解毒通絡(luò)調(diào)肝方對(duì)INS-1細(xì)胞糖毒性的保護(hù)作用研究

張琦 靳雯棋 張乃文 安珊 徐慧琛 樸春麗

目前，中國(guó)糖尿病的發(fā)病率飛速增長(zhǎng)，根據(jù)最新全國(guó)流行病學(xué)調(diào)查報(bào)告，其形勢(shì)不容樂(lè)觀，成年人患病人數(shù)約為1.298億[1]。因此防治糖尿病刻不容緩。糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生皆與β細(xì)胞數(shù)量減少及功能損傷直接相關(guān)[2]，長(zhǎng)時(shí)間暴露在高糖之下會(huì)誘發(fā)β細(xì)胞凋亡[3]。目前越來(lái)越多的研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與胰島β細(xì)胞的功能和數(shù)量密切相關(guān)[4]。胰島β細(xì)胞具有高度發(fā)達(dá)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上有3種跨膜蛋白，即：阻抗性激酶lα(inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α)、雙鏈RNA依賴性蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R -like endoplasmic reticulum kinase，PERK)和活化的轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)[5]，這3種跨膜蛋白是能引起未折疊蛋白反應(yīng)的效應(yīng)蛋白[6]。當(dāng)機(jī)體處于高糖環(huán)境時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白增多，導(dǎo)致其功能紊亂，即而發(fā)生未折疊蛋白反應(yīng)。當(dāng)未折疊蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積累時(shí)，IRE1α、ATF6、PERK 3條信號(hào)通路就會(huì)被激活，從而介導(dǎo)胰島細(xì)胞的損傷[7]。因此，在治療2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)時(shí)，從調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激方面入手將會(huì)成為一個(gè)新的治療方向。

糖尿病屬于中醫(yī)“消渴”范疇，其發(fā)生發(fā)展與肝臟關(guān)系密切，“從肝論治”已成為中醫(yī)治療糖尿病的重要理論依據(jù)之一[8]。解毒通絡(luò)調(diào)肝方是基于“毒損肝絡(luò)”理論確立治療T2DM的有效方劑，在前期的大量臨床試驗(yàn)中驗(yàn)證[9-10]，解毒通絡(luò)調(diào)肝方對(duì)T2DM及其并發(fā)癥的患者治療效果明顯，具有促進(jìn)糖脂代謝、緩解臨床癥狀的作用。前期基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究證明解毒通絡(luò)調(diào)肝方可改善糖脂代謝及胰島素抵抗，抑制其胰腺組織細(xì)胞凋亡[11-12]。本研究采用體外培養(yǎng)的大鼠胰島β細(xì)胞株[大鼠胰島細(xì)胞瘤細(xì)胞(islet cell tumor cell,INS-1)]，觀察解毒通絡(luò)調(diào)肝方對(duì)高糖誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞損傷和對(duì)胰島β細(xì)胞保護(hù)的影響，并從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激角度探究其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與藥物

INS-1細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。將細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%的1640 培養(yǎng)基中，在37℃，95%濕度，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

解毒通絡(luò)調(diào)肝方，藥物組成：黃連 15 g、榛花10 g、酒大黃 6 g、黃芪15 g、丹參15 g、柴胡10 g，粉碎后加水3次，每次煮沸1小時(shí)，調(diào)節(jié)pH值為7，過(guò)濾2次，濃縮至2 g/mL，微孔膜過(guò)濾。在精制藥液中加入10%甘露醇，并將溶液的pH值調(diào)節(jié)至6～7，在-50℃下預(yù)凍4小時(shí)，在-20℃下升華14小時(shí)，在30℃下干燥10小時(shí)，獲得的凍干樣品。之后將藥物凍干粉溶于1640培養(yǎng)基中，按照中藥凍干粉終濃度分為低劑量組50 μg/mL、中劑量組100 μg/mL、高劑量組200 μg/mL，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院(福田)制劑室提供，4℃保存。

