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    小鼠肝炎病毒感染對(duì)shh等基因改造小鼠生殖性能的影響及其相應(yīng)凈化方案

    2021-12-24 12:10:38關(guān)升起
    科教導(dǎo)刊·電子版 2021年31期
    關(guān)鍵詞:雌鼠體外受精產(chǎn)仔數(shù)

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    (蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 江蘇·蘇州 215123)

    小鼠肝炎病毒(Mousehepatitisvirus,MHV)屬于冠狀病毒科,冠狀病毒屬,為單股RNA病毒,是已知冠狀病毒中體積最大的一個(gè)。其病毒粒子呈球形,外有囊膜,外包膜突起呈放射狀排列。根據(jù)不同的感染嗜性,小鼠常可分為呼吸株和嗜腸株兩型,其中,嗜腸株極少擴(kuò)散至其他組織,而呼吸株可在肝臟與神經(jīng)系統(tǒng)中復(fù)制。多數(shù)情況下,MHV呈隱性感染,但在應(yīng)激因素刺激下,可引發(fā)嚴(yán)重肝炎及神經(jīng)癥狀,并發(fā)展成為急性致死性疾病[1]。

    目前,國(guó)內(nèi)外均鮮見(jiàn)關(guān)于MHV感染影響生殖系統(tǒng)功能的報(bào)道,但經(jīng)過(guò)連續(xù)8年對(duì)蘇州大學(xué)外來(lái)隔離檢疫及委托人工輔助生殖小鼠的情況進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)MHV感染顯著影響部分基因改造小鼠的生殖系統(tǒng)功能。由于MHV可通過(guò)胎盤(pán)將病毒從母體向胎鼠垂直傳播,本研究利用小鼠受精3.5天前胚胎外層完整的透明帶的屏障作用,對(duì)患病小鼠采用體外受精+胚胎移植的方法進(jìn)行凈化。結(jié)果表明,凈化得到的小鼠,其生殖系統(tǒng)功能可恢復(fù)至與同背景野生型的平均水平。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    委托我中心進(jìn)行隔離檢疫及凈化保種的基因修飾實(shí)驗(yàn)小鼠;購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司的ICR雄鼠、C57BL/6J供卵小鼠、ICR代孕雌鼠。

    1.2 主要試劑

    孕馬血清促性腺激素(PMSG)和絨毛膜促性腺激素(HCG)購(gòu)自寧波三生;自配輸卵管液培養(yǎng)試劑(HTF);Mouse hepatitis virus (MHV)Elisa kit試劑盒購(gòu)自XpressBio公司。

    1.3 主要儀器

    二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo)、體視顯微鏡(OLYMPUS)、倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS)、相位差顯微鏡(Leica)、生物顯微鏡溫控儀(南京凱爾)、冰箱(海爾)、精密電子天平(上海舜宇)。

    1.4 方法

    1.4.1 結(jié)扎雄鼠

    ICR雄鼠按照0.6mL/20g體重的劑量腹腔注射1.2%三溴乙醇進(jìn)行麻醉。待小鼠進(jìn)入深度麻醉狀態(tài),固定四肢,仰臥位腹部剃毛,在小鼠雙股近心端高點(diǎn)連線于腹中線兩側(cè)對(duì)稱(chēng)剪開(kāi)1cm切口;找到包裹睪丸的脂肪團(tuán),將脂肪團(tuán)和睪丸一起拉出腹腔;依睪丸位置,找到輸精管,用紅外線加熱器加熱彎口鑷至發(fā)紅,燒灼切斷輸精管;將輸精管、睪丸還納腹腔;依次縫合小鼠的肌層和表皮。將縫合好的小鼠放在待蘇醒籠盒中,籠盒下以溫控儀37℃加熱,等待小鼠復(fù)蘇。小鼠完成結(jié)扎后,單獨(dú)飼養(yǎng)1個(gè)月后方可使用。

    1.4.2 供卵鼠的激素處理

    本實(shí)驗(yàn)采用胚胎發(fā)育的二細(xì)胞期進(jìn)行移植。鑒于二細(xì)胞胚胎移植的實(shí)驗(yàn)周期為5天,本研究選擇在每周的第一天,即周一開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。周一的17:00,選3-5周健康同背景野生型雌鼠,腹腔注射5IUPMSG;周三17:00,對(duì)已注射過(guò)PMSG的雌鼠,腹腔注射5IU HCG。

