清肺飲調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB炎癥信號通路治療細(xì)菌性肺炎的作用機(jī)制?

孫曉舟， 徐 炎， 王丹丹， 孔一卜， 郭婷婷， 郭 磊， 楊文波， 孫麗平△

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué)， 長春 130117；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院， 長春 130021)

細(xì)菌性肺炎是一種多發(fā)于春秋季節(jié)的感染性疾病，是5歲以下兒童死亡率最高的疾病之一，也是導(dǎo)致兒童住院的常見原因[1]。針對病原體應(yīng)用抗生素是臨床治療的主要策略，其臨床效果值得肯定，但隨之而來的抗生素濫用與耐藥難題備受關(guān)注[2]。本病屬于中醫(yī)學(xué)肺炎喘嗽、溫?zé)岵〉确懂?。清肺飲是國醫(yī)大師王烈教授基于“熱毒”理論[3]治療兒童肺炎喘嗽(風(fēng)熱郁肺型)的經(jīng)驗(yàn)方，由黃芩、射干、連翹等藥物組成，臨床以本方加減治療兒童風(fēng)熱郁肺型肺炎喘嗽60余年，療效顯著。有研究表明，包括黃芩在內(nèi)的多種中藥具有良好的抗菌作用[4，5]，但以黃芩為君藥的復(fù)方在抗菌作用機(jī)制方面研究較少。

細(xì)菌性肺炎的早期發(fā)病機(jī)制主要以炎癥反應(yīng)為主，Toll樣受體4(toll-like receptors, TLR4)相關(guān)信號通路是激活炎癥反應(yīng)的重要途徑[6]，核因子κB(nuclear factor kappa-B、NF-κB)是啟動炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵過程[7]。本研究分別從體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)探討清肺飲在肺炎發(fā)病過程中的作用，探討其在TLR4/NF-κB炎癥信號通路方面的作用機(jī)制，為臨床推廣應(yīng)用提供依據(jù)。本研究已通過長春中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會審查，倫理學(xué)批號20190116。

1 材料

1.1 動物

SPF級健康4～6周齡雌性Balb/c小鼠36只，體質(zhì)量(20±2) g，購自長春中醫(yī)藥大學(xué)動物學(xué)中心，實(shí)驗(yàn)動物許可證號SYXK(吉)2018-0014。動物在溫度20～26 ℃、相對濕度40%～70%的潔凈動物房內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d。

1.2 細(xì)胞

人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系(A549細(xì)胞)(貨號SCSP-503)，購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.3 藥物及制備

清肺飲顆粒藥物組成：連翹、黃芩、射干等，購于長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，用溫開水沖勻供小鼠灌胃；清肺飲溶液凍干濃縮成粉末，需要時用二甲基亞砜溶解用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。注射用頭孢曲松鈉1.0 g溶于純水中，購于臺灣泛生制藥廠股份有限公司，貨號H20100294；肺炎鏈球菌D39菌株(遵義醫(yī)學(xué)院惠贈)。

1.4 主要試劑與儀器

胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(貨號10099141)，美國Gibco公司；THB培養(yǎng)基(貨號LA18600)，北京索萊寶科技有限公司；25%胰蛋白酶(貨號C0202)，上海碧云天公司；1640培養(yǎng)基(貨號SH30096.LS)，美國Hyclone公司；噻唑藍(lán)(Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromid，MTT)(貨號ST316)，上海碧云天公司；TLR4兔單克隆抗體、NF-κB p65兔單克隆抗體、磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)兔單克隆抗體、NF-κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB，IκBα)、兔多克隆抗體、髓樣分化因子(myeloiddifferen-tiationfactor88，MyD88)、兔多克隆抗體、β微管蛋白(β-Tubulin)鼠單克隆抗體(1∶1000稀釋)、山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG(1∶5000稀釋)，abcam，貨號分別為ab22048、ab16502、ab194726、ab7217、ab219413、ab18207、ab150077、ab150113。蘇木精、伊紅染色液，阿拉丁公司(貨號H104306)；小鼠白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)、白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(tumor Necrosis factorα，TNF-α)ELISA試劑盒(貨號分別為M6000B、MLB00C、MTA00B)，美國R&D公司。

