背俞指針療法對(duì)GERD大鼠胃起搏區(qū)MLCK及PMLC20表達(dá)水平的影響?

黃美禎， 譚金晶， 宋慶增， 劉禮劍， 韋金秀， 周曉玲， 黎麗群， 岑前麗， 李建鋒， 謝 勝△

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)， 南寧 530001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院， 南寧 530023；3.柳州市中醫(yī)院，廣西 柳州 545001)

胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease，GERD)是指胃或十二指腸內(nèi)容物反流入食管，從而引起反酸、燒心等與反流相關(guān)癥狀或并發(fā)癥的疾病[1]。GERD為多發(fā)性疾病，其全球總體發(fā)病率為13%并呈上升趨勢[2]。研究發(fā)現(xiàn)，GERD具有病程長、復(fù)發(fā)率高等特點(diǎn)，可增加肺癌、食管癌、冠心病等多種疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重影響患者的身心健康和生活質(zhì)量[3]。因此，積極防治GERD對(duì)公共衛(wèi)生事業(yè)具有重大意義。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，背俞指針療法治療GERD療效確切，可顯著改善食管下括約肌壓力及胃電節(jié)律，明顯減少酸反流[4-6]。然而，該療法治療GERD作用的分子機(jī)制尚未完全明確。

食管、胃動(dòng)力障礙是GERD的主要發(fā)病機(jī)制之一，而胃動(dòng)力障礙與平滑肌結(jié)構(gòu)、功能異常密切相關(guān)[7-9]。研究表明，胃平滑肌細(xì)胞內(nèi)肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase,MLCK)通過使肌球蛋白調(diào)節(jié)性輕鏈(20kD Myosin light chain phosphorylation, MLC20)磷酸化，形成磷酸化肌球蛋白調(diào)節(jié)性輕鏈(phosphorylation 20kD Myosin light chain phosphorylation, PMLC20)，從而活化肌球蛋白ATP酶，引起平滑肌的收縮，故MLCK- PMLC20信號(hào)通路在調(diào)控平滑肌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)功能中起重要作用[10，11]。因此，本研究以GERD大鼠為研究對(duì)象，探討MLCK-PMLC20信號(hào)通路異常是否為GERD的發(fā)病機(jī)制，并觀察背俞指針療法對(duì)該信號(hào)通路的影響，明確該療法治療GERD的分子作用機(jī)制。本研究已通過廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查，倫理學(xué)批準(zhǔn)號(hào)DW20180101-25。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

適齡清潔級(jí)SD大鼠124只，雌雄各半，體質(zhì)量220～250 g，購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(湘)2016-0002。飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物房，溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度50%～65%。

1.2 主要試劑及儀器

熒光定量PCR試劑盒(貨號(hào)RR047A、RR820A)TaKaRa公司；MLCK(貨號(hào)bs-4705R)及PMLC2(貨號(hào)bs-19149R)抗體，北京博奧森公司；IgG免疫組化試劑盒(貨號(hào)SABC-POD)，武漢博士德公司。

展烤片機(jī)TY-7FB(天津愛華)；超速低溫離心機(jī)1730R(美國 Sigma 公司)；光學(xué)顯微鏡Olympus-BH2(日本Olympus公司)；顯微攝像儀 Olympus-C35AD-2(日本 Olympus 公司)；病理切片機(jī) LEICA RM2135(德國RM公司)；分光光度計(jì) 722 型(四川儀表九廠)；7000型熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)；紫外透射儀 ZF-90 (上海顧村電光儀器廠)；紫外分光光度計(jì) 752型(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；圖像分析系統(tǒng)Image-Pro Express(日本 Olympus 公司)。

1.3 造模及分組方法

將購回的124只SD大鼠進(jìn)行標(biāo)記，采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)抽取30只作為空白組(開腹后不手術(shù)即縫合，無反流對(duì)照組)，其余94只SD大鼠建立GERD模型。大鼠購回后適應(yīng)環(huán)境7 d，手術(shù)前禁食24 h。采用經(jīng)食管支架植入術(shù)造模[12]：大鼠麻醉后備皮，碘伏消毒術(shù)區(qū)后開腹，將鋼圈 (直徑0.31 mm, 內(nèi)徑3.5 mm, 長5～6 mm) 套在鞘芯上, 從口腔經(jīng)食管送于賁門處, 先退出鞘芯再退出鞘, 用魚線 (0.4號(hào), 0.10 mm)將鋼圈固定于賁門處, 腹腔內(nèi)注入青霉素后關(guān)腹?？瞻捉M進(jìn)入腹腔前的操作同模型組，開腹后使用0.9% NaCl溶液灌洗腹腔，縫合線逐層關(guān)腹。所有大鼠術(shù)后禁食24 h不禁水，4周后隨機(jī)抽取4只大鼠的食管標(biāo)本進(jìn)行病理檢測，明確造模成功后根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為模型組、指針組及西藥組各30只。

