳多樣性指標(biāo)。由此可見(jiàn)，本研究篩選出的初級(jí)核心種質(zhì)在遺傳多樣性上能較好地代表原種質(zhì)。保留種質(zhì)保留了原種質(zhì)75.63%的樣品，Ne、H和I分別為1.504、0.305、0.468。再對(duì)初級(jí)核心種質(zhì)和保留種質(zhì)的Ne、H和I值分別作t檢驗(yàn)(表4)，初級(jí)核心種質(zhì)Ne、H和I在概率0.05水平上顯著大于保留種質(zhì),因此，應(yīng)優(yōu)先考慮應(yīng)用初級(jí)核心種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳研究工作。

表3 板栗不同樣本群遺傳多樣性比較Table 3 Genetic diversity analysis of different collections of China chestnut

表4 2個(gè)核心樣本群與原種質(zhì)、初級(jí)核心種質(zhì)與保留種質(zhì)遺傳多樣性參數(shù)的t檢驗(yàn)Table 4 Gentic diversity comparison and t-test between two core sample group and initial collection, primary core colletion and reserved collection

表5 初級(jí)核心種質(zhì)和保留種質(zhì)、原種質(zhì)遺傳多樣性對(duì)比Table 5 Genetic diversity comparison and t-test between core collection, reserved collection and initial collection

2.3 初級(jí)核心種質(zhì)主坐標(biāo)分析與表型特征評(píng)價(jià)

采用主坐標(biāo)法(PCoA)對(duì)篩選出的初級(jí)核心種質(zhì)進(jìn)行確認(rèn)，繪制原種質(zhì)與初級(jí)核心種質(zhì)1、2主坐標(biāo)散點(diǎn)圖(圖1)，可見(jiàn)初級(jí)核心種質(zhì)在整個(gè)板栗資源的主坐標(biāo)圖分布均勻，表明篩選出的初級(jí)核心種質(zhì)具有較好的代表性。

橫縱坐標(biāo)分別表示貢獻(xiàn)率較高的1、2主坐標(biāo)。 Horizontal and vertical coordinates mean the first two principal coordinates with higher contribution rate respectively.圖1 位點(diǎn)優(yōu)先取樣法構(gòu)建的初級(jí)核心種質(zhì)與原種質(zhì)的主坐標(biāo)圖Fig.1 Principal coordinates plots of primary core collection constructed by preferred sampling strategy and initial collection

本研究構(gòu)建的68份初級(jí)核心種質(zhì)的編號(hào)分別為1、2、8、10、12、15、17、24、26、40、44、46、50、51、53、54、57、59、65、66、76、92、94、98、101、116、118、123、125、128、147、149、151、158、160、161、166、173、174、177、180、183、185、186、191、203、209、214、215、222、223、231、232、233、238、242、244、254、255、256、260、263、264、269、270、271、275和277，68份初級(jí)核心種質(zhì)名稱及來(lái)源地見(jiàn)表1。68份種質(zhì)在樹(shù)姿、枝干顏色、皮孔大小、皮孔密度、葉片顏色和形狀、葉緣形狀、花芽形態(tài)和大小以及邊果形狀10個(gè)方面涵蓋了分類學(xué)的大多數(shù)或全部類型。此外還包括紅栗、垂枝栗、三色栗、波葉栗和短枝型板栗等具有特殊性狀的資源，驗(yàn)證了本研究篩選出的初級(jí)核心種質(zhì)的合理性。

初級(jí)核心種質(zhì)與原種質(zhì)6個(gè)表型特征數(shù)據(jù)見(jiàn)表6。經(jīng)t檢驗(yàn)核心種質(zhì)6個(gè)表型性狀均值與原種質(zhì)無(wú)顯著差異，根據(jù)公式計(jì)算出MD和CR分別為0和81.13%，符合胡晉等[29]提出的核心種質(zhì)均值同原種質(zhì)群體存在顯著差異的性狀<20%、核心種質(zhì)與原種質(zhì)的極差符合率>80%的最低標(biāo)準(zhǔn)。研究結(jié)果從表型水平上證明了根據(jù)SM系數(shù)聚類結(jié)合位點(diǎn)優(yōu)先取樣法是構(gòu)建板栗初級(jí)核心種質(zhì)較適宜的方法。

表6 初級(jí)核心種質(zhì)與原種質(zhì)6個(gè)堅(jiān)果表型特征基本參數(shù)Table 6 Basic parameter value of 6 phenotypic traits of primary core collection and initial collection

