5/6腎臟切除動(dòng)物疾病模型的中醫(yī)證候探索及扶正化瘀降濁通絡(luò)方證測(cè)驗(yàn)*

陳紫薇， 陳 明， 何凱杰， 陳艷瓊

(1.成都市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院， 成都 610000；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院， 成都 610000)

慢性腎衰竭(chronic renal failure, CRF)是多種原發(fā)和繼發(fā)性腎臟病變持續(xù)進(jìn)展的共同結(jié)果，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康和生命[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥在延緩腎病進(jìn)展方面療效獨(dú)特，但作用機(jī)制尚不明確，需深入探討。動(dòng)物模型是中醫(yī)藥機(jī)制研究的重要載體，5/6腎切除大鼠模型是通過(guò)手術(shù)方式減少有效腎單位，從而建立的一種CRF經(jīng)典西醫(yī)動(dòng)物疾病模型[2]，但是中醫(yī)藥研究需要“病證結(jié)合”[3]，此模型是否能用于中醫(yī)藥機(jī)制研究，值得進(jìn)一步探討。

有人發(fā)現(xiàn)，機(jī)體細(xì)胞免疫功能(CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞)的變化與中醫(yī)“正虛證”密切相關(guān)[4-6]，而C反應(yīng)蛋白(c reactive protein，CRP)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素(interleukin，IL)-1β、IL-6等微炎癥狀態(tài)指標(biāo)，被認(rèn)為是機(jī)體“邪實(shí)證”的重要物質(zhì)學(xué)基礎(chǔ)[6-8]。同時(shí)中醫(yī)認(rèn)為CRF病程長(zhǎng)，病勢(shì)纏綿難愈，多見(jiàn)“虛實(shí)夾雜證”。本研究擬從宏觀方向(大鼠一般情況)和微觀方向(細(xì)胞免疫功能和微炎癥狀態(tài)指標(biāo))研究5/6腎切除大鼠的中醫(yī)證候變化，同時(shí)通過(guò)“以方測(cè)證”[9]，使用前期臨床研究對(duì)CRF療效確切的經(jīng)驗(yàn)方——扶正化瘀降濁通絡(luò)方干預(yù)5/6腎切除大鼠，進(jìn)一步探討其中醫(yī)證候，以期明晰此模型是否能夠作為中醫(yī)藥機(jī)制研究的理想模型，為CRF“正虛邪實(shí)證”的中醫(yī)藥研究提供載體。本研究已通過(guò)成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查,批準(zhǔn)號(hào)SCEC2019-051-01。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)別雄性SD大鼠54只，體質(zhì)量(190±20) g，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)scxk(川)2015-030。飼養(yǎng)環(huán)境溫度(25±2) ℃，相對(duì)濕度50%～70%，自由進(jìn)食與飲水。

1.2 主要試劑與儀器

Anti-rat CD4抗體、Anti-rat CD8a抗體(Bio Legend 公司，貨號(hào)分別為201511、200607)；CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA試劑盒(Becton Dickinson公司，貨號(hào)分別為7172720、P150695、P150683、P149504)。

全自動(dòng)生化分析儀(Siemens公司，型號(hào)ADVIA2400)；流式細(xì)胞儀(BD公司，型號(hào)FACSAria III)；酶標(biāo)分析儀(TECAN公司,型號(hào)sunrise)；臺(tái)式離心機(jī)(江蘇湘儀公司，型號(hào)L500)；洗板機(jī)(SYM-Bio Life Science公司, 型號(hào)Egate2310)。

1.3 藥物

扶正化瘀降濁通絡(luò)方組成：黃芪(批號(hào)1702001)、熟地黃(批號(hào)1704098)、甘草(批號(hào)1607078)、丹參(批號(hào)1610049)、紅花(批號(hào)1704094)、土鱉蟲(chóng)(批號(hào)1604061)、酒水蛭(批號(hào)1612015)、酒黃芩(批號(hào)1609043)、酒大黃(批號(hào)170107)，均購(gòu)于成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院的中藥房，按照傳統(tǒng)中藥煎煮方法制備用于灌胃的中藥水煎劑，濃縮煎劑至5.24 g/mL(含扶正化瘀降濁通絡(luò)方生藥)備用。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組、模型制備及給藥