1.4 干預(yù)方法

1.4.1 西藥組 西藥組參考《動(dòng)物與人體的每公斤體質(zhì)量劑量折算系數(shù)表》[13]計(jì)算出每只大鼠干預(yù)所需劑量。給予枸櫞酸莫沙必利分散片(成都康弘藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)H20031110，1.56 mg/kg)每日均分灌胃3次，每次1 mL；蘭索拉唑腸溶片(汕頭經(jīng)濟(jì)特區(qū)鮀濱制藥廠，批號(hào)H10980136，3.125 mg/kg)每日均分灌胃2次?？瞻捉M和模型組給予等量純水灌胃，各組均干預(yù)14 d。

1.4.2 背俞指針組 參照文獻(xiàn)選取大鼠雙側(cè)足太陽膀胱經(jīng)肝俞、膽俞、脾俞、胃俞穴，于每天上午9～11點(diǎn)進(jìn)行干預(yù)[14]。先將大鼠固定于俯臥位，左手罩住頭部，右手輕撫背部4 min。指針操作如下：不同穴位從上到下、相同穴位由左至右，對(duì)每個(gè)穴位進(jìn)行相應(yīng)點(diǎn)壓、按揉等手法操作，刺激量以大鼠無掙扎為度，頻率為120～160次/min，時(shí)間為3 min/穴，每只大鼠每天手法操作24 min，療程為2周。干預(yù)前對(duì)相關(guān)人員進(jìn)行2周培訓(xùn)，在電子天平儀上練習(xí)，力求達(dá)到按揉質(zhì)量200～250 g、點(diǎn)壓質(zhì)量300～350 g的標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 標(biāo)本采集

實(shí)驗(yàn)周期結(jié)束大鼠禁食不禁水12 h后，采用放血法將麻醉(25%烏拉坦6 mL/kg腹腔注射)后大鼠處死，隨后進(jìn)行食管組織及胃組織標(biāo)本取材，于食道賁門上緣處取出食管組織約3 cm，于大鼠胃竇處(距幽門約0.5 cm)取10×10×5 mm3的平滑肌條，切取實(shí)驗(yàn)所需的胃起搏區(qū)組織-80 ℃保存。

1.6 檢測指標(biāo)

1.6.1 各組大鼠一般情況 觀察各組大鼠的精神狀態(tài)、反應(yīng)、毛色、糞便、飲食、飲水量等，觀察各組大鼠存活率和手術(shù)造模傷口愈合情況。

1.6.2 光鏡下觀察食管中下段組織病理變化 各組均隨機(jī)抽取8只大鼠作為觀察樣本，將取出的食管組織經(jīng)HE染色后在光鏡下觀察組織的鱗狀上皮、上皮細(xì)胞層、黏膜固有層的病理變化，并進(jìn)行對(duì)比分析。

1.6.3 熒光定量PCR法檢測胃起搏區(qū)組織MLCK mRNA的表達(dá)情況 取出胃起搏區(qū)平滑肌組織，切取實(shí)驗(yàn)所需量(30～50 mg)，采用Trizol法提取總RNA，紫外-分光光度計(jì)測定所提取RNA濃度及含量，采用TaKaRa公司試劑盒行常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)錄所用的引物根據(jù)GenBank登錄的MLCK核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，委托寶生物工程(大連)技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行合成，上游引物5’-GTGGTGGTAGCGGAGAGAAG-3’，下游引物5’-CCTTGTGGCCAGTTCATCCT-3’，引物長度為144bp。反應(yīng)條件：預(yù)變性(94 ℃，5 min)；變性(95 ℃，30 s)；退火(60 ℃，30 s)，延伸(72 ℃，30 s)，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，以上反應(yīng)流程均參照TaKaRa公司試劑盒說明書進(jìn)行。反應(yīng)完成后采用SYBRGreenⅠ法進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物定量檢測，擴(kuò)增反應(yīng)于ABI 7000熒光定量PCR儀上進(jìn)行，并采用2-ΔΔCT法比較各組MLCK mRNA表達(dá)水平的差異。