1.2 主要試劑

1640 培養(yǎng)基及胎牛血清，Gibco 公司；大鼠胰島素Elisa試劑盒購(gòu)，羅氏生物科技有限公司；噻唑藍(lán)(MTT)，Sigma公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒及RT-PCR 試劑盒，天根生物公司；引物，上海生物工程技術(shù)服務(wù)公司；GAPDH、IRE1α、ATF6、PERK抗體以及羊抗兔、羊抗鼠，美國(guó)CST中國(guó)公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo公司；超凈工作臺(tái)，山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司；離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；倒置顯微鏡，日本尼康公司；電泳儀、PCR儀、轉(zhuǎn)膜儀，美國(guó)Bio-Rad公司；Infinite 200 PRO 酶標(biāo)儀，瑞士Tecan公司；化學(xué)發(fā)光儀，GENE公司。

1.4 分析解毒通絡(luò)調(diào)肝方中化合物的理化性質(zhì)

藥物的化學(xué)和分子性質(zhì)主要由分子量(molecular weight，MW)、口服生物利用度(oral bioavailability，OB)、藥物相似性(drug similarity，DL)、氫鍵供體原子數(shù)(number of hydrogen bond donor atoms，Hdon)、氫鍵受體原子數(shù)(number of hydrogen bond acceptor atoms，Hacc)和辛醇-水分配系數(shù)(octanol-water partition coefficient，LogP)決定[5]。因此從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中提取其參數(shù)，并分析各成分的性質(zhì)。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

將INS-1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至近融合時(shí)，通過(guò)胰蛋白酶消化細(xì)胞，1∶3傳代，并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。關(guān)于細(xì)胞分組，取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的INS-1細(xì)胞，用胰酶消化后，制備單細(xì)胞懸液，將其接種于新的培養(yǎng)板，24小時(shí)后棄培養(yǎng)液，細(xì)胞分為對(duì)照組、高糖誘導(dǎo)的模型組、解毒通絡(luò)調(diào)肝方不同濃度治療組(50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。孵育24小時(shí)后收集，檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)待用。

1.6 MTT法檢測(cè)細(xì)胞的存活率

將對(duì)照組、解毒通絡(luò)調(diào)肝方組(50、100、200 μg/mL)的細(xì)胞，以1×104/孔接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24小時(shí)，棄去培養(yǎng)板中的上清，每孔加入100 μL濃度為0.5 mg/mL的MTT溶液后，避光培養(yǎng)4小時(shí)，將MTT溶液棄去后，向每孔加入DMSO(150 μL/孔)，振蕩5分鐘后用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定490 nm處的吸光值，經(jīng)過(guò)計(jì)算即可得到細(xì)胞存活率。

1.7 胰島細(xì)胞功能相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè)

采用Trizol 試劑提取各組細(xì)胞中總RNA。然后用Infinite 200 PRO 酶標(biāo)儀測(cè)量RNA的純度和完整性。使用PrimeScript RT試劑盒將2 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。RT-PCR采用SYBR Green PCR主混合物和Bio-Rad CFX96實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行。熱循環(huán)條件包括40個(gè)循環(huán)：在95℃下變10秒，在60℃下退火10秒，在72℃下延15秒。對(duì)每個(gè)基因的PCR產(chǎn)物進(jìn)行了相對(duì)定量分析，計(jì)算每個(gè)PCR產(chǎn)物條帶強(qiáng)度與GAPDH強(qiáng)度的相對(duì)比率。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.8 葡萄糖刺激胰島素分泌實(shí)驗(yàn)