將SD大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、模型組、中藥組各18只。模型組、中藥組動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行造模手術(shù)，造模前禁食不禁水，給予2%戊巴比妥30 mg/kg腹腔注射麻醉，開(kāi)腹暴露左腎，切除腎臟的上下極及外側(cè)(共2/3腎臟組織)，1周后行右腎全切術(shù)，完成5/6腎切除手術(shù)造模，術(shù)后恢復(fù)1周后進(jìn)入藥物干預(yù)治療階段。假手術(shù)組同期給予開(kāi)腹手術(shù)，僅暴露腎臟不行腎臟切除，飼養(yǎng)方法同模型組。各組大鼠術(shù)后均未出現(xiàn)手術(shù)切口感染，未行抗生素預(yù)防性抗感染處理。造模成功后，給藥劑量按臨床實(shí)驗(yàn)方法學(xué)計(jì)算，給予扶正化瘀降濁通絡(luò)方水煎液39.3 g/kg體質(zhì)量灌胃，每日1次。模型組和假手術(shù)組給予等量清潔飲用水灌胃。

2.2 標(biāo)本采集

灌胃后4周、8周、12周分別處死一批大鼠，每組每階段處死6只。末次給藥后將大鼠置于代謝籠中，禁食不禁水，24 h后給予2%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取全血1 mL留作流式細(xì)胞儀T細(xì)胞亞群檢測(cè)，取全血2 mL離心后分離血清，用于生化及CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6的ELISA檢測(cè)。

2.3 觀察指標(biāo)與檢測(cè)方法

2.3.1 大鼠一般情況觀察 動(dòng)態(tài)記錄各組動(dòng)物的精神狀態(tài)、活動(dòng)狀態(tài)、毛發(fā)光澤度、目色、舌色、四肢情況、飲水量、二便及體質(zhì)量變化。

2.3.2 生化指標(biāo)檢測(cè) 采用全自動(dòng)生化分析儀酶法檢測(cè)血肌酐和尿素氮水平。

2.3.3 全血T細(xì)胞亞群檢測(cè) 運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)全血T細(xì)胞亞群CD4+(%)、CD8+(%)，具體按試劑盒步驟操作。

2.3.4 CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6微炎癥指標(biāo)檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)血清CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6含量，具體按試劑盒步驟操作。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠一般情況變化

與假手術(shù)組比較，模型組的行為狀態(tài)自8周出現(xiàn)異常，表現(xiàn)為精神萎靡，喜互相抱團(tuán)；外觀出現(xiàn)改變，可見(jiàn)毛色變黃、無(wú)光澤、豎起、雜亂無(wú)章，目色、耳色變淡，尿量增加，部分可見(jiàn)尿液渾濁；12周時(shí)活動(dòng)度明顯下降，外觀可見(jiàn)毛色枯黃，部分大鼠自行撕咬皮毛、局部毛發(fā)斑駁、舌色紫黯、四肢腫脹等，尿量減少，大便出現(xiàn)干結(jié)。中藥組8周時(shí)也呈現(xiàn)精神萎靡，活動(dòng)度下降，外觀上毛發(fā)光澤度減弱，目色、耳色變淡，但較模型組好轉(zhuǎn)，大便稀軟不成形，12周時(shí)大鼠活動(dòng)度與8周相似，尿量較模型組多，大便稀軟不成型，至12周仍未見(jiàn)舌色紫黯且無(wú)四肢腫脹。

3.2 各組大鼠體質(zhì)量變化

表1示，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中大鼠體質(zhì)量持續(xù)增長(zhǎng)。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠第8周體質(zhì)量下降(P<0.05)，12周時(shí)明顯下降(P<0.01)。與模型組比較，中藥組第8周與第12周體質(zhì)量均明顯增長(zhǎng)(P<0.05)。

3.3 各組大鼠血肌酐和尿素氮變化比較

表1示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠4周、8周、12周的血肌酐與尿素氮水平均顯著升高(P<0.01)，中藥組與模型組比較，4周、8周、12周的血肌酐水平顯著下降(P<0.01)，但與尿素氮水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、血肌酐、尿素氮變化比較

3.4 各組大鼠CD4+T、CD8+T細(xì)胞比率變化

表2示，相較假手術(shù)組，模型組CD4+T細(xì)胞比率從第8周開(kāi)始下降(P<0.05)，12周下降更加明顯(P<0.01)，CD8+T細(xì)胞比率在8周、12周均有升高(P<0.01)。與模型組比較，中藥組同期的CD4+T細(xì)胞比率有所升高，其中以12周升高明顯(P<0.05)，表明中藥可降低12周時(shí)CD8+T細(xì)胞比率(P<0.05)。

