痰濕型PCOS大鼠卵巢顆粒細(xì)胞線粒體功能及Nox1/p-Akt/Glut4信號通路變化的研究?

叢培瑋， 張麗娜， 陳文娜， 尚 冰， 吳兆利

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心， 沈陽 110847；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院， 沈陽 110847；3.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)史文獻(xiàn)研究院， 沈陽 110847；4.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院， 沈陽 110847)

現(xiàn)代中醫(yī)認(rèn)為，痰濕阻絡(luò)可誘發(fā)機(jī)體糖脂代謝異常，也是痰濕型多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)患者胰島素抵抗發(fā)生的重要原因之一[1]。卵巢顆粒細(xì)胞(granulosa cells, GCs)是卵泡的重要組成細(xì)胞，GCs通過縫隙連接和旁分泌因子為卵泡卵母細(xì)胞的發(fā)育和成熟提供能量支持[2]。線粒體是細(xì)胞的“動(dòng)力工廠”，在卵泡發(fā)育周期過程中，GCs線粒體通過合成大量腺嘌呤核苷三磷酸(adenine triphosphate, ATP)為卵泡發(fā)育成熟提供能量[3，4]。過量脂沉積誘發(fā)的氧化應(yīng)激會損傷GCs線粒體氧化功能，由此引發(fā)機(jī)體糖脂代謝異常，是影響排卵前卵母細(xì)胞質(zhì)量的重要原因。本研究在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，從痰濕型PCOS大鼠GCs線粒體功能及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1(NADPH oxidase1, Nox1)/磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B, p-Akt)/葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(glucose transporter protein 4, Glut4)信號通路變化兩方面，探討痰濕型PCOS卵泡發(fā)育異常和閉鎖的可能發(fā)生機(jī)制，豐富“痰濕不孕”的科學(xué)內(nèi)涵。本研究已通過遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會審核，批準(zhǔn)號2019YS(DW)-035-01。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級健康雌性SD大鼠42只，體質(zhì)量85～105 g，4～5周齡，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號SCXK(遼)-2010-0001。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動(dòng)物中心，自由攝食與飲水，飼養(yǎng)環(huán)境溫度(20±2) ℃，濕度(50±5)%。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM/F12培養(yǎng)基(貨號SH30023)，HyClone公司；青鏈霉素(貨號P1400)，北京索萊寶公司；10%胎牛血清(貨號SH30070)，Bio-HyClone公司；孕馬血清促性腺激素(貨號P9970)，天津正江科技有限公司；BCA蛋白測定試劑盒(貨號K20316)，TransGen；ATP測定試劑盒(貨號201806)，南京建成生物工程研究所；Nox1抗體(貨號ab131088)、p-Akt (ser473)抗體(貨號ab81283)、Glut4抗體(貨號ab654)、GAPDH抗體(貨號ab9485)Abcam公司。

JEM-1400透射電鏡(日本電子株式會社)；電泳儀/酶標(biāo)儀(Bio-Rad，042BR14173)；Tanon5200化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；轉(zhuǎn)膜儀(美國伯樂Bio-Rad小型Trans-Blot Turbo Transfer Systerm)；ST16R高速冷凍離心機(jī)(美國熱電Thermo Sientific)；LKB-1超薄切片機(jī)，瑞典LKB生物技術(shù)公司。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及造模

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，選取動(dòng)情周期規(guī)律的22只大鼠隨機(jī)分為對照組10只和模型組12只，模型組給予高脂飼料連續(xù)喂養(yǎng)12周，第3周開始每日灌胃來曲唑溶液[1 mg/(kg·d)溶于0.5%CMC-Na溶液中]，連續(xù)9周。高脂飼料由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心配送。對照組給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)12周，第3周開始每日灌胃0.5% CMC-Na溶液，連續(xù)9周。造模結(jié)束后，選取動(dòng)情周期延長的大鼠10只為痰濕型PCOS造模成功模型組大鼠。