除對(duì)照組以外，其余各組細(xì)胞更換含20 mM的高糖培養(yǎng)基，PBS清洗，加500 μL無(wú)糖的 KRB Buffer 孵育1小時(shí)。棄掉上清，加500 μL含5 mmol/L(低糖)或20 mmol/L(高糖)葡萄糖的KRB Buffer，繼續(xù)孵育1小時(shí)之后，收集上清液，利用ELISA試劑盒檢測(cè)，按照說(shuō)明書(shū)具體操作步驟繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，于酶標(biāo)儀450 nm讀值，并將所得的吸光度值分別代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線方程，計(jì)算各組細(xì)胞上清液中胰島素水平。

1.9 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

用Western blot法分別檢測(cè)ATF6、PERK和IRE1α蛋白在各組細(xì)胞中的表達(dá)情況。收集分組培養(yǎng)后的細(xì)胞，用4℃預(yù)冷的裂解液裂解細(xì)胞10分鐘，用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)試濃度，將其蛋白變性，而后SDA-PAGE電泳，電泳后蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜，膜轉(zhuǎn)至封閉液中1小時(shí)。一抗用封閉液1∶1000稀釋，后于4℃搖床孵育過(guò)夜。然后TBST漂洗5次，每次3分鐘，清洗后，二抗室溫孵育1小時(shí)，TBST再次漂洗5次，每次3分鐘。在膜表面均勻滴加化學(xué)發(fā)光液(A液∶B液為1∶1)，避光反應(yīng)1～2分鐘。曝光顯影，采集圖像。通過(guò)軟件分析蛋白表達(dá)水平。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 解毒通絡(luò)調(diào)肝方組分分析

從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中總結(jié)并可視化了解毒通絡(luò)調(diào)肝方中潛在成分MW、LogP、Hdon、Hacc、OB和DL的性質(zhì)。值得注意的是，解毒通絡(luò)調(diào)肝方中每種草藥的潛在化合物的物理和化學(xué)性質(zhì)是一致的。如圖1所示，潛在成分的分子量集中在100～1000之間，這些活性成分的LogP范圍為-3～11。對(duì)于DL和OB，課題組發(fā)現(xiàn)DL和OB分別集中在0.1～0.9和10～90之間。Hacc和Hdon均小于13?？偟膩?lái)說(shuō)，解毒通絡(luò)調(diào)肝方的這些活性成分是具有小分子量和親水性的復(fù)雜化合物。

圖1 解毒通絡(luò)調(diào)肝方中每種草藥的化合物的理化性質(zhì)

2.2 解毒通絡(luò)調(diào)肝方對(duì)INS-1細(xì)胞存活率的影響

采用MTT法檢測(cè)不同濃度的解毒通絡(luò)調(diào)肝方對(duì)INS-1細(xì)胞存活率的影響。如表2所示，與對(duì)照組相比，不同濃度的解毒通絡(luò)調(diào)肝方的細(xì)胞存活率不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，說(shuō)明不同濃度的解毒通絡(luò)調(diào)肝方(50、100、200 μg/mL)對(duì)INS-1細(xì)胞存活率無(wú)明顯影響。

表2 不同濃度的解毒通絡(luò)調(diào)肝方對(duì)INS-1細(xì)胞存活率的影響

2.3 解毒通絡(luò)調(diào)肝方對(duì)INS-1細(xì)胞的胰島素分泌功能的影響

利用GSIS方法對(duì)INS-1細(xì)胞的胰島素分泌量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，在高糖刺激下，模型組的胰島素分泌水平較對(duì)照組下降了50%左右，且具有顯著性差異(P<0.01)。用解毒通絡(luò)調(diào)肝方處理后，INS-1細(xì)胞的胰島素分泌增加，與模型組相比分別增加了24.7%、35.17%、49.1%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同濃度的解毒通絡(luò)調(diào)肝方均能增加INS-1細(xì)胞的胰島素分泌量, 且隨著解毒通絡(luò)調(diào)肝方濃度的增大，呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。見(jiàn)表3。