超凈工作臺(型號SW-CJ-1FB)，蘇州凈化公司；細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱(型號BC-J160S)，上海博迅公司；純水系統(tǒng)(型號WP-UPS-45)，沃特爾公司；蛋白電泳儀(型號Power Pac HC)，bio-rad公司；分子成像系統(tǒng)(型號Fxpor lius)，上海bio-rad公司。

2 方法

2.1 小鼠肺炎鏈球菌肺炎模型建立及分組給藥

參照文獻(xiàn)報道,選擇肺炎鏈球菌D39菌株，37 ℃下在THB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直至OD 600 nm達(dá)到0.4(對數(shù)中期)，離心半徑8 cm，1000 r/min離心10 cm[8]。PBS洗滌3次，獲得肺炎鏈球菌菌液。室溫環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)小鼠5 d后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、模型組、清肺飲低劑量組、清肺飲中劑量組、清肺飲高劑量組和頭孢曲松組6組各6只，對照組小鼠在正常條件下飼養(yǎng)，其余組小鼠均經(jīng)左鼻滴入1×108CFU/mL肺炎鏈球菌菌液25 μL，建立肺炎鏈球菌感染模型。按照人體與小鼠體表面積換算比例，將清肺飲復(fù)方臨床用量換算為小鼠用量，清肺飲低劑量組0.21 g/kg、清肺飲中劑量組0.42 g/kg、清肺飲高劑量組0.84 g/kg，灌胃給藥每次200 μL，每日2次；25 mg/mL頭孢曲松液皮下注射20 μL，每日1次；48 h后乙醚麻醉，脫頸處死各組小鼠取材。

2.2 HE染色檢測小鼠肺組織炎癥改變

取材當(dāng)天將小鼠肺組織浸入4%多聚甲醛內(nèi)固定，石蠟包埋，切片厚度為3 μm，脫蠟至水，蘇木精、伊紅染色，脫蠟、透明、封片。為對肺部炎癥和損傷進(jìn)行評分，對整個肺表面進(jìn)行以下參數(shù)分析，如間質(zhì)損害、血管炎、支氣管炎、水腫、血栓形成和胸膜炎。每項(xiàng)參數(shù)的評分標(biāo)準(zhǔn)為0～4(0：無；1：輕度；2：中度；3：嚴(yán)重；4：非常嚴(yán)重)[9，10]，顯示肺炎癥狀的肺表面百分比按0～5進(jìn)行評分和分級(0：無；1∶5%～20%；2:21%～40%；3:41%～60%；4:61%～80%；5:81%～100%。肺部炎癥總分為每項(xiàng)參數(shù)的得分之和，可達(dá)到的最高得分為24分[11]。

2.3 ELISA法檢測肺泡灌洗液中炎癥因子表達(dá)

小鼠頸部中線切口暴露氣管，通過滴注和回收2份0.5 mL無菌等滲0.9%氯化鈉溶液收集支氣管肺泡灌洗液[11]。收集的肺泡灌洗液在離心半徑8 cm，3000r/min離心10 cm，取上清于-80 ℃冰箱凍存，用ELISA試劑盒檢測炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α表達(dá)水平。

2.4 細(xì)胞培養(yǎng)及體外炎癥模型的建立

選用A549細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，用1640完全培養(yǎng)基(含10%FBS)于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d進(jìn)行一次傳代。細(xì)胞懸液以3×103個/孔密度接種于6孔板中，細(xì)胞貼壁后分別加入2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL脂多糖(Lipopol-ysaccharide，LPS)作用1 h，Western Blot法檢測NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκBα蛋白表達(dá)水平，篩選最佳LPS濃度建立穩(wěn)定的炎癥損傷模型。

2.5 MTT法檢測清肺飲對A549細(xì)胞存活率的影響

將細(xì)胞懸液以3×103個/孔密度接種于96孔板，同時加入0 μg/mL～1000 μg/mL不同濃度清肺飲樣品，培養(yǎng)48 h、72 h后加入終濃度為0.5 mg/mL的MTT液于37 ℃孵育4 h，隨后加入100 μL裂解液/孔，24 h后在酶標(biāo)儀490 nm下測光密度值(optical density，OD)，計算細(xì)胞存活率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 Western Blot法檢測炎癥信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