2.2 動(dòng)情周期檢測

通過觀察陰道脫落細(xì)胞涂片鑒定2組大鼠的發(fā)情周期。具體操作：用50μL的移液器吸取適量0.9%氯化鈉溶液，在大鼠陰道內(nèi)來回抽吸3～5次。將吸出的液體滴到干凈的載玻片上，蘇木素染色后置于光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄。于造模結(jié)束前10 d開始觀察2組大鼠動(dòng)情間期，每日上午10∶00進(jìn)行操作。

2.3 標(biāo)本采集

造模結(jié)束后24 h禁食禁水，拉頸斷髓法處死2組大鼠，取卵巢組織PBS清洗，冰上去除表面包膜及周圍脂肪組織，每組隨機(jī)選取各2只大鼠的卵巢組織切成約1 mm3小塊，2.5%戊二醛固定以備電鏡檢測，其余卵巢組織用于GCs原代分離與培養(yǎng)。

2.4 GCs線粒體形態(tài)學(xué)觀察

固定24 h后的電鏡標(biāo)本用PBS漂洗，1%鋨酸固定，乙醇、丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋聚合，切片機(jī)切片(50～60 nm)，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染，透射電鏡下觀察GCs線粒體并拍片。

2.5 GCs的分離與培養(yǎng)

分離與培養(yǎng)卵巢組織GCs，參照文獻(xiàn)的方法并加以改進(jìn)[5，6]。將卵巢組織放入DMEM/ F12培養(yǎng)基中，37 ℃孵育15 min。解剖顯微鏡下用1 mL注射器針頭刺破卵泡輕輕拍打與擠壓，分別收集2組GCs分為對照組和模型組，40 μm一次性無菌細(xì)胞篩過濾，收集細(xì)胞懸液離心后棄上清，0.4%臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，鏡下未見藍(lán)染的為死細(xì)胞，制成1.0×106/L密度細(xì)胞懸液接種于35 mm培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)。觀察鏡下大多數(shù)細(xì)胞貼壁后即可更換培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h后，0.1%胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，PBS沖洗2～3次，4%多聚甲醛固定15 min，HE染色可見細(xì)胞形態(tài)完整，呈多角形、核藍(lán)染，胞漿淡紅色并含有許多顆粒即為GCs，貼壁后待用。

2.6 ATP水平測定

ATP檢測采用比色法，將培養(yǎng)的對照組和模型組GCs各按5.0×107/L密度接種于96孔板中，應(yīng)用酶標(biāo)儀測定各孔吸光度值，根據(jù)公式：(測定OD-對照OD)/(標(biāo)準(zhǔn)OD-空白OD)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(1×103μmol/L)×樣本測定前稀釋倍數(shù)÷待測樣本濃度(g/L)，計(jì)算各孔ATP濃度(μmol/g)，按照說明書操作。

2.7 活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平測定

2組細(xì)胞分別用不含血清培養(yǎng)液以1∶1000體積比加載DCFH-DA探針，終濃度為10 μmol/L，按細(xì)胞濃度2×104/孔、100 μl/孔接種至96孔板中，37 ℃5% CO2環(huán)境孵育24 h，吸除孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入100 μL DCFH-DA工作液，37 ℃、5%CO2中避光孵育30 min，無血清培養(yǎng)基清洗1遍，化學(xué)發(fā)光免疫分析儀在激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長525 nm處測定DCFH，經(jīng) ROS氧化后的DCF綠色熒光強(qiáng)度，即代表ROS含量的相對吸光度值。