表2 各組大鼠CD4+、CD8+細(xì)胞比率變化比較

3.5 各組大鼠血清CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6變化

表3示，與假手術(shù)組比較，自4周起，模型組CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6均有明顯升高(P<0.01)，且隨病程延長(zhǎng)逐漸上升。與模型組比較，中藥組微炎癥因子表達(dá)量均下降，其中CRP、IL-1β第8周、12周表達(dá)量均明顯下降(P<0.01)，TNF-α、IL-6第12周時(shí)表達(dá)量明顯下降(P<0.05，P<0.01)。

表3 各組大鼠血清CPR、TNF-α、IL-1β、IL-6變化比較

4 討論

5/6腎切除模型是目前經(jīng)典的CRF動(dòng)物疾病模型[10]，主要采用手術(shù)方式造成有效腎單位減少，呈“三高”狀態(tài)(高壓力、高濾過(guò)、腎小球高灌注)，最終形成以腎小球硬化、腎小管萎縮、腎間質(zhì)纖維化為病理特點(diǎn)的動(dòng)物疾病模型，并伴有血肌酐、尿素氮升高、腎小球的濾過(guò)率下降等實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)變化，與臨床CRF疾病發(fā)展模式非常相似，同時(shí)具備造模方式單一、簡(jiǎn)便易行、穩(wěn)定性與重復(fù)性好、干擾因素少等優(yōu)勢(shì)[11]。本研究動(dòng)態(tài)檢測(cè)CRF大鼠血肌酐、尿素氮情況發(fā)現(xiàn)，隨著病情進(jìn)展大鼠血肌酐和尿素氮水平持續(xù)增長(zhǎng)，并通過(guò)計(jì)算大鼠的腎小球?yàn)V過(guò)率進(jìn)行性下降，符合CRF的診斷標(biāo)準(zhǔn)，是一種成功的西醫(yī)動(dòng)物疾病模型。

中醫(yī)尚無(wú)CRF的病名，大部分醫(yī)家認(rèn)為腎虛為其核心機(jī)制，常伴見(jiàn)肺脾心肝等多臟虛損，腎病日久，耗損正氣，正氣虧虛，推動(dòng)無(wú)力，致氣機(jī)阻滯，有形之邪漸長(zhǎng)；氣不行血，血不行常道，致血瘀脈絡(luò)；陽(yáng)虛可致氣化不利，水濕停聚，絡(luò)脈阻滯，逐漸出現(xiàn)病理產(chǎn)物等內(nèi)邪積聚[12],故CRF本屬“本虛標(biāo)實(shí)”范疇[13]。動(dòng)物基礎(chǔ)研究無(wú)法通過(guò)傳統(tǒng)的“望聞問(wèn)切”對(duì)大鼠進(jìn)行辨證，但從宏觀水平觀察，本實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠出現(xiàn)精神萎靡、喜互相抱團(tuán)、活動(dòng)度下降等陽(yáng)氣衰弱表現(xiàn)?！端貑?wèn)·六節(jié)臟象論篇》曰：“腎者，……其華在發(fā)。”大鼠毛色變黃、皮毛無(wú)光澤、毛發(fā)豎起、雜亂無(wú)章，呈現(xiàn)腎虛表現(xiàn)；大鼠目色、耳色變淡，與脾虛不能運(yùn)化、氣血生化無(wú)源有關(guān)；后期大鼠出現(xiàn)自行撕咬皮毛，考慮與血虛風(fēng)動(dòng)所致；同時(shí)其舌色紫黯，考慮因陽(yáng)氣無(wú)力推動(dòng)，體內(nèi)瘀血阻滯；其四肢腫脹，出現(xiàn)大便干結(jié)，考慮因脾虛、水液代謝失司所致?？梢?jiàn)CRF大鼠存在脾腎虧虛和濁瘀內(nèi)阻證候，系典型的“正虛邪實(shí)證”。

研究表明，肝郁脾虛、肝腎陰虛、脾腎陽(yáng)虛等以虛證為主要證型的患者體內(nèi)CD4+/CD8+細(xì)胞比值顯著低于正常[5]。使用百令膠囊等補(bǔ)腎健脾扶正類(lèi)中藥，可改善T細(xì)胞免疫失調(diào)情況，提高免疫能力[14]，故可通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞免疫功能指標(biāo)(CD4+T細(xì)胞比率、CD8+T細(xì)胞比率)，反映動(dòng)物正氣強(qiáng)弱情況。本研究發(fā)現(xiàn)，CRF大鼠血肌酐升高的同時(shí)，其體內(nèi)CD4+T細(xì)胞比率逐漸下降，CD8+T細(xì)胞比率逐漸增高，說(shuō)明大鼠的免疫功能下降，從微觀水平提示CRF大鼠有“正氣虧虛”的微觀中醫(yī)證候。

