“養(yǎng)元通絡(luò)”針法對2型糖尿病大鼠肝臟IRS-1/PI3K/AKT/GSK-3β通路的影響?

徐 俊， 張 瑤， 胡昭端， 張譽丹,3， 周曉紅， 謝有瓊， 彭 銳△

(1.湖北中醫(yī)藥大學， 武漢 430065；2.武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院， 武漢 430022；3.風濕性疾病發(fā)生與干預湖北省重點實驗室，湖北 恩施 445000)

糖尿病(diabetes mellitus, DM)是以機體出現(xiàn)高血糖變化為特征的全身慢性代謝性疾病，根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟(international diabetes federation, IDF)官方統(tǒng)計，2017年全球20～79歲糖尿病患者總數(shù)為4.25億，而中國的糖尿病總?cè)藬?shù)1.14億，列全球首位，其中2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)占總數(shù)90%以上[1]。T2DM患者血糖異?？烧T發(fā)視網(wǎng)膜病變、心血管疾病、腎病和外周神經(jīng)系統(tǒng)病變等多種疾病[2]，甚至導致傷殘。據(jù)IDF統(tǒng)計，2017年全球有超過2/3的T2DM患者出現(xiàn)糖尿病并發(fā)癥，約有400萬人因糖尿病及并發(fā)癥死亡[3]。糖尿病的高發(fā)病率給個人和國家?guī)砹顺林氐尼t(yī)療負擔，血糖控制和相關(guān)并發(fā)癥的診治消耗了大量的醫(yī)療資源[4]。胰島素抵抗(insulin resistance, IR)是T2DM發(fā)病的核心機制之一，胰島素受體底物-1(insulin receptor substrate, IRS-1)/磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B, AKT)/糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β)信號通路上調(diào)，可促進肝組織糖原合成，抑制糖原分解，降低血糖，從而改善胰島素抵抗[5-7]。T2DM屬于中醫(yī)學“消渴”范疇，病位在腎，與肝、脾、胃等相關(guān)[8]。針灸作為傳統(tǒng)中醫(yī)外治方法，具有簡便效驗的特點。湖北中醫(yī)藥大學針灸骨傷學院彭銳教授從事中醫(yī)臨床工作30余年，認為T2DM中醫(yī)病機當屬元氣虧虛、絡(luò)脈不通，提出養(yǎng)元通絡(luò)法指導針刺治療T2DM，并以雙側(cè)脾俞、腎俞、足三里、三陰交配伍取穴。在前期臨床實踐中，發(fā)現(xiàn)養(yǎng)元通絡(luò)針法可以調(diào)控2型糖尿病患者血糖，但具體機制尚不明確。本研究旨在觀察“養(yǎng)元通絡(luò)”針法對T2DM模型大鼠IRS-1、PI3K、AKT、GSK-3β及相關(guān)指標腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)的影響，探究其療效的可能機制。本研究經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學動物倫理委員會批準，批準號HB1245D。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級3月齡雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量(200±20)g，購于湖北省醫(yī)學科學研究院實驗動物中心，實驗動物許可證號SCXK(鄂)2015-0018。飼養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學SPF級動物實驗室，飼養(yǎng)條件每籠5只，溫度(23±2) ℃，相對濕度40%～60%，光照時間每日12 h，大鼠可自由取食飲水。

1.2 主要試劑與儀器

S-0130鏈脲佐菌素(美國Sigma公司)；鹽酸二甲雙胍片(中美上海施貴寶藥制有限公司，國藥準字H20023370)；磷酸脂酶抑制劑(碧云天，S1873)；PMSF(碧云天，ST506)；RIPA P0013B裂解液(碧云天)；P0010S BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天)；TEMED Amresco0761(上海玉博生物科技有限Amresco公司)；兔多抗pi3k(Bioss公司，Bs-20611r)；兔多抗AKT(Affinity公司，Af6261)；HRP標記羊抗兔二抗(武漢博士德，BA1054)；ECL底物液(Thermo公司，NCI5079)。

血糖檢測儀(江蘇魚躍醫(yī)療公司，yuwell580)；實時熒光定量PCR儀(ABI公司，QuantStudio 6)。引物由北京擎科生物科技有限公司設(shè)計合成。

1.3 動物模型制備

將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，參考文獻采用鏈脲佐菌素腹腔注射進行造模。大鼠禁食12 h，鏈脲佐菌素臨用前用0.1 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.2，4 ℃)溶解，按25 mg/kg的劑量腹腔注射，每日1次，連續(xù)注射2 d[9]。繼續(xù)喂養(yǎng)1周后，血糖檢測儀檢測空腹血糖(fasting blood-glucose, FBG)高于7.8 mmol/L提示模型成功。

