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    基于氧化應(yīng)激探討毓麟珠調(diào)控TSC/Akt通路改善免疫性POI小鼠卵巢功能的機(jī)制研究

    2021-12-24 02:11:26魏茂林楊珍董曉英馮遜遜
    環(huán)球中醫(yī)藥 2021年12期
    關(guān)鍵詞:免疫性造模低劑量

    魏茂林 楊珍 董曉英 馮遜遜

    早發(fā)性卵巢功能不全(primary ovarian insufficiency,POI)是一種嚴(yán)重的內(nèi)分泌和生殖系統(tǒng)功能紊亂疾病,是介于卵巢儲(chǔ)備功能下降和卵巢早衰之間的一種卵巢低反應(yīng)狀態(tài),主要表現(xiàn)為卵巢內(nèi)卵泡池減少和卵泡功能障礙[1]。POI的發(fā)病率逐年升高,嚴(yán)重影響了女性的生殖健康。

    研究表明,POI的發(fā)生與卵巢微環(huán)境密切相關(guān)[2]。蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)蛋白可以抑制卵巢氧化應(yīng)激的發(fā)生,改善卵巢微環(huán)境,對(duì)卵泡發(fā)育有一定的積極作用[3]。Akt通過(guò)多種機(jī)制被激活,活化磷酸化Akt通過(guò)抑制結(jié)節(jié)性硬化癥(tuberous sclerosis complex,TSC)復(fù)合物TSC1和TSC2,直接或者間接地激活哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammlian target of rapamycin,mTOR)通路[4]。前期研究表明,毓麟珠可以通過(guò)激活mTOR信號(hào)通路,調(diào)整通路中S6K和4E-BPl等相關(guān)蛋白的表達(dá),對(duì)免疫性POI模型小鼠卵泡發(fā)育有積極影響[5]。在此基礎(chǔ)上,本研究觀察中藥毓麟珠對(duì)免疫性POI小鼠卵巢組織氧化應(yīng)激狀態(tài)、卵巢組織病理形態(tài)以及TSC1、TSC2、Akt和mTOR下游相關(guān)蛋白等表達(dá)的影響,探討其治療免疫性POI的機(jī)制機(jī)理。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    選定84只6~8周齡動(dòng)情周期正常的SPF級(jí)BALB/c雌性小鼠,體質(zhì)量18~22 g。該批動(dòng)物由北京維通利華公司提供,批號(hào)為SCXK(京)2012-0001。實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審批,批號(hào):AEEI-2015-028。

    1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

    1.2.1 造模試劑 用高精度電子秤稱取6 mg ZP3透明帶多肽粉末[根據(jù)小鼠透明帶3(ZP3)330-342個(gè)氨基酸序列(NAAAAQFQIHGPR)合成,加入6 mL蒸餾水,溶解混勻,制成透明帶多肽溶液],其中一半與等量的弗氏完全佐劑混勻作為免疫制劑,另一半與等量的弗氏不完全佐劑混勻作為免疫增強(qiáng)劑。透明帶多肽粉末購(gòu)自杭州中肽生化有限公司(批號(hào):CR-10-0068Z),弗氏完全佐劑(批號(hào):F5881)、弗氏不完全佐劑(批號(hào):F5506)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

    1.2.2 中藥 毓麟珠藥物組成:當(dāng)歸、熟地黃、菟絲子各12 g,人參、麩炒白術(shù)、茯苓、白芍、杜仲、鹿角霜、川椒各6 g,川芎、炙甘草各3 g。中藥飲片均由北京同仁堂有限公司提供。劑型為水煎劑,小鼠給藥劑量根據(jù)“人與動(dòng)物體表面積比例”配置高、中、低劑量藥液[6],分別為每mL含生藥量0.234 g、0.468 g、0.936 g。藥物煎出后,4℃保存。