用含有1/100 PMSF的裂解液研磨提取細(xì)胞全蛋白進(jìn)行蛋白制樣，按每孔30 μg蛋白在10% SDS-PAGE中分離，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%BSA封閉1 h，分別孵育TLR4、MyD88、p-NF-κB p65、NF-κB p65、IκBα及β-Tubulin抗體4 ℃過夜，TBST洗滌3次后，山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG二抗孵育1 h，再次TBST洗滌3次，采用分子成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影，采用Quantity-One軟件分析目的條帶OD值，以β-Tubulin為內(nèi)參，以目的蛋白OD值/內(nèi)參蛋白OD值反映目的蛋白相對表達(dá)水平。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 清肺飲減輕肺炎鏈球菌肺炎小鼠肺組織炎癥損傷

通過對各組小鼠狀態(tài)進(jìn)行觀察記錄發(fā)現(xiàn)，感染12 h后，模型組小鼠開始出現(xiàn)活動量少、背毛、不愛進(jìn)食等情況；與模型組比較，經(jīng)清肺飲和頭孢曲松治療后的小鼠活動量、進(jìn)食正常，僅少數(shù)小鼠出現(xiàn)背毛情況。取材后肉眼觀察(圖1A、圖1C)模型組小鼠肺組織顏色明顯加深，呈暗紅色，肺葉充血腫脹，尤以左肺下葉顯著；清肺飲低劑量組小鼠肺組織顏色仍呈暗紅色，肺葉充血、腫脹；清肺飲中、高劑量組和頭孢曲松組小鼠肺組織顏色接近鮮紅，充血、腫脹不明顯。HE染色結(jié)果顯示(圖1B、圖1D)，對照組小鼠的肺泡和肺支氣管結(jié)構(gòu)正常；模型組小鼠肺間質(zhì)彌漫性出血，出現(xiàn)以多葉分核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞，在細(xì)支氣管管腔中有壞死脫落的上皮細(xì)胞，肺泡壁大面積增厚，肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血、破裂，紅細(xì)胞外溢，肺泡及支氣管腔內(nèi)見大量紅細(xì)胞滲出和炎性滲出物，與對照組比較肺組織炎癥評分明顯升高(P<0.01)；清肺飲低劑量組肺泡壁較厚，肺泡間隔較寬，肺泡壁見少量毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，有炎性細(xì)胞浸潤，但支氣管腔內(nèi)未見大量的炎性滲出物；清肺飲中、高劑量組和頭孢曲松組炎癥減輕，肺泡結(jié)構(gòu)較完整，肺泡壁薄，僅少量炎性細(xì)胞浸潤，且與模型組比較肺組織炎癥評分降低(P<0.01)。

注：與對照組比較：##P<0.01；與模型組比較：**P<0.01；A、C.肉眼觀察肺組織顏色和形態(tài)；B、D.各組肺組織HE染色結(jié)果(≤為原始放大40倍，比例尺：20 μm)；E.肺組織炎癥評分，n=6

3.2 清肺飲降低小鼠肺泡灌洗液中炎癥因子含量

通過ELISA法檢測小鼠肺泡灌洗液內(nèi)炎癥因子含量(見表1)，發(fā)現(xiàn)模型組IL-6、IL-1β、TNF-α含量較對照組顯著增多(P<0.01)；清肺飲中、高劑量組和頭孢曲松組IL-1β、TNF-α含量較模型組明顯降低(P<0.05，P<0.01)。

表1 各組小鼠肺泡灌洗液中炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α表達(dá)情況比較

3.3 不同濃度LPS對A549細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響

LPS能夠誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)[12]。本部分為篩選誘發(fā)炎癥反應(yīng)的LPS最佳造模濃度，選用0 μg/mL～10 μg/mL LPS刺激A549細(xì)胞1 h，Western Blot結(jié)果顯示(見圖2)，與對照組比較，10 μg/mL LPS 刺激的A549細(xì)胞內(nèi)p-NF-κB p65蛋白上調(diào)明顯(P<0.01)，NF-κB p65抑制蛋白IκBα明顯下調(diào)(P<0.01)，因此選用10 μg/mL LPS作為體外炎癥造模條件。

注：A.Western Blot 法檢測炎癥蛋白p-NF-κB p65、NF-κB p65、IκBα表達(dá)水平；B、C.各蛋白表達(dá)量化結(jié)果(n=3)；與LPS 0μg/mL組比較:*P<0.05，** P<0.01；核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)，磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)，NF-κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB，IκBα)