1.4 分組與干預方法

按照隨機數(shù)字表法將所有大鼠分為正常組、模型組、針刺組、二甲雙胍組、假針刺組5組各10只。正常組與模型組不做任何干預，針刺組參照李忠仁[10]《實驗針灸學》，選穴雙側(cè)“后三里”“脾俞”“腎俞”“三陰交”，假針刺組選穴在標準穴位旁開5 mm處，針具選擇0.20×25 mm中研太和牌針灸針，針刺深度5 mm，針柄連接華佗電子針灸儀，選用連續(xù)波頻率2Hz，強度1 mA進行干預。單次干預20 min，造模后即開始干預，每日1次，每周休息1 d，連續(xù)干預4周。二甲雙胍組每日按125 mg/kg劑量對大鼠進行灌胃治療，治療時間與針刺組相同。

1.5 血糖檢測和標本采集

隨機血糖(random blood-glucose, RBG)測定于大鼠干預4周后的早晨7～9時。次日禁食24 h、禁水2 h，尾靜脈采血，血糖檢測儀檢測FBG水平后，頸椎脫臼法處死全部大鼠，打開腹腔采集肝左葉同一區(qū)域的肝組織樣本，裝入無菌EP管中，-80 ℃保存?zhèn)錂z。

1.6 免疫印跡法檢測肝組織PI3K、AKT

肝組織樣本1 g剪碎，用含PMSF的裂解液進行裂解，離心后提取蛋白，定量、變性、配膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封膜，一抗(GAPDH為1∶1000，PI3K、AKT為1∶500)4 ℃孵育過夜，二抗孵育、顯影得出條帶，采用Image J軟件進行定量分析。

1.7 實時熒光定量PCR檢測肝組織IRS-1、GSK-3β、AMPK mRNA

肝組織樣本100 mg用液氮充分研磨，加入1 mL Trizol混勻，室溫放置5 min充分裂解，加200 μl氯仿混勻使水相和有機相充分接觸，離心后吸取上清加等體積異丙醇，混勻室溫靜置10 min，-20 ℃過夜，離心后去上清收集RNA沉淀，75°乙醇溶液洗滌2次，超凈工作臺風干沉淀，根據(jù)沉淀量加入DEPC水溶解RNA。然后進行RNA反轉(zhuǎn)錄，采用2-ΔΔCt法計算結(jié)果(見表1)。

表1 引物序列表

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 干預后各組大鼠 FBG與RBG比較

圖1示，與正常組比較，模型組大鼠FBG與RBG明顯增高(P<0.01)；與模型組比較，針刺組、二甲雙胍組FBG與RBG明顯降低(P<0.05)；假針刺組FBG、RBG與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義。

注：與正常組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05

2.2 干預后各組大鼠肝組織PI3K、AKT蛋白水平比較

圖2示，與正常組比較，模型組大鼠肝組織PI3K、AKT蛋白表達明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，針刺組與二甲雙胍組PI3K、AKT蛋白表達升高(P<0.05)；假針刺組PI3K、AKT表達與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義

注：與正常組比較:**P<0.01；與模型組比較:#P<0.05；磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B, AKT)

2.3 干預后各組大鼠肝組織IRS-1、GSK-3β、AMPK mRNA比較

圖3示，與正常組比較，模型組大鼠肝組織IRS-1 mRNA、AMPK mRNA表達明顯降低(P<0.01)，GSK-3β mRNA表達明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，針刺組與二甲雙胍組IRS-1 mRNA、AMPK mRNA表達升高(P<0.05)，GSK-3β mRNA表達明顯下降(P<0.05)；假針刺組IRS-1、GSK-3β、AMPK mRNA表達與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義。

注：與正常組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05；胰島素受體底物-1(insulin receptor substrate, IRS-1)、糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)

3 討論

T2DM屬于中醫(yī)學“消渴”范疇，病屬本虛標實，虛實夾雜。彭銳認為其病機特點為元氣虧虛，絡(luò)脈瘀滯。元氣為一生之本，元氣耗傷臟腑機能下降，氣血痰瘀可化滯為標，阻滯經(jīng)絡(luò)。同時，邪氣耗傷正氣，遷延日久則氣血陰陽皆可致虛，導致絡(luò)脈空虛，即所謂“久病入絡(luò)”“久病多虛”，因此臨床T2DM治療當以養(yǎng)元為主、通絡(luò)為要，并提出養(yǎng)元通絡(luò)法指導針灸進行治療。脾俞、腎俞分別為脾腎之背俞穴，腎為先天之本，脾為后天之本，二者為一身元氣之根蒂，先后天之真元，對人體生命活動和疾病轉(zhuǎn)歸意義重大?！侗怡o心書·扁鵲灸法》：“蓋脾為五臟之母，后天之本，屬土，生長萬物者也。若脾氣在，雖病甚不至死……蓋腎為一身之根蒂，先天之真源，本牢則不死。[11]”足三里為足陽明經(jīng)合穴，胃之下合穴，五行屬土，故能養(yǎng)元氣。如《通玄指要賦》：“三里卻五勞之羸瘦”[12]，也可以通經(jīng)絡(luò)，如《馬丹陽天星十二穴治雜病歌》：“能通心腹脹，善治胃中寒，腸鳴并泄瀉，腿腫膝胻酸。[12]”三陰交為八總穴之一，脾肝腎三經(jīng)氣血交會之所，針灸此穴可通三陰經(jīng)絡(luò)，調(diào)全身氣機。本研究中，選擇雙側(cè)“脾俞”“腎俞”“足三里”“三陰交”進行針刺干預T2DM模型，共奏養(yǎng)元通絡(luò)之功。