研究發(fā)現(xiàn)，CRF患者因腎小球?yàn)V過(guò)率下降、自由基等氧化產(chǎn)物清除減少,氧化抗氧化系統(tǒng)失衡,促進(jìn)了炎癥反應(yīng),體內(nèi)都存在以CRP明顯升高和炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6等在正常范圍內(nèi)相對(duì)升高為特征的慢性炎癥狀態(tài)的炎癥反應(yīng)[15]。研究發(fā)現(xiàn)，濕濁證患者血清CRP升高的概率是非濕濁證的4.125倍，提示濕濁證患者CRP水平高于非濕濁證患者[16]。李小會(huì)等[17]發(fā)現(xiàn)，濕熱證型患者TNF-α、IL-1β、IL-6含量顯著高于脾腎陽(yáng)虛證組。李媛等[18]發(fā)現(xiàn)，使用健脾除濕藥物可使患者體內(nèi)血清CRP、TNF-α、IL-6水平明顯降低，全身炎癥狀態(tài)得到改善，故可將微炎癥狀態(tài)看作是CRF“邪實(shí)證”的微觀體現(xiàn)[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，4周時(shí)微炎癥指標(biāo)出現(xiàn)一個(gè)小高峰，考慮與術(shù)后炎性反應(yīng)所致。從整體12周觀察來(lái)看，CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥指標(biāo)進(jìn)行性增高，說(shuō)明CRF大鼠存在微炎癥狀態(tài)，提示該模型大鼠呈現(xiàn)“邪實(shí)證”微觀中醫(yī)證候。

為進(jìn)一步明晰該CRF大鼠的中醫(yī)證候特征，本研究運(yùn)用“以方測(cè)證”原理[9]，使用臨床治療CRF“正虛邪實(shí)證”的有效驗(yàn)方扶正化瘀降濁通絡(luò)方干預(yù)CRF大鼠。扶正化瘀降濁通絡(luò)方組成：生黃芪、熟地黃、酒大黃、黃芩、丹參、紅花、酒水蛭、土鱉蟲(chóng)、甘草，為CRF經(jīng)典方(腎康方)和《金匱要略》經(jīng)方(大黃蟲(chóng)丸)化裁而成，具有“通補(bǔ)并用，標(biāo)本兼顧”之效，彌補(bǔ)了腎康方活血之力不足、大黃蟲(chóng)丸補(bǔ)虛之效欠佳等缺陷，取長(zhǎng)補(bǔ)短是治療慢性腎臟病“正虛邪實(shí)證”的基本方。本研究顯示，使用扶正化瘀降濁通絡(luò)方后大鼠仍精神萎靡，但活動(dòng)度增加，說(shuō)明陽(yáng)氣得到一定補(bǔ)充；大鼠外觀較模型組狀態(tài)好，說(shuō)明使用補(bǔ)益脾腎藥物后脾腎虧虛狀態(tài)得到改善；舌色紫黯情況不明顯，說(shuō)明給予活血通絡(luò)藥物后體內(nèi)瘀血阻滯情況有所好轉(zhuǎn)。從宏觀層面觀察，使用扶正化瘀降濁通絡(luò)方可使CRF“正虛邪實(shí)”情況得到改善。從微觀水平分析，扶正化瘀降濁通絡(luò)方治療后大鼠體內(nèi)CD4+T細(xì)胞比率下降幅度減緩，CD8+T細(xì)胞比率增高幅度變慢，提示大鼠的“正虛證”情況有所改善，同時(shí)運(yùn)用此方還使CRF大鼠體內(nèi)CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6等微炎癥指標(biāo)增幅減緩，證實(shí)CRF大鼠“邪實(shí)證”情況好轉(zhuǎn)，具有“祛邪”功效，基于“以方測(cè)證”原理，可見(jiàn)該模型符合“正虛邪實(shí)證”。

綜上所述，5/6腎切除模型是一個(gè)經(jīng)典的CRF疾病模型，同時(shí)存在免疫異常和微炎癥狀態(tài)。通過(guò)宏觀及微觀水平研究證實(shí)，其符合“正虛邪實(shí)證”，可作為進(jìn)行中醫(yī)藥治療具有“正虛邪實(shí)證”CRF動(dòng)物研究載體，同時(shí)可作為以“扶正祛邪”為治則的中藥復(fù)方研究的動(dòng)物模型，但因?qū)嶒?yàn)局限性，未能明確該模型具體的臟腑虛損和內(nèi)邪種類(lèi)，仍需進(jìn)一步的研究與探索。