表3 解毒通絡(luò)調(diào)肝方對(duì)INS-1細(xì)胞胰島素分泌功能的影響

2.4 解毒通絡(luò)調(diào)肝方對(duì)INS-1細(xì)胞中INS1、INS2、PDX1、MafA mRNA表達(dá)的影響

通過(guò)檢測(cè)胰島素合成相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，模型組INS-1細(xì)胞中INS1、INS2、PDX1、MafA 的mRNA 與空白組相比，表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；不同濃度的解毒通絡(luò)調(diào)肝方顯著抑制INS1、INS2、PDX1、MafA的mRNA的降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而且隨著解毒通絡(luò)調(diào)肝方濃度的增加，其作用效果愈加明顯。說(shuō)明解毒通絡(luò)調(diào)肝方是通過(guò)提高胰島素合成相關(guān)基因的表達(dá)，來(lái)增加胰島素的分泌。見(jiàn)表4。

表4 解毒通絡(luò)調(diào)肝方對(duì)INS-1細(xì)胞中INS1、INS2、PDX1、MafA mRNA表達(dá)的影響

2.5 解毒通絡(luò)調(diào)肝方對(duì)INS-1細(xì)胞PERK、ATF6、IRE1α蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組細(xì)胞中IRE1α、PERK以及ATF-6的蛋白水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示在高糖誘導(dǎo)下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路被異常激活。與模型組相比，不同濃度的解毒通絡(luò)調(diào)肝方組中的IRE1α、ATF6以及PERK的蛋白水平表達(dá)呈劑量依賴性下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)，表明解毒通絡(luò)調(diào)肝方能抑制INS-1細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)，緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。見(jiàn)圖2、表5。

表5 解毒通絡(luò)調(diào)肝方對(duì)INS-1細(xì)胞PERK、ATF6、IRE1α蛋白表達(dá)的影響

注：A：空白組；B：模型組；C：中藥低劑量組；D：中藥中劑量組；E：中藥高劑量組。

3 討論

T2DM發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)，其發(fā)病可影響患者的生活質(zhì)量[14]，其中高血糖是糖尿病的主要臨床表現(xiàn)之一。當(dāng)長(zhǎng)期血糖升高，即發(fā)生葡萄糖毒性，胰島素的合成增加，造成合成與折疊的不平衡，可誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[15]，胰島β細(xì)胞則會(huì)受到不可逆的損傷，啟動(dòng)凋亡程序，造成β細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量減少[16]。胰島β細(xì)胞是機(jī)體唯一可以合成并分泌胰島素的細(xì)胞，促進(jìn)胰島素合成與分泌是增強(qiáng)胰島β細(xì)胞功能的主要作用方式。因此，抑制高糖誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞損傷和胰島素抵抗是防治T2DM的有效途徑之一。

《金匱要略·心典》曰：“毒，邪氣蘊(yùn)結(jié)不解之謂?！碧悄虿僦嗅t(yī)“消渴”范疇，其發(fā)生同樣離不開(kāi)“毒”[17]，消渴患者過(guò)食肥甘厚味，體內(nèi)水谷精微物質(zhì)過(guò)盛產(chǎn)生“糖毒”“脂毒”等?！岸尽迸c“絡(luò)”關(guān)系密切，經(jīng)絡(luò)是毒邪傳變之通道，藏身之府第。《靈樞·本臟》言：“肝脆則善病消癉易傷?！备沃魇栊梗{(diào)暢氣機(jī)，調(diào)節(jié)全身氣血津液的輸布及經(jīng)絡(luò)的調(diào)達(dá)，與糖尿病的發(fā)生也有著密切的關(guān)系[18]。“毒損肝絡(luò)”使氣血逆流，引發(fā)氣血津液的運(yùn)化失常，導(dǎo)致水谷精微生成、輸布和排泄出現(xiàn)障礙，繼而發(fā)生消渴。該理論的生物學(xué)內(nèi)涵不僅包含痰、濕、濁、瘀等“宏觀之毒”，其深層機(jī)制還更應(yīng)側(cè)重于在組織細(xì)胞層面上對(duì)“微觀之毒”的研究。課題組認(rèn)為“微觀之毒”可能與細(xì)胞器損傷及細(xì)胞功能結(jié)構(gòu)紊亂導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、細(xì)胞損傷等密切相關(guān)，基于以上學(xué)說(shuō)，提出的解毒通絡(luò)調(diào)肝法是治療“毒損肝絡(luò)”引起的消渴病的有效治療方法，并創(chuàng)制解毒通絡(luò)調(diào)肝方用于治療T2DM，全方共奏清熱祛濁，化瘀通絡(luò)，解毒調(diào)肝，暢達(dá)氣機(jī)，推陳出新之功，探索“毒邪”理論中“微觀之毒”清除的生物學(xué)內(nèi)涵?，F(xiàn)代藥理研究表明，方中多味藥具有降糖、降脂、減脂、抗炎的功效[19-20]。以上皆為運(yùn)用解毒通絡(luò)調(diào)肝方從“毒損肝絡(luò)”角度來(lái)論治糖尿病提供了理論依據(jù)。