    1.2.3 陽(yáng)性對(duì)照藥 戊酸雌二醇片(德國(guó)拜耳公司,批號(hào):219A2)。小鼠給藥劑量參照“人與動(dòng)物體表面積比例”[6]使用去離子水配置藥液,給藥量為9 mg/mL。

    1.2.4 主要試劑 蘇木素染液(北京中科萬(wàn)邦生物科技有限公司,批號(hào):517-28-2);伊紅染液(北京中科萬(wàn)邦生物科技有限公司,批號(hào):17372-87-1);二甲苯(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào):1330-20-7);EDTA抗原修復(fù)液(北京中科萬(wàn)邦生物科技有限公司);牛血清白蛋白V(Solarbio,批號(hào):A8020);DAB顯色劑(北京中科萬(wàn)邦生物科技有限公司);羊抗兔IgG(H+L),HRP(Jackson,批號(hào):111-035-003);羊抗鼠IgG(H+L),HRP(Jackson,批號(hào):115-035-003);BCA蛋白定量試劑盒(Cwbiotech,批號(hào):02912E);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa,批號(hào):RR036A);熒光定量PCR試劑(Roche,批號(hào):04887352001)。

    1.3 造模、給藥及取材

    1.3.1 動(dòng)物造模 通過(guò)陰道涂片挑選出動(dòng)情周期正常的雌性小鼠84只,隨機(jī)選擇其中14只作為空白組,其余70只用于建立POI模型。造模小鼠于腹部皮下多點(diǎn)注射ZP3多肽免疫制劑(0.15 mL),兩周后皮下多點(diǎn)注射ZP3多肽免疫增強(qiáng)劑(0.15 mL)[7];空白組小鼠于相同時(shí)間點(diǎn)皮下注射等量生理鹽水。

    1.3.2 分組給藥 造模結(jié)束后,通過(guò)陰道涂片觀察,動(dòng)情周期紊亂則造模成功。將造模成功的70只小鼠隨機(jī)分為模型組,陽(yáng)性藥組,毓麟珠高、中、低劑量組,每組14只。除空白組和模型組給予生理鹽水灌胃外,其余各組給予相應(yīng)藥物灌胃。每只小鼠灌胃0.5 mL,每周給藥6天,每天1次,連續(xù)給藥6周。

    1.3.3 取材 干預(yù)結(jié)束后第二天進(jìn)行標(biāo)本取材。心臟穿刺取血;取兩側(cè)卵巢以及子宮并稱重,其中一側(cè)卵巢放入液氮中,-80℃保存;另一側(cè)放入4%多聚甲醛中固定,待用。

    1.4 檢測(cè)指標(biāo)

    1.4.1 小鼠卵巢組織形態(tài) 取出在多聚甲醛中固定的小鼠卵巢,進(jìn)行脫水、透明處理、浸蠟包埋、切片、蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin staining,HE)染色、封片,顯微鏡下觀察。

    1.4.2 小鼠卵巢組織中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、活性氧(reactive oxygen species,ROS)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)的測(cè)定 每組隨機(jī)挑選出6個(gè)在-80℃冰箱中保存的小鼠卵巢組織,梯度復(fù)溫切碎,加入蛋白裂解液后研磨,13 000 r/分鐘,4℃,離心20分鐘后取上清,蛋白質(zhì)定量法測(cè)定總蛋白濃度,在酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值,繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)描述的蛋白濃度和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各指標(biāo)的值。

    1.4.3 小鼠卵巢組織中TSC1、TSC2、Akt蛋白表達(dá) 以免疫組化法檢測(cè)。每組隨機(jī)取出6個(gè)固定在多聚甲醛中的卵巢,用不同濃度的酒精梯度脫水,EDTA修復(fù)液修復(fù),3%雙氧水以及牛血清白蛋白常溫孵育,一抗二抗處理后,加入顯色劑顯色,復(fù)染,梯度酒精脫水,透明處理,中性樹(shù)膠封片,顯微鏡下觀察。