IR是T2DM發(fā)病的主要環(huán)節(jié)，貫穿于疾病發(fā)生發(fā)展的全過程，臨床IR患者約占T2DM患者總數(shù)的90%，絕大多數(shù)IR的發(fā)生與胰島素和胰島素受體結(jié)合后的信號傳導障礙相關(guān)，從而導致胰島素受體酪氨酸激酶活性下降、下游胰島素信號異常傳導、糖原合成酶活性減弱、葡萄糖轉(zhuǎn)運減少等[13，14]。肝臟是胰島素作用的靶組織，也是胰島素耐受產(chǎn)生的主要部位[15]。在分子水平上，胰島素由胰島β細胞分泌入血，通過門靜脈進入肝臟，與肝臟細胞膜表面胰島素受體α亞基結(jié)合，引起胰島素β亞基受體構(gòu)型迅速發(fā)生改變，激活其酪氨酸激酶活性，使β亞基膜內(nèi)的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化[16，17]?；罨睦野彼峒っ缚梢詫⒘姿峄鶊F轉(zhuǎn)移到同一受體其他β亞單位的酪氨酸殘基上，也可以轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)中的一些可溶性蛋白底物的酪氨酸殘基上，如IRS-1、磷酸化的IRS-1可以充當多種不同含SH2結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)的結(jié)合位點[18，19]，進一步與下游的PI3K結(jié)合，導致AKT產(chǎn)生磷酸化效應(yīng)，引起PI3K/AKT通路活化[20，21]。PI3K是細胞內(nèi)重要的信號傳導分子，參與調(diào)節(jié)細胞的增殖、凋亡和分化等生理過程。在胰島素受體信號通路中，PI3K能被活化的IRS-1激活，促進三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol trisphosphate, PIP3)生成并激活AKT。AKT屬于AGC蛋白激酶家族，是胰島素受體信號傳導途徑中的關(guān)鍵蛋白激酶，在細胞生長與凋亡、糖類代謝過程中起重要作用?；罨蟮腁KT抑制了GSK-3β的磷酸化作用，引起GSK-3β下游底物糖原合成酶(glycogen synthase, GS)活性升高[22，23]，從而促進肝臟糖原合成，抑制糖原分解，提高肝臟對葡萄糖的代謝，降低血糖，改善肝臟IR狀況。AMPK是體內(nèi)糖原調(diào)節(jié)中非常重要的蛋白激酶，同時也是機體內(nèi)重要的能量轉(zhuǎn)換器，其對三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)低水平做出反應(yīng)，激活后對補充細胞 ATP 供應(yīng)信號傳導通路做出正向調(diào)控。研究表明，AMPK可以和IRS-1在Ser789 位點磷酸化，改善胰島素敏感性，激活的AMPK也可以使IRS-1活性增加[24]。同時，活化的AMPK可以進一步激活其下游的Src蛋白和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)，促進葡萄糖轉(zhuǎn)運體4(Glucose Transporters 4, GLUT-4)的轉(zhuǎn)位和表達，增加機體葡萄糖攝取[25]。本次研究中，模型組大鼠空腹血糖和隨機血糖明顯高于正常組，而針刺干預后大鼠空腹血糖與隨機血糖均有不同程度下降，初步證實養(yǎng)元通絡(luò)針法的降血糖作用。同時，免疫印跡法和實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，模型組大鼠肝組織IRS-1、PI3K、AKT、AMPK表達明顯下調(diào)，GSK-3β表達水平上調(diào)，而針刺干預后的大鼠肝組織IRS-1、PI3K、AKT、AMPK表達明顯上調(diào)，GSK-3β表達下調(diào)，從而促進葡萄糖轉(zhuǎn)運，提高糖原合成酶活性，提示養(yǎng)元通絡(luò)針刺可以促進肝臟糖原合成，抑制糖原分解而改善IR。

綜上所述，養(yǎng)元通絡(luò)針法能上調(diào)T2DM大鼠肝臟PI3K、AKT、IRS-1、AMPK表達，下調(diào)肝臟GSK-3β表達，調(diào)控肝臟胰島素抵抗，降低血糖，防治2型糖尿病。