    1.4.3 精卵體外受精

    (1)周四8:00,取待凈化雄鼠,按照0.6mL/20g體重的劑量腹腔注射1.2%三溴乙醇麻醉;仰臥位腹部剃毛,在小鼠雙股近心端高點(diǎn)連線于腹中線兩側(cè)對(duì)稱(chēng)剪開(kāi)1cm切口;剪下附睪尾,放入裝有300 LHTF試劑的0.5mL EP管中。

    (2)超凈臺(tái)內(nèi)打開(kāi)EP管,取出附睪尾;將附睪尾放置在高壓滅菌過(guò)的濾紙上,吸取附著的液體、血液和脂肪;左手以顯微鑷夾起附睪尾,右手以顯微鑷緊靠左手顯微鑷夾取附睪尾的位置夾緊,左右手交替重復(fù)操作使附睪尾緩緩繃緊;以耳用探針挑破繃緊的附睪尾外壁,使小鼠精子涌出并在附睪尾外壁形成白色突起;更換新的顯微鑷小心夾取突出附睪尾外壁的頂端精子,放入已經(jīng) CO2平衡過(guò)的HTF液滴,將裝有HTF液滴的平皿放入CO2培養(yǎng)箱中溫育,30min后取出,檢查精子質(zhì)量。

    (3)周四8:00,取注射過(guò)PMSG及HCG的供卵雌鼠安樂(lè)死;仰臥位,剪開(kāi)小鼠腹腔,找到小鼠子宮,再沿著子宮找到兩側(cè)的卵巢和輸卵管;在保證輸卵管膨大部完整的情況下,剪下輸卵管,并置于滅菌濾紙上吸干附著于上的血液、脂肪和組織液。

    (4)將輸卵管置于已經(jīng)過(guò)CO2平衡過(guò)的HTF液滴的礦物油保護(hù)層中,剝開(kāi)膨大部,挑出帶有卵丘細(xì)胞的小鼠卵細(xì)胞團(tuán),放入HTF液滴中。

    (5)使用移液器,從檢查過(guò)小鼠精子質(zhì)量的液滴邊緣處,吸取6 L小鼠精子,加入小鼠卵細(xì)胞的HTF液滴中,然后,將載有液滴的平皿放入CO2培養(yǎng)箱中溫育6小時(shí)。

    1.4.4 胚胎移植

    小鼠精子與卵子混合溫育6小時(shí)后,取出載有HTF液滴的平皿,置于顯微鏡下,挑選排出第二極體或形成雄原核的受精卵,以口吸管移入新的HTF液滴,置于CO2培養(yǎng)箱中溫育至次日8:00。

    次日8:00,即周五8:00,從CO2培養(yǎng)箱中取出裝有受精卵的HTF液滴,挑選并計(jì)數(shù)二細(xì)胞數(shù)量。麻醉準(zhǔn)備好的與結(jié)扎雄鼠合籠的見(jiàn)栓假孕雌鼠,側(cè)臥位,暴露并固定卵巢和輸卵管,將發(fā)育至二細(xì)胞的受精卵,經(jīng)輸卵管傘部注入小鼠輸卵管的膨大部。逐層縫合,將小鼠放入置于37℃熱臺(tái)上的小鼠籠盒中,護(hù)理小鼠,直至小鼠蘇醒。

    1.4.5 小鼠肝炎病毒的檢測(cè)及凈化評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)

    凈化得到的F1代小鼠發(fā)育至5周齡時(shí),每胎隨機(jī)選取F1代小鼠1-2只與代孕雌鼠一同使用ELISA法檢測(cè)小鼠肝炎病毒。若檢測(cè)鼠體仍有肝炎病毒存在,則判定凈化結(jié)果為不合格,重新凈化;若鼠體無(wú)肝炎病毒,保留小鼠并擴(kuò)繁,待F2代小鼠發(fā)育至5周齡時(shí),隨機(jī)選取F2代小鼠再次檢測(cè),若仍合格,則認(rèn)為凈化成功。