2.8 Nox1、p-Akt、Glut4蛋白表達(dá)

采用Western blot法，在培養(yǎng)的對照組和模型組GCs中加入RIPA細(xì)胞裂解液提取蛋白。BCA法進(jìn)行蛋白濃度測定，以50 μg總蛋白上樣量計(jì)算加樣體積行SDS-PAGE凝膠電泳。電泳后轉(zhuǎn)膜，根據(jù)Marker提示分子量切膜，左上角標(biāo)記。室溫下5%脫脂奶粉、TBST封閉液封閉2 h，分別按照1∶1000、1∶1000、1∶1000、1∶2000比例稀釋Nox1、p-Akt、Glut4和GAPDH一抗各4 mL，4 ℃搖床過夜；TBST洗膜，1∶2000比例稀釋HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗，室溫?fù)u床孵育1 h，TBST洗膜，ECL發(fā)光液曝光顯影。應(yīng)用 ImageJ軟件分析灰度值，利用目的蛋白/GAPDH的方法求得每例組織蛋白的相對表達(dá)量。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 大鼠動(dòng)情周期比較圓的白細(xì)胞，少量角化上皮細(xì)胞和有核上皮細(xì)胞。與對照組比較，模型組大鼠動(dòng)情間期顯著延長(P<0.01)。

圖1示，對照組可見規(guī)則動(dòng)情周期平均4～5 d。模型組出現(xiàn)不規(guī)則動(dòng)情周期，表現(xiàn)為間期延長，即動(dòng)情間期連續(xù)超過3 d，鏡下可見大量小而

注：與對照組比較：bP<0.01；Control(對照組)，Model(模型組)

3.2 GCs線粒體形態(tài)學(xué)變化比較

圖2示，對照組線粒體形態(tài)正常，嵴呈條狀及環(huán)狀型，模型組線粒體數(shù)量減少，出現(xiàn)明顯腫脹，嵴斷裂，線粒體呈空泡樣改變。

注：左圖為對照組透射電鏡下線粒體形態(tài)，右圖為模型組鏡下線粒體形態(tài)

3.3 GCs中ATP、ROS含量比較

圖3示，與對照組比較，模型組大鼠GCs-ATP含量顯著降低(P<0.01)，ROS含量(DC熒光強(qiáng)度)顯著增高(P<0.01)。

注：與對照組比較：bP<0.01；Control(對照組)，Model(模型組)

3.4 GCs中Nox1、p-Akt及Glut4蛋白表達(dá)比較

圖4示，與對照組比較，模型組大鼠GCs中Nox1蛋白表達(dá)顯著增高(P<0.05)，p-Akt、Glut4蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)。

注：與對照組比較：aP<0.05，bP<0.01；Control(對照組)，Model(模型組)；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1(NADPH oxidase1, Nox1)，磷酸化蛋白激酶B (phosphorylated protein kinase B, p-Akt)，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(glucose transporter protein 4, Glut4)

4 討論

卵泡閉鎖是排卵障礙的直接原因，而GCs損傷是引起卵泡發(fā)育異常和閉鎖的根本原因之一[7]。一方面GCs與卵泡膜細(xì)胞(theca cells)共同產(chǎn)生卵巢激素和分泌細(xì)胞因子，另一方面GCs通過復(fù)雜的細(xì)胞間連接機(jī)制介導(dǎo)著卵泡的生長、發(fā)育、閉鎖和排卵，GCs能量代謝穩(wěn)定能促進(jìn)卵泡發(fā)育，反之則會導(dǎo)致卵泡閉鎖，尤其是在卵泡發(fā)育的后期[8]。已有研究表明，高脂代謝產(chǎn)物導(dǎo)致GCs損傷是加劇不孕癥發(fā)生的直接風(fēng)險(xiǎn)因素[9-11]。

《傅青主女科·種子》言：“婦人有身體肥胖，痰涎甚多，不能受孕者，人以為氣虛之故，誰知是濕盛之故乎?！敝嗅t(yī)認(rèn)為，肥胖引發(fā)痰濕集聚，流注下焦，壅塞沖任胞宮，而致月經(jīng)稀發(fā)不孕，這與現(xiàn)代PCOS患者以肥胖居多的臨床表型一致?，F(xiàn)代中醫(yī)研究發(fā)現(xiàn)，長期痰濕阻絡(luò)誘發(fā)機(jī)體糖脂代謝異常，是PCOS患者體內(nèi)出現(xiàn)胰島素抵抗的重要原因[1,12]。臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn)，痰濕型PCOS是目前臨床高發(fā)的PCOS中醫(yī)證型[13，14]。本研究以痰濕型PCOS大鼠為實(shí)驗(yàn)對象，探討GCs損傷引發(fā)PCOS糖脂代謝異常的可能發(fā)生機(jī)制。