1.6.4 免疫組化法觀察胃起搏區(qū)組織MLCK及PMLC20的表達(dá) 切取大鼠胃起搏區(qū)(胃體中部距賁門1/3處)組織約1.0 cm3，石蠟切片4 μm，烤片后脫蠟至水，高壓抗原修復(fù)，依次滴加3%過氧化物酶阻斷液(室溫10 min)、5% BSA封閉液(室溫30 min)、一抗(1∶300,4 ℃過夜)，二抗(37 ℃孵育30 min)及SABC(37 ℃孵育30 min)，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水透明，中性樹膠封片。用已知陽性切片作陽性MLCK及PMLC20對(duì)照，用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，采用image-Pro圖像分析系統(tǒng)，測定并計(jì)算出平均光密度值(mean optical density, MOD)，用于各組MLCK及PMLC20表達(dá)水平的比較。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況

空白組大鼠反應(yīng)敏捷，毛色光澤，糞便正常；模型組大鼠反應(yīng)較遲鈍，毛色無光澤，糞質(zhì)干硬，每日飲食、飲水量稍減少，可見少量反流物；指針組及西藥組大鼠反應(yīng)較模型組敏捷，毛色較光澤，指針組大便正常，西藥組大便偏爛。各組大鼠均無死亡，造模組大鼠傷口愈合良好。

2.2 GERD大鼠干預(yù)后食管中下段組織病理變化

圖1示，各組食管黏膜組織病理變化，空白組食管黏膜組織形態(tài)正常，未見黏膜糜爛及潰瘍，黏膜上皮未見增生，固有層未見炎性細(xì)胞浸潤；模型組食管鱗狀上皮基底細(xì)胞中度增生，基底細(xì)胞層增厚，固有層乳頭延長，固有層內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤，以嗜酸性粒細(xì)胞為主，細(xì)胞間隙增寬；指針組食管黏膜結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，鱗狀上皮修復(fù)完整，基底細(xì)胞呈單層排列，黏膜固有層未見明顯的乳頭增生及炎性細(xì)胞浸潤；西藥組食管黏膜結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，黏膜固有層未見明顯的炎性細(xì)胞浸潤。

圖1 各組大鼠食管黏膜中下段組織鱗狀上皮、黏膜固有層、上皮細(xì)胞層病理變化比較(HE×200)

2.3 GERD大鼠干預(yù)后胃起搏區(qū)組織MLCK及PMLC20表達(dá)結(jié)果

剔除異常數(shù)據(jù)后，空白組、模型組、西藥組、模型組分別納入11、12、11、14個(gè)樣本分析MLCK mRNA表達(dá)水平。表1示，與空白組比較，模型組大鼠MLCK mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；西藥組與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；指針組較模型組及西藥組明顯升高(P<0.05)。

圖2、3示，MLCK及PMLC20陽性表達(dá)細(xì)胞分布于胃起搏區(qū)組織內(nèi)環(huán)外縱肌層間，呈棕黃色染色。表1示，與空白組比較，模型組MLCK及PMLC20的表達(dá)水平有所下降(P<0.05)；與模型組比較，西藥組及指針組MLCK及PMLC20的表達(dá)水平有顯著上升(P<0.01)；與西藥組比較，指針組的MLCK表達(dá)水平降低(P<0.05)，而西藥組和指針組PMLC20表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 MLCK mRNA、MLCK陽性產(chǎn)物及PMLC20陽性產(chǎn)物表達(dá)比較

圖2 各組大鼠胃起搏區(qū)組織肌球蛋白輕鏈激酶(Myosin Light Chain Kinase，MLCK)免疫組化陽性表達(dá)(200×)

圖3 各組大鼠胃起搏區(qū)組織磷酸化肌球蛋白調(diào)節(jié)性輕鏈(Phosphorylation 20kD Myosin light chain phosphorylation，PMLC20)免疫組化陽性表達(dá)(200×)