    1.4.4 小鼠卵巢組織中RheB、P-4E-BP1、P-sbk1相關(guān)蛋白表達(dá) 以蛋白免疫印記法檢測(cè)。每組隨機(jī)取出6個(gè)保存在-80℃的卵巢,梯度復(fù)溫切碎,加入裂解液,勻漿取上清,利用蛋白質(zhì)定量法測(cè)定蛋白濃度,根據(jù)蛋白分子量制膠,加入樣品以及Marker,進(jìn)行電泳。依次轉(zhuǎn)膜、封閉,加入一抗、二抗孵育、洗膜,加入發(fā)光液、曝光、顯影、定影,最后觀察條帶狀況。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    2 結(jié)果

    2.1 毓麟珠對(duì)免疫性POI小鼠陰道分泌物的影響

    空白組小鼠陰道涂片顯示每隔4~5天小鼠會(huì)出現(xiàn)明顯的動(dòng)情周期,動(dòng)情期間陰道涂片所見(jiàn)以不規(guī)則、無(wú)細(xì)胞核呈落葉狀細(xì)胞為主,為典型的無(wú)核角化上皮細(xì)胞。模型組小鼠陰道涂片顯示小鼠動(dòng)情周期紊亂,表現(xiàn)為以有核的白細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞為主。各給藥組小鼠在給藥過(guò)程中動(dòng)情周期逐漸恢復(fù),漸至穩(wěn)定。

    2.2 毓麟珠對(duì)免疫性POI小鼠卵巢及子宮質(zhì)量的影響

    與空白組相比,造模成功后模型組小鼠卵巢以及子宮質(zhì)量均明顯降低(P<0.05)。給藥6周后,雌激素組、毓麟珠各劑量組小鼠卵巢及子宮質(zhì)量均增加,其中毓麟珠高劑量組增加最明顯(P<0.01),毓麟珠中劑量組及雌激素組次之(P<0.05),毓麟珠低劑量組僅有上升趨勢(shì),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

    表1 各組免疫性POI小鼠卵巢及子宮質(zhì)量比較

    2.3 毓麟珠對(duì)免疫性POI小鼠卵巢組織形態(tài)的影響

    HE染色結(jié)果顯示:與空白組比較,模型組小鼠卵泡數(shù)量明顯減少,卵母細(xì)胞部分透明帶縮小,顆粒細(xì)胞排列紊亂,卵母細(xì)胞形態(tài)不規(guī)整或者縮小。與模型組比較,各給藥組小鼠卵泡數(shù)量增加,卵細(xì)胞形態(tài)更加規(guī)整,顆粒細(xì)胞排列整齊,其中毓麟珠高劑量組改善最明顯。見(jiàn)圖1。

    2.4 毓麟珠對(duì)免疫性POI小鼠卵巢組織ROS、GSH-Px、SOD、MDA表達(dá)水平的影響

    造模成功后,模型組氧化因子ROS、MDA明顯升高,抗氧化因子GSH-Px、SOD明顯降低(P<0.05);給藥6周后,雌激素組、毓麟珠各劑量組氧化因子ROS、MDA明顯升高,抗氧化因子GSH-Px、SOD明顯降低,其中雌激素組效果最為明顯(P<0.01),毓麟珠高、中、低劑量組效果稍次,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

    表2 各組免疫性POI小鼠卵巢組織中ROS、MDA、GSH-Px、SOD表達(dá)水平比較

    2.5 毓麟珠對(duì)免疫性POI小鼠卵巢組織Akt蛋白表達(dá)的影響

    免疫組化結(jié)果顯示,Akt蛋白主要分布在卵母細(xì)胞的顆粒細(xì)胞中。造模后,模型組陽(yáng)性顆粒明顯較少,著色淺,表達(dá)不明顯;各給藥組陽(yáng)性顆粒表達(dá)明顯較多,著色深,表達(dá)明顯;在毓麟珠高、中、低劑量組中陽(yáng)性顆粒的表達(dá)具有明顯的劑量依賴性。見(jiàn)圖2。