3 討論與結(jié)論

在明確資源分子遺傳信息數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，本研究應(yīng)用聚類分析的方法構(gòu)建核心種質(zhì)，因?yàn)榫哂凶畲筮z傳相似度或最近遺傳距離的材料自然聚在一起，而去除遺傳距離較近的材料后可得到遺傳特性差異較大的種質(zhì)材料。目前，基于遺傳距離聚類的取樣方法已經(jīng)建立并應(yīng)用于植物核心種質(zhì)的構(gòu)建當(dāng)中[10，30-31]。研究表明，選擇不同遺傳相似系數(shù)導(dǎo)致分析結(jié)果存在較大差異，因?yàn)檫z傳系數(shù)的選擇會(huì)影響遺傳相似度或遺傳距離的計(jì)算，因此，選擇合適的遺傳相似系數(shù)對(duì)于準(zhǔn)確估計(jì)個(gè)體間遺傳相似度和評(píng)價(jià)群體間遺傳多樣性至關(guān)重要[23]。劉娟等[32]研究認(rèn)為，構(gòu)建新疆野杏核心種質(zhì)時(shí)采用Dice遺傳距離要優(yōu)于SM遺傳距離；張春雨等[27]認(rèn)為，根據(jù)SM、Jaccard或Dice遺傳距離進(jìn)行多次聚類構(gòu)建新疆野蘋果核心種質(zhì)均為較適宜的方法，并提出了對(duì)于共顯性分子標(biāo)記如SSR和限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)，利用Dice和Jaccard相似系數(shù)更為理想。本研究采用SM遺傳系數(shù)和Dice系數(shù)通過(guò)多次聚類的方法構(gòu)建板栗初級(jí)核心種質(zhì)，結(jié)果表明利用Dice系數(shù)取得的核心樣本數(shù)量最小，卻具有較大的Ne、H和I，說(shuō)明從遺傳系數(shù)的選擇而言，Dice系數(shù)對(duì)SSR標(biāo)記更合適，符合張春雨等研究結(jié)果。但考慮到采用Dice系數(shù)構(gòu)建的核心樣本群地理來(lái)源范圍較單一，未能包括所有樣本來(lái)源地，而利用SM系數(shù)構(gòu)建的核心樣本群來(lái)源地涵蓋原種質(zhì)10個(gè)省(市)，在遺傳多樣性上能夠以最小的樣本量最大程度地代表原種質(zhì)，因此本研究?jī)?yōu)先采用SM遺傳相似系數(shù)進(jìn)行聚類分析。

取樣策略是核心種質(zhì)構(gòu)建中又一重要環(huán)節(jié)。李自超等[33]通過(guò)研究水稻核心種質(zhì)的構(gòu)建方法發(fā)現(xiàn)聚類法要優(yōu)于隨機(jī)法。通常不能采用在整個(gè)群體內(nèi)完全隨機(jī)的方法進(jìn)行取樣，因?yàn)橐粋€(gè)物種的遺傳多樣性是以某種特定組織和結(jié)構(gòu)分布，而不是完全隨機(jī)地分布在整個(gè)群體中[34-35]。Quero-Garcia等[36]在構(gòu)建芋頭核心種質(zhì)研究中，比較了完全隨機(jī)法取樣、組內(nèi)完全隨機(jī)法取樣和組內(nèi)先聚類后取樣的方法，結(jié)果表明組內(nèi)先聚類后取樣是一種比前兩者更加有效的方法。本文即采用先聚類后取樣的方法，研究表明無(wú)論選擇何種遺傳系數(shù)聚類，通過(guò)位點(diǎn)優(yōu)先策略取得的樣本均比隨機(jī)取樣法具有較大的Ne、H和I，這說(shuō)明構(gòu)建板栗初級(jí)核心種質(zhì)時(shí)位點(diǎn)優(yōu)先取樣法優(yōu)于隨機(jī)取樣法，與前人的研究結(jié)果一致[27，32]?？赡苁俏锓N的基因多樣性是決定其表型性狀的遺傳因子，而所有位點(diǎn)的等位基因頻率和等位基因數(shù)目構(gòu)成了資源基因多樣性的基礎(chǔ)。等位基因數(shù)目和頻率承載著原種質(zhì)的遺傳多樣性，而稀有等位基因可能具有某種有利特性來(lái)幫助該物種適應(yīng)不同的環(huán)境變化，防止群體衰落，在生物多樣性中具有重要意義[37-39]。因此，建議在構(gòu)建核心種質(zhì)時(shí)優(yōu)先選取稀有基因(等位基因頻率小于5%)，同時(shí)盡可能地保留原種質(zhì)等位基因的多樣性，這樣既可以減少等位基因的丟失，又盡可能保留原種質(zhì)群體的基因多樣性。