3.4 清肺飲對A549細(xì)胞存活率的影響

MTT法檢測清肺飲對A549細(xì)胞存活率的影響(見圖3)，100 μg/mL、200 μg/mL濃度的清肺飲對A549細(xì)胞存活率有明顯的抑制作用(P<0.01)；濃度低于50 μg/mL的清肺飲對細(xì)胞存活率幾乎無影響(P>0.05)。

注：A.清肺飲作用于A549細(xì)胞48 h; B.清肺飲作用于A549細(xì)胞72h；** P<0.01

3.5 清肺飲對A549細(xì)胞TLR4/NF-κB炎癥信號通路的調(diào)控

清肺飲干預(yù)A549細(xì)胞24 h，再經(jīng)10 μg/mL LPS造模1 h，應(yīng)用Western Blot法檢測炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)情況。圖4示，與對照組比較，模型組炎癥蛋白TLR4、MyD88、NF-κB p65表達(dá)上調(diào)，IκBα蛋白表達(dá)量下降至對照組的47%(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與模型組比較，清肺飲干預(yù)后TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)下調(diào)，IκBα蛋白表達(dá)上調(diào)，其中清肺飲高劑量組對TLR4通路蛋白的干預(yù)最為

注：圖4-A.Western Blot法檢測A549細(xì)胞中炎癥蛋白TLR4、MyD88、p-NF-κB p65、NF-κB p65、IκBα表達(dá)水平；B、C.各蛋白表達(dá)量化結(jié)果(n=3)；與對照組比較：##P<0.01；與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01；核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)、磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)，NF-κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB，IκBα)、髓樣分化因子(myeloiddifferentiationfactor88，MyD88)、Toll樣受體4(Toll-like receptors, TLR4)

顯著(P<0.01)；頭孢曲松組TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05，P<0.01)，IκBα蛋白表達(dá)量上調(diào)至模型組的2.4倍(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 討論

肺炎是嚴(yán)重的全球健康問題[9,13]，全世界每年有超過200萬的5歲以下兒童因肺炎死亡，死亡率高達(dá)20%[1]，其危害甚至可能超過了癌癥、糖尿病、艾滋病。感染性因素是導(dǎo)致肺炎的主要原因，而細(xì)菌、病毒、支原體等微生物是引起感染性肺炎的主要誘因[1,14]。自上世紀(jì)磺胺類藥物和青霉素問世以來，抗生素作為細(xì)菌感染性疾病的首選藥物[15]，其中頭孢曲松作為第三代頭孢菌素在細(xì)菌性肺炎的臨床及基礎(chǔ)研究中廣為應(yīng)用[16-19]。但不合理用藥及耐藥現(xiàn)象日益突出，2015年10月世界衛(wèi)生組織發(fā)布的《全球抗菌藥物耐藥性監(jiān)測系統(tǒng)(GLASS)報告》數(shù)據(jù)提示，其已成為威脅人類健康的重大公共衛(wèi)生問題，加強(qiáng)耐藥菌感染的治療問題亟待解決[2,20]。

中醫(yī)藥治療感染性和傳染性疾病療效確切。古今文獻(xiàn)已有大量中醫(yī)藥治療感染性疾病的記載[21-24]，中醫(yī)藥的抗菌作用逐漸成為研究熱點(diǎn)，其作用機(jī)制和靶點(diǎn)有待深入研究。

細(xì)菌性肺炎以肺熱為主要病機(jī)[25]，痰、熱、毒為其病理產(chǎn)物，乃因熱邪犯肺、肺失宣降、臟腑功能失調(diào)、肺氣郁閉所致[26]。王烈認(rèn)為，六淫之邪皆為毒邪，并提出“無毒不發(fā)熱，熱因毒而起”的“熱毒”理論[3]，指出“熱毒”是細(xì)菌性肺炎的主要病因及主癥表現(xiàn)。此處之“熱毒”乃是基于“有一分內(nèi)熱便有一分外感”“無毒不生熱”等認(rèn)識，闡述一系列熱病或熱癥并非單指溫病中之溫毒[27，28]。清肺飲就是王烈基于“熱毒”理論所創(chuàng)立的經(jīng)驗(yàn)方，臨床實(shí)踐多年效果顯著。全方均為寒涼之品，方中黃芩為君藥，擅瀉肺火、清肺熱?，F(xiàn)代研究已表明，黃芩及其單體對葡萄球菌、溶血性璉球菌、肺炎鏈球菌等有抑制作用，且抗炎抗變態(tài)反應(yīng)機(jī)制明確[22,29]；連翹為臣藥，可疏散風(fēng)熱、清熱解毒；射干清熱解毒、消炎散結(jié)。全方以清瀉肺熱、清熱解毒為主，用于治療細(xì)菌、病毒感染等引起的小兒肺炎，故取其名曰“清肺飲”。