    注:A 空白組;B 模型組;C 雌激素組;D 毓麟珠高劑量組;E 毓麟珠中劑量組;F 毓麟珠低劑量組。箭頭處為卵泡。

    注:A 空白組;B 模型組;C 雌激素組;D 毓麟珠高劑量組;E 毓麟珠中劑量組;F 毓麟珠低劑量組。

    2.6 毓麟珠對(duì)免疫性POI小鼠卵巢組織TSC1、TSC2蛋白表達(dá)的影響

    TSC1、TSC2蛋白主要分布在卵母細(xì)胞的顆粒細(xì)胞中。造模后,模型組陽(yáng)性顆粒明顯較多,著色深,表達(dá)明顯;各給藥組陽(yáng)性顆粒表達(dá)明顯較多,著色深,表達(dá)明顯。在毓麟珠高、中、低劑量組中,陽(yáng)性顆粒的表達(dá)與劑量呈負(fù)相關(guān)。見(jiàn)圖3、圖4。

    2.7 毓麟珠對(duì)免疫性POI小鼠卵巢組織RheB、P-s6k1、P-4E-BP1蛋白表達(dá)的影響

    造模后,模型組RheB、P-s6k1、P-4E-BP1蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05,P<0.01);給藥后,各給藥組RheB、P-s6k1、P-4E-BP1蛋白表達(dá)均明顯升高,改善較明顯的是P-4E-BP1蛋白(P<0.01),而RheB、P-s6k1僅有升高趨勢(shì),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);其中毓麟珠高劑量組對(duì)RheB、P-s6k1、P-4E-BP1蛋白表達(dá)改善最明顯。見(jiàn)表3,圖5。

    表3 各組免疫性POI小鼠卵巢組織RheB、P-sbk1、P-4E-BP1蛋白表達(dá)水平比較

    3 討論

    研究表明,POI的發(fā)生與氧化應(yīng)激密切相關(guān)。體內(nèi)氧化與抗氧化狀態(tài)失衡,卵巢內(nèi)部微環(huán)境改變,氧化應(yīng)激增加[8]。而過(guò)多的氧自由基(H2O2)可以誘導(dǎo)PI3K表達(dá)的下降[9-10],PI3K通過(guò)磷酸化激活絲氨酸—蘇氨酸激酶Akt[11],Akt通過(guò)磷酸化TSC2來(lái)抑制TSC2的活性。TSC復(fù)合物(TSC1/2)是一種抑癌基因,由三個(gè)核心亞基(TSC1、TSC2和TBC1D7)組成,是Rheb的主要上游調(diào)節(jié)因子,其中TSC2可以促進(jìn)Rheb的泛素化,將Rheb從活躍形式轉(zhuǎn)化為不活躍的形式,進(jìn)而抑制mTORC1的活性[12]。P-s6k1、P-4E-BP1處于mTOR的下游,受其調(diào)控,在調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞的mRNA轉(zhuǎn)錄及翻譯方面起著重要作用[5]。