3 討論

目前國內(nèi)大部分學(xué)者認(rèn)為，GERD的基本病機(jī)為脾胃升降功能失常，胃氣上逆[15]。本團(tuán)隊(duì)多年來致力于GERD的實(shí)踐與研究，認(rèn)識(shí)到“脾胃氣機(jī)失衡是GERD發(fā)病的表象，而任督二脈經(jīng)氣升降交會(huì)失衡是脾胃升降失衡GERD的病機(jī)本質(zhì)”[16，17]。督脈為陽脈之海，與膀胱經(jīng)交會(huì)于大椎等穴位及巔頂部，故膀胱經(jīng)之經(jīng)氣可通諸陽之會(huì)，調(diào)達(dá)一身之陽氣。背俞穴是五臟六腑之精氣輸注于膀胱經(jīng)上的穴位。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，在背俞穴處施予背俞指針療法可調(diào)節(jié)任督二脈經(jīng)氣的交會(huì)，改善多個(gè)臟腑的功能，從而達(dá)到治療GERD的目的[4-6]?；诖?，筆者團(tuán)隊(duì)提出“以俞調(diào)樞”的觀點(diǎn)，構(gòu)建了“以俞調(diào)樞”理論體系[16，17]。同時(shí)前期臨床研究表明，背俞指針療法可以促進(jìn)胃腸收縮及蠕動(dòng)，降低食管括約肌壓力和減少酸反流，治療GERD效果確切[4-6]。本次研究的病理結(jié)果顯示，與模型組比較，指針組食管黏膜結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，食管組織炎癥消失，提示背俞指針療法可以改善GERD模型大鼠的食管黏膜病理改變，促進(jìn)炎癥消退。這可能與此療法能調(diào)節(jié)任督二脈穴位的皮溫，調(diào)節(jié)二脈經(jīng)氣的交會(huì)，進(jìn)而改善脾胃之氣機(jī)升降功能有關(guān)[18]。

MLCK是一種廣泛表達(dá)的絲氨酸/蘇氨酸激酶[19]。MLCK使肌球蛋白調(diào)節(jié)性輕鏈磷酸化并控制骨骼肌、平滑肌和心肌的收縮[20]。胃排空障礙與胃平滑肌收縮密切相關(guān)。在調(diào)節(jié)平滑肌收縮機(jī)制中, MLCK可使 MLC20磷酸化，磷酸化后的MLC20為PMLC20，可以使肌球蛋白ATP酶活化，觸發(fā)肌動(dòng)蛋白-肌球蛋白交叉橋接機(jī)制，引起平滑肌的收縮。在平滑肌的MLCK-PMLC20通路中，MLC20磷酸化水平在一定程度上決定著平滑肌收縮的功能。MLC20磷酸化的程度取決于MLCK活性，而MLCK mRNA是合成MLCK的模板[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠在胃起搏區(qū)的MLCK mRNA、MLCK及PMLC20蛋白表達(dá)水平均低于空白組大鼠，說明GERD大鼠胃動(dòng)力障礙可能與MLCK及PMLC20表達(dá)量降低有關(guān)，且與其他胃動(dòng)力障礙性疾病大鼠模型的胃平滑肌MLCK和PMLC20表達(dá)水平變化相一致[21-23]。

本次研究中，干預(yù)后指針組中MLCK mRNA水平較模型組升高，且MLCK及PMLC20陽性蛋白表達(dá)均高于模型組，說明背俞指針療法能上調(diào)GERD大鼠胃起搏區(qū)MLCK mRNA、MLCK及PMLC20陽性蛋白表達(dá)，從而達(dá)到治療GERD的目的。于上午脾經(jīng)當(dāng)令之巳時(shí)(9～11點(diǎn))進(jìn)行背俞指針療法，可激發(fā)膀胱經(jīng)經(jīng)氣, 從而使任督二脈經(jīng)氣升降交會(huì)，以恢復(fù)脾胃之氣機(jī)升降，調(diào)暢五臟六腑臟腑樞機(jī)，恢復(fù)MLCK-PMLC20通路的“樞機(jī)”。結(jié)合病理結(jié)果說明，背俞指針療法治療GERD可能是通過上調(diào)胃起搏區(qū)MLCK mRNA、MLCK及PMLC20這一機(jī)制起作用。然而，西藥組的MLCK mRNA表達(dá)與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其蛋白表達(dá)水平卻高于模型組，說明2組雖然以同等水平mRNA為模板合成的MLCK沒有增加，但是用藥后可能使合成MLCK的其他相關(guān)因子增加，或者使蛋白相較模型組分解減少，從而提高西藥組MLCK的表達(dá)，具體機(jī)制尚未明確。西藥組的MLCK蛋白表達(dá)水平高于指針組，但是最后2組間的PMLC20蛋白表達(dá)水平無明顯差異，可能與指針組還能通過其他途徑增加MLC20磷酸化有關(guān)，值得進(jìn)一步探討。

綜上所述，GERD的發(fā)病可能與MLCK mRNA、MLCK、PMLC20蛋白表達(dá)水平下降有關(guān)。背俞指針療法可明顯改善GERD大鼠食管病理改變，其機(jī)制可能與上調(diào)MLCK mRNA、MLCK、PMLC20蛋白表達(dá)水平有關(guān)。然而目前尚有許多問題,如背俞指針療法是如何上調(diào)MLCK mRNA及其蛋白表達(dá),其是否會(huì)通過除MLCK的其他通路影響MLC20磷酸化，均有待今后進(jìn)一步的研究。