    2 結(jié)果

    2.1 小鼠肝炎病毒感染整體呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)

    對(duì)2012年至2019年送我中心隔離檢疫小鼠及此期間委托我中心進(jìn)行生物凈化小鼠的鼠肝炎病毒患病情況進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)小鼠肝炎病毒病整體呈現(xiàn)上升趨勢(shì),如圖1(由于疫情影響,2020年送我中心隔離檢疫小鼠與委托凈化小鼠的數(shù)量都大幅減少,故未將2020年的數(shù)據(jù)加入統(tǒng)計(jì))。

    圖1:2012至2019年蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心外源動(dòng)物感染小鼠肝炎病毒與接收凈化情況

    2.2 小鼠肝炎病毒感染導(dǎo)致小鼠精子質(zhì)量的下降

    通過(guò)對(duì)不同小鼠的精子進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)感染小鼠肝炎病毒的基因改造小鼠,其精子受精能力顯著下降,如圖2。其在體外受精6h時(shí)排出第二極體與形成雄原核(圖2B、2E)的數(shù)量明顯少于相同背景健康的 C57BL/6J野生型(WT)小鼠(圖2A,1號(hào)為第二極體排出階段,2號(hào)為雄原核形成階段),在體外受精24h時(shí)二細(xì)胞(圖2D、2F)占比也明顯少于相同背景健康的C57BL/6J野生型(WT)小鼠(圖2C)。

    圖2:患病基因改造小鼠精子的精卵結(jié)合率情況

    2.3 小鼠肝炎病毒感染導(dǎo)致小鼠繁殖周期延長(zhǎng)

    通過(guò)對(duì)凈化前后小鼠的繁殖周期進(jìn)行對(duì)比,發(fā)現(xiàn)感染小鼠肝炎病毒的小鼠,其繁殖周期明顯延長(zhǎng);而凈化后的小鼠,其繁殖周期可恢復(fù)至同環(huán)境同背景的健康C57BL/6J野生型小鼠(WT)水平,如圖3。

    圖3:小鼠凈化前后繁殖周期對(duì)比

    2.4 小鼠肝炎病毒感染導(dǎo)致小鼠每胎產(chǎn)仔數(shù)減少

    通過(guò)對(duì)凈化前后小鼠的每胎產(chǎn)仔數(shù)進(jìn)行對(duì)比,發(fā)現(xiàn)感染小鼠肝炎病毒的小鼠,其每胎產(chǎn)仔數(shù)明顯減少;而凈化后的小鼠,其每胎產(chǎn)仔數(shù)可恢復(fù)至同背景的健康C57BL/6J野生型小鼠(WT)水平,如圖4。

    圖4:小鼠凈化前后每胎產(chǎn)仔數(shù)對(duì)比

    2.5 小鼠肝炎病毒感染導(dǎo)致小鼠的每胎離乳數(shù)減少

    通過(guò)對(duì)凈化前后小鼠的每胎離乳數(shù)進(jìn)行對(duì)比,發(fā)現(xiàn)感染小鼠肝炎病毒的小鼠,其每胎離乳數(shù)明顯降低;而凈化后的小鼠,其每胎離乳數(shù)可恢復(fù)至同背景的健康C57BL/6J野生型小鼠(WT)水平,如圖5。

    圖5:小鼠凈化前后每胎離乳數(shù)對(duì)比

    3 討論

    根據(jù)以往的報(bào)道,小鼠肝炎病毒(MHV)可引起腦膜腦炎、脊髓炎、肝炎、視神經(jīng)炎,可引發(fā)視神經(jīng)軸突丟失和脫髓鞘[3,4]。目前,此病毒常分為呼吸株(respiratory MHV strain)和嗜腸株(enterotropicMHVstrain)。呼吸株 MHV,即,MHV-1、MHV-2、MHV-3、MHV-JHM(MHV-4)、MHVA59,和MHV-S毒株,最初在鼻呼吸和嗅覺(jué)上皮中復(fù)制,隨后可傳播至肺、肝、骨髓、腦、淋巴組織和生殖系統(tǒng)器官,并在其中復(fù)制。嗜腸株,即MHV-D、MHV-DVIM、MHVY,和MHV-RI毒株,主要感染腸道,偶爾可擴(kuò)散到肝臟,淋巴組織和脾臟[5,6]。呼吸株和嗜腸株的小鼠肝炎病毒在多數(shù)情況下均呈隱性感染;少數(shù)情況下,MHV在應(yīng)激因素刺激也可導(dǎo)致急性致死性疾病,在臨床上通??煞譃榧毙愿窝仔秃蜕窠?jīng)型。