    注:A 空白組;B 模型組;C 雌激素組;D 毓麟珠高劑量組;E 毓麟珠中劑量組;F 毓麟珠低劑量組。

    注:A 空白組;B 模型組;C 雌激素組;D 毓麟珠高劑量組;E 毓麟珠中劑量組;F 毓麟珠低劑量組。

    注:1 空白組;2 模型組;3 雌激素組;4 毓麟珠高劑量組;5 毓麟珠中劑量組;6 毓麟珠低劑量組。

    毓麟珠出自《景岳全書(shū)·婦人規(guī)》,由八珍湯加菟絲子、杜仲、鹿角霜、川椒化裁而來(lái)。該方主治脾腎陽(yáng)虛導(dǎo)致的不孕,方中四君子湯健脾益氣,使氣血化生有源;四物湯活血為主,養(yǎng)血為輔,使全方補(bǔ)而不滯;菟絲子、鹿角霜、杜仲、花椒溫肝腎,填精血,調(diào)沖任,補(bǔ)命門。全方溫補(bǔ)先天腎氣以生精,培補(bǔ)后天脾胃以補(bǔ)血,佐以活血調(diào)經(jīng)補(bǔ)沖任,既注意腎中陰陽(yáng)的平衡,又注意用藥的動(dòng)靜結(jié)合,使精氣充盛,沖任通暢,進(jìn)而恢復(fù)生育功能。臨床研究表明,毓麟珠加減能很好地改善脾腎陽(yáng)虛型卵巢早衰患者的中醫(yī)癥狀,并且降低血清促卵泡生成素、促黃體生成素的水平,并升高雌激素的水平[13]。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明毓麟珠能促進(jìn)小鼠卵細(xì)胞成熟,改善卵細(xì)胞質(zhì)量[14]。進(jìn)一步研究表明毓麟珠可以通過(guò)改善卵母細(xì)胞線粒體功能,進(jìn)而改善卵母細(xì)胞質(zhì)量與卵巢功能[15]。

    本研究發(fā)現(xiàn)造模后小鼠動(dòng)情周期紊亂,同時(shí)卵巢、子宮質(zhì)量下降,卵泡數(shù)量減少,表現(xiàn)出模型的陽(yáng)性改變,影響到了小鼠的生殖功能。模型組小鼠卵巢組織ROS、MDA水平相較于空白組明顯升高,GSH-Px、SOD水平相較于空白組降低,說(shuō)明小鼠卵巢處于氧化應(yīng)激狀態(tài);在給予中藥毓麟珠6周之后,模型組小鼠ROS、MDA水平降低,GSH-Px、SOD水平升高,說(shuō)明毓麟珠可以降低小鼠體內(nèi)活性氧分子水平,同時(shí)提升相關(guān)抗氧化酶活性,抑制氧化應(yīng)激狀態(tài)。相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究表明毓麟珠中的多味中藥如熟地、當(dāng)歸、川芎等均能提高體內(nèi)過(guò)氧化物歧化酶活性,清除體內(nèi)自由基[16],毓麟珠的抗氧化活性可能與此相關(guān)。PI3K/Akt信號(hào)通路是卵母細(xì)胞內(nèi)與氧化應(yīng)激以及卵泡發(fā)育密切相關(guān)的信號(hào)通路[17],其影響卵泡發(fā)育的原因可能與TSC1/2的磷酸化密切相關(guān)。給予藥物治療后,Akt蛋白表達(dá)明顯升高,抑制氧化應(yīng)激的發(fā)生,Akt表達(dá)的升高會(huì)促進(jìn)TSC2與TSC1分離,結(jié)節(jié)性硬化癥復(fù)合物(TSC1/2)是抑制mTORC1的主要物質(zhì),兩者解離則解除對(duì)mTORC1的抑制,激活mTORC1[18],從而使得mTOR信號(hào)通路活化。mTOR信號(hào)通路下游的P-s6k1、P-4E-BP1蛋白表達(dá)升高,進(jìn)而激活細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程,促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育[19]。本研究結(jié)果進(jìn)一步分析了Akt/TSC信號(hào)通路抑制氧化應(yīng)激改善卵母細(xì)胞質(zhì)量可能與其直接或者間接激活了mTOR信號(hào)通路密切相關(guān)。

    綜上所述,毓麟珠通過(guò)調(diào)控TSC/Akt信號(hào)通路抑制氧化應(yīng)激的發(fā)生,可能是減少卵母細(xì)胞以及卵泡損傷,改善卵巢微環(huán)境的重要機(jī)制。接下來(lái)的研究將進(jìn)一步探究毓麟珠治療POI的靶標(biāo),并探究毓麟珠在治療POI過(guò)程中發(fā)揮主要作用的有效成份,為臨床中更加精確、有效治療POI提供依據(jù)。

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