解毒通絡(luò)調(diào)肝方出自“毒損絡(luò)脈”理論，是臨床治療T2DM的有效方劑，但解毒通絡(luò)調(diào)肝方對(duì)胰島β細(xì)胞功能的保護(hù)作用機(jī)制尚未闡明。胰島受損會(huì)導(dǎo)致胰島細(xì)胞的功能紊亂，從而影響胰島素的正常分泌。PDX1促進(jìn)胚胎期胰芽形成，MafA促進(jìn)β細(xì)胞最終成熟，對(duì)胰島的發(fā)育有著重要的影響[21]。INS1、INS2 基因編碼前胰島素原，與體內(nèi)胰島素的濃度密切相關(guān)[22]。本研究通過(guò)檢測(cè)與胰島細(xì)胞功能相關(guān)的關(guān)鍵基因(PDX1、MafA、INS1、INS2)的mRNA的表達(dá)水平和GSIS實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，高糖可以抑制胰島素的分泌，而解毒通絡(luò)調(diào)肝方能夠有效的提高胰島素的分泌量，進(jìn)而能夠改善高糖誘導(dǎo)的β細(xì)胞功能。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激則是細(xì)胞正常生理狀態(tài)及病理狀態(tài)下常會(huì)遭遇到的重要負(fù)性事件，已被廣泛認(rèn)為是誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的重要內(nèi)源性信號(hào)途徑之一[23]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激一方面可減少細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)、前胰島素生物合成加工的速度，降低胰島素的合成與分泌能力；另一方面可抑制β細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡直接減少β細(xì)胞的數(shù)量，最終導(dǎo)致機(jī)體胰島素分泌不足[24]。本研究表明，高糖環(huán)境能夠激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的蛋白質(zhì)(IRE1α、ATF6、PERK)過(guò)度表達(dá)，引起INS-1細(xì)胞的凋亡和功能紊亂，而解毒通絡(luò)調(diào)肝方能夠使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平下調(diào)，并與模型組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說(shuō)明解毒通絡(luò)調(diào)肝方能夠抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的過(guò)度激活，進(jìn)而促進(jìn)INS-1細(xì)胞的存活。

綜上，解毒通絡(luò)調(diào)肝方是通過(guò)調(diào)節(jié)肝之疏泄，疏通氣血經(jīng)絡(luò)，排除“糖毒”，使臟腑功能平衡以治療T2DM，且其作用機(jī)制是提高胰島素合成相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)INS-1細(xì)胞的胰島素分泌，降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，以恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡，減少糖毒性對(duì)β細(xì)胞損傷。為深入了解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與糖脂代謝紊亂的機(jī)制關(guān)聯(lián)提供了新的線索，從而使該途徑成為T2DM的潛在治療靶標(biāo)，為防治T2DM的有效途徑和策略提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，至于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的具體相關(guān)信號(hào)通路有待后續(xù)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。