    目前,雖然有MHV可感染生殖細(xì)胞的報(bào)道,但有關(guān)小鼠肝炎病毒影響小鼠生殖繁育能力的報(bào)道尚鮮有見(jiàn)到。

    本研究根據(jù)連續(xù)8年對(duì) MHV單一感染小鼠進(jìn)行比較,分析發(fā)現(xiàn)MHV很可能也會(huì)對(duì)某些基因改造小鼠的繁殖性能產(chǎn)生顯著影響。如:相比于同背景健康C57BL/6J野生型小鼠(WT)繁殖周期的66.09±18.39天,MHV感染后的基因改造小鼠的繁殖周期延長(zhǎng)至110.78±23.97天。而相比于同背景健康C57BL/6J野生型小鼠(WT)平均每胎產(chǎn)仔5.45±1.29只,MHV感染后的基因改造小鼠的每胎產(chǎn)仔數(shù)僅為2.00±1.20只。

    導(dǎo)致患病小鼠繁殖周期延長(zhǎng)的原因,可能是此株MHV入侵神經(jīng)系統(tǒng)使雄鼠性欲降低(這種推測(cè)通過(guò)小鼠合籠后雌鼠的陰道栓和陰道涂片進(jìn)行分析,但目前此部分的數(shù)據(jù)并不完整,無(wú)法進(jìn)行分析)。而導(dǎo)致患病小鼠平均每胎產(chǎn)仔數(shù)下降的原因,很可能是由于此株MHV感染降低了雄性小鼠的精子質(zhì)量。研究通過(guò)對(duì)比 WT小鼠與患病小鼠精子體外受精6小時(shí)有效受精卵占比和體外受精24小時(shí)二細(xì)胞占比,發(fā)現(xiàn)患病小鼠6小時(shí)有效受精卵占比和體外受精24小時(shí)二細(xì)胞占比,均明顯(平均百分比分別為 36.48±12.53%和 21.02±9.57%)低于 WT 小鼠的66.94±11.91%和59.08±7.32%。這說(shuō)明,至少在精子的體外受精能力方面,患病雄性小鼠已經(jīng)出現(xiàn)了顯著的下降。

    至于同背景健康C57BL/6J野生型小鼠(WT)平均每胎離乳小鼠4.73±1.49只,患病小鼠的平均每胎離乳數(shù)僅為1.09±1.57只(個(gè)體差異巨大導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)差大于平均值)的情況,則很可能是MHV對(duì)哺乳期仔鼠的致死作用所導(dǎo)致的。

    同時(shí),研究也發(fā)現(xiàn),以體外受精+胚胎移植的方式對(duì)患病小鼠進(jìn)行凈化是有效的。根據(jù)比較凈化前后的基因改造小鼠的繁殖能力,發(fā)現(xiàn)凈化后的小鼠,其平均繁殖周期可由患病中的110.78±23.97天縮短至65.89±23.33天,平均每胎胎產(chǎn)仔數(shù)可由患病中的 2.00±1.20只提高至5.24±1.56只,平均離乳數(shù)可由患病中的1.09±1.57只提高至 5.08±1.41只。

    綜上,雖然MHV對(duì)生殖系統(tǒng)的具體致病機(jī)理尚不清楚,但研究發(fā)現(xiàn),其對(duì)小鼠精子受精率的阻礙作用是顯著的。這可能意味著MHV出現(xiàn)了新的病毒株,也可能意味著已發(fā)現(xiàn)的MHV毒株,在感染部分基因改造小鼠后,可使其產(chǎn)生顯著的生殖功能抑制。

    下一步研究,將對(duì)致生殖能力下降的病毒株進(jìn)行完整測(cè)序,以判斷其是否發(fā)生了變異,并加強(qiáng)MHV對(duì)更多不同實(shí)驗(yàn)小鼠的研究。

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