肺炎鏈球菌作為細(xì)菌性肺炎的常見致病菌，廣泛定植于人鼻咽部，攜帶率為27%～85%[30]。本研究選擇感染率高的肺炎鏈球菌作為致病菌建立肺炎小鼠模型。從HE染色的病理結(jié)果顯示，模型組小鼠肺間質(zhì)彌漫性出血，肺泡壁大面積增厚，肺泡、支氣管腔內(nèi)可見大量紅細(xì)胞滲出和炎癥細(xì)胞浸潤；清肺飲和頭孢曲松治療后肺間質(zhì)及肺泡毛細(xì)血管擴(kuò)張、出血、炎癥細(xì)胞浸潤程度均減輕，炎癥因子IL-1β、TNF-α表達(dá)含量及肺炎癥評分降低。由此可見，本研究從體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了清肺飲可減少小鼠肺組織炎性浸潤，減輕肺炎鏈球菌引起的炎癥反應(yīng)，達(dá)到與頭孢曲松相似的抗肺炎療效。既往大量研究中都將LPS作為經(jīng)典的體外炎癥模型[31-33]，LPS作為大多數(shù)細(xì)菌外璧層中產(chǎn)生的內(nèi)毒素，可與一種重要的非特異性免疫蛋白分子Toll樣受體結(jié)合[34]。TLR4識別LPS后發(fā)生活化，通過MyD88激活絲氨酸/蘇氨酸激酶，誘導(dǎo)抗微生物防御系統(tǒng)產(chǎn)生IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥細(xì)胞因子，加重炎癥反應(yīng)[35]；此外，TLR4還會激活與炎癥反應(yīng)有關(guān)的NF-κB和蛋白激酶磷酸酶家族等活化反應(yīng)。NF-κB作為啟動炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵蛋白，當(dāng)與其抑制蛋白IκBs聯(lián)合時使空間構(gòu)象發(fā)生改變，IκB蛋白激酶磷酸化，磷酸化的IκBs發(fā)生泛素化降解，使NF-κB從NF-κB-IκBs復(fù)合物中解離出來進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生[36]。p65是NF-κB的亞基，炎癥反應(yīng)狀態(tài)下活化入核是炎性損傷程度的標(biāo)志物。IκBα作為IκBs家族的主要成員，其蛋白表達(dá)降低表示炎癥通路激活[7,37]。由此本研究基于此炎癥通路進(jìn)行Western Blot實(shí)驗(yàn)，研究結(jié)果表明10 μg/mL LPS刺激A549細(xì)胞1 h，NF-κB p65蛋白表達(dá)上調(diào)明顯，IκBα蛋白表達(dá)下調(diào)，故選擇10 μg/mL LPS刺激A549細(xì)胞1 h為急性炎癥損傷體外造模條件?；诩?xì)胞水平進(jìn)行清肺飲干預(yù)后，炎癥信號通路相關(guān)蛋白TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達(dá)下調(diào)，IκBα蛋白表達(dá)升高，尤以清肺飲高劑量組差異顯著。因此提示，清肺飲可通過抑制NF-κB的活性，調(diào)控LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)起到抗炎作用。

綜上所述，基于國醫(yī)大師王烈“熱毒”理論所擬的清肺飲，可減輕肺炎鏈球菌感染引起的小鼠肺組織病理損傷，減少炎癥因子的分泌，可通過調(diào)控TLR4/NF-κB信號通路起到抗炎的生物學(xué)功效。今后將對清肺飲多組學(xué)、多靶點(diǎn)的作用機(jī)制進(jìn)行更為深入系統(tǒng)的研究與探討，為中醫(yī)藥治療肺部感染性疾病提供新思路，為指導(dǎo)臨床提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。