樣本量的規(guī)模是衡量核心種質(zhì)是否合理有效的重要因素。核心種質(zhì)是以最小的資源數(shù)量最大程度地代表整個(gè)資源的遺傳多樣性，因此確定最優(yōu)的取樣比例十分關(guān)鍵。李自超等[40]提出應(yīng)根據(jù)具體植物的遺傳結(jié)構(gòu)和數(shù)量規(guī)模來(lái)確定相應(yīng)的取樣比例。目前國(guó)內(nèi)外構(gòu)建的核心種質(zhì)所占比例一般為原種質(zhì)的5%～30%，其中作物群體一般原種質(zhì)資源數(shù)量較多，選取較小規(guī)模的核心樣品也能充分保留原種質(zhì)的遺傳特性。如稻類等農(nóng)作物核心樣品一般占總收集品的10%左右[41-42]，而園藝植物核心種質(zhì)取樣規(guī)模一般在20%左右[32]。取樣比例應(yīng)根據(jù)具體樹(shù)種遺傳特性和原種質(zhì)資源數(shù)量和實(shí)際工作而定。對(duì)遺傳多樣性豐富和資源數(shù)量大的群體可適當(dāng)減小取樣比例。本研究選取68份初級(jí)核心種質(zhì)占原種質(zhì)的24.37%，來(lái)源涵蓋了中國(guó)板栗5個(gè)地方品種群分布范圍，能充分代表原種質(zhì)的遺傳多樣性。此外，本研究從主坐標(biāo)和形態(tài)學(xué)角度對(duì)構(gòu)建的初級(jí)核心種質(zhì)進(jìn)行確認(rèn)，發(fā)現(xiàn)初級(jí)核心種質(zhì)遍布整個(gè)主坐標(biāo)圖，在表型特征方面能代表原群體，通過(guò)位點(diǎn)優(yōu)先取樣策略結(jié)合SM相似系數(shù)多次聚類確定的24.37%的取樣比例是合理有效的。建議板栗行業(yè)優(yōu)先對(duì)這部分初級(jí)核心種質(zhì)進(jìn)行繁殖、交換、評(píng)價(jià)和利用，以促進(jìn)各地板栗基因交流，提高整個(gè)行業(yè)資源利用率和育種效率。而對(duì)于資源保存單位來(lái)說(shuō)，這部分初級(jí)核心種質(zhì)的確定可以提高整個(gè)種質(zhì)資源庫(kù)的管理、保存和利用水平。盡管理論上本研究構(gòu)建的初級(jí)核心種質(zhì)在遺傳多樣性方面能最大程度地代表整個(gè)供試板栗資源，但其他種質(zhì)資源仍具有重要的保存意義。因?yàn)楸狙芯績(jī)H是借助21對(duì)SSR引物對(duì)其遺傳多樣性進(jìn)行了初級(jí)地挖掘，今后隨著對(duì)資源評(píng)價(jià)內(nèi)容的拓展和評(píng)價(jià)水平的提高，資源遺傳多樣性將得到進(jìn)一步挖掘，從中仍可能篩選出極具利用潛力的基因資源，其他植物對(duì)非核心種質(zhì)的留存亦可參考如此。

本研究所選用的279份資源取材于中國(guó)板栗主產(chǎn)區(qū)的12個(gè)省(市或自治區(qū))，涵蓋傳統(tǒng)分類學(xué)上劃定的中國(guó)板栗5個(gè)地方品種群，是迄今為止進(jìn)行中國(guó)板栗核心種質(zhì)群構(gòu)建選用材料(樣本)數(shù)量較多且覆蓋面較廣的研究。盡管如此，本研究也存在原種質(zhì)取樣不均的問(wèn)題，其中華北品種群的資源數(shù)量相對(duì)較多，其他品種群樣本相對(duì)較少，可能遺漏部分具有潛在利用價(jià)值的種質(zhì)資源，因此本研究選用樣本在代表中國(guó)板栗資源的全部遺傳信息方面仍有欠缺。此外，由于針對(duì)資源表型特征的檢測(cè)數(shù)據(jù)相對(duì)簡(jiǎn)單，在以后研究中還需要補(bǔ)充和完善質(zhì)量性狀表型保留或數(shù)量性狀特征值方面數(shù)據(jù)，以此來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證核心種質(zhì)的代表性及合理性。