線粒體是細(xì)胞的“動(dòng)力工廠”，葡萄糖、脂肪酸、氨基酸等代謝產(chǎn)物最終都會進(jìn)入線粒體的氧化呼吸鏈合成ATP，為細(xì)胞提供能量。在卵泡發(fā)育周期過程中需要大量能量參與，GCs線粒體功能正常對卵泡發(fā)育成熟及女性生育能力的維持至關(guān)重要[3，4]。長期高脂飲食導(dǎo)致的血脂異常會誘發(fā)低密度脂蛋白沉積，激發(fā)機(jī)體氧化應(yīng)激，刺激Nox等生成大量ROS。尤其在低氧環(huán)境下，過量的ROS在超過機(jī)體自我清除能力范圍時(shí)會損傷線粒體氧化功能，包括線粒體脂肪酸氧化代謝率降低，丙酮酸氧化磷酸化水平下降等一系列糖脂終端代謝異常[15-17]。因此，高脂介導(dǎo)的ROS生成增多，氧化應(yīng)激增強(qiáng)會損傷GCs線粒體功能，使ATP合成減少，引發(fā)能量供應(yīng)不足和糖脂代謝紊亂，可能是影響卵泡發(fā)育成熟并導(dǎo)致卵泡閉鎖的重要原因。

Nox是細(xì)胞內(nèi)非線粒體源ROS生成的主要酶體，胞內(nèi)過氧化物酶系統(tǒng)中的Nox介導(dǎo)ROS產(chǎn)生的氧化應(yīng)激越來越受到關(guān)注[18，19]。而PCOS大鼠卵巢GCs中Nox活性是否通過線粒體功能來影響卵泡發(fā)育和排卵尚不清楚。Nox1主要表達(dá)在結(jié)腸、血管平滑肌、前列腺及子宮、卵巢中，發(fā)揮宿主防御及血壓調(diào)節(jié)的作用[20-22]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[23]，低氧狀態(tài)下血管內(nèi)皮細(xì)胞Nox1蛋白表達(dá)增高是激活細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的主要原因，而低氧環(huán)境是卵泡發(fā)育成熟的微環(huán)境。大量研究證實(shí)，PCOS卵巢中GCs在低氧狀態(tài)下出現(xiàn)嚴(yán)重的氧化應(yīng)激。本次研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較模型組大鼠GCs中Nox1蛋白及ROS含量增高，ATP含量降低。由于ATP源于線粒體，因此本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察了GCs線粒體形態(tài)學(xué)變化，結(jié)果顯示模型組線粒體數(shù)量明顯減少，出現(xiàn)腫脹、嵴斷裂、線粒體呈空泡樣改變，表明模型組大鼠線粒體損傷嚴(yán)重。

Akt是Nox1的下游信號，Nox1可通過抑制Akt磷酸化激活，參與組織氧化應(yīng)激反應(yīng)[24，25]。課題組前期研究證實(shí)[26]，p-Akt/Glut4信號通路是肥胖型PCOS大鼠胰島素抵抗發(fā)生的關(guān)鍵通路。本次研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較模型組大鼠GCs中p-Akt、Glut4蛋白表達(dá)顯著降低。

綜上所述，本研究認(rèn)為高脂誘導(dǎo)的Nox1高表達(dá)引發(fā)GCs氧化應(yīng)激的發(fā)生，進(jìn)而損傷了GCs線粒體糖脂代謝功能，這是導(dǎo)致痰濕型PCOS卵泡發(fā)育異常和閉鎖的可能機(jī)制之一。今后課題組將從Nox1與線粒體損傷的相關(guān)性展開深入研究。