高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定茶葉中赤霉素的研究

鄧六愛，劉 峰，張念英，郭 冰，禚歡歡

（日照市市場監(jiān)管檢驗檢測中心，山東 日照 276800）

生長調(diào)節(jié)劑是一類能對植物生長起調(diào)節(jié)作用的活性物質(zhì)[1]。赤霉素是較常見的一種植物生長調(diào)節(jié)劑，在植物生長和發(fā)育中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[2]。茶樹是一種以收獲幼嫩葉芽為主的多年生經(jīng)濟作物，茶樹春梢萌動越早，春茶生產(chǎn)時段越長，產(chǎn)生的經(jīng)濟效益就越大。赤霉素可以打破嫩芽冬眠，促進(jìn)新梢萌發(fā)及嫩芽生長，提高茶葉產(chǎn)量[3-4]。目前，茶園中廣泛使用赤霉素，盡管赤霉素毒性不大，但長期大量不合理使用也會在人體器官中蓄積，造成慢性中毒[5]。歐盟規(guī)定赤霉素的最高殘留限量值（MRL）為5 mg/kg。我國目前尚未制定茶葉中赤霉素的最大殘留限量[6-10]。

目前國內(nèi)外檢測赤霉素的方法有毛細(xì)管氣相色譜法[11]、高效液相色譜法[12-13]、氣質(zhì)聯(lián)用法、酶聯(lián)免疫法[14]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[15-17]等。有些前處理較為繁瑣，有些方法靈敏度低，存在操作復(fù)雜、環(huán)境不友好等缺點。但是，對茶葉中赤霉素檢測方法未見相關(guān)文獻(xiàn)報道。試驗建立了超高壓液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜分析茶葉中赤霉素含量的檢測方法，操作簡單快速、可靠準(zhǔn)確，為開展茶葉中赤霉素的安全性研究提供了參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

QTrap4500型高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國SCIEX公司產(chǎn)品；3-18KS型高速冷凍離心機，德國SIGMA公司產(chǎn)品；EVAP-45型水浴氮氣吹干儀，美國Organomation公司產(chǎn)品；KQ-500DE型數(shù)控超聲清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；IKA MS3 basic型高速均質(zhì)儀，德國IKA公司產(chǎn)品；XPE205型分析天平（梅特勒感量0.01 mg）；ME1002E型分析天平（梅特勒感量0.01 g）。

標(biāo)準(zhǔn)品：赤霉素（純度97.9%），德國Dr.Ehrenstorfer公司提供；甲醇（色譜純，CNW）、乙腈（色譜純，CNW）、甲酸（色譜純，CNW）、HC-C18、PSA，GCB，其他試劑為分析純；所有試驗用水為一級水。

1.2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

色譜柱：Xbridge C18柱，2.1 mm×150 mm，3.5 μm；流速0.20 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫40℃。

流動相：梯度洗脫；5 mmol/L乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）（A）和乙腈（B），梯度洗脫程序：0min，A為95%，B為5%；2min，A為95%，B為5%；2.1min，A為90%，B為10%；8.0min，A為20%，B為80%；10.0min，A為20%，B為80%；10.1min，A為95%，B為5%；12min，A為95%，B為5%。

質(zhì)譜條件：電噴霧ESI離子源，離子源溫度550℃；采用負(fù)離子（ESI-）采集模式，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）方法測定；離子噴霧電壓4.5 kV；霧化氣、氣簾氣、碰撞氣均為高純氮氣，使用前調(diào)節(jié)各氣體流量，以使質(zhì)譜靈敏度達(dá)到檢測要求。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理

準(zhǔn)確稱量赤霉素標(biāo)準(zhǔn)品25 mg于25 mL容量瓶中，用色譜純甲醇溶解，定容至25 mL，配制成1 000 μg/mL的赤霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于-20℃的冰箱中保存。再以甲醇逐級稀釋成100.0，10.0，1.0 μg/mL的赤霉素標(biāo)準(zhǔn)中間液。取適量的赤霉素標(biāo)準(zhǔn)中間液，以0.1%甲酸乙腈（1∶1）溶液為稀釋溶劑配制成10，20，50，100，200 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。取空白樣品，經(jīng)1.3.1處理至氮吹近干后，加入1.00 mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，制備成基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

準(zhǔn)確稱取10 g經(jīng)粉碎后備茶葉（準(zhǔn)確至0.01 g）試樣于50 mL離心管中，加入20 mL含1%甲酸的乙腈溶液，渦旋2 min，超聲提取15 min，以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心5 min，取上清液轉(zhuǎn)移至離心管中。再分別用10 mL含1%甲酸的乙腈溶液提取2次，合并上清液。上清液中加入4 g無水硫酸鎂和1 g無水乙酸鈉，立即渦旋混合1 min，以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心5 min。

精密量取上層乙腈溶液8 mL置于15 mL離心管中（含400 mg無水硫酸鎂和120 mg HC-C18），渦旋2 min，以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心5 min。取上清液于15 mL試管中，于45℃水浴中氮吹至近干，以1.00 mL甲酸-乙腈（1∶1）定容。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理方法優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的選擇

由于赤霉素難溶于水，參考文獻(xiàn)表明采用甲醇和乙腈作為提取溶劑時，甲醇提取效果及回收率不理想，乙腈提取效果明顯提高。因此，優(yōu)先考慮使用乙腈作為提取溶劑。根據(jù)赤霉素的分子結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)，酸化乙腈更有利于赤霉素的提取。試驗分別考查了純乙腈、1.0%甲酸乙腈、1.0%乙酸乙腈3種提取溶劑對赤霉素的提取效果。

結(jié)果表明，采用純乙腈提取回收率低，難以滿足檢測要求。赤霉素中含有羧基，受pH值影響較大，酸性條件能抑制羧基在溶液中電離成離子形態(tài)，保持分子狀態(tài)更有利于提取。采用1.0%的酸化乙腈，鮮葉和干茶中赤霉素的提取效果均有所改善，1.0%的甲酸乙腈效果好于1.0%乙酸乙腈。試驗同時考查乙腈中加入0.1%，0.5%，1.0%甲酸對赤霉素的提取影響。當(dāng)在乙腈中加入1.0%的甲酸，回收率大于90%，明顯優(yōu)于其他2種提取溶劑。因此，試驗最終選用1.0%的甲酸乙腈溶液進(jìn)行鮮葉和干茶中赤霉素的提取。

不同提取溶劑茶葉中赤霉素回收率見表1。

表1 不同提取溶劑茶葉中赤霉素回收率

2.1.2 提取溶劑用量和提取條件的選擇

茶葉基質(zhì)復(fù)雜，提取條件需要使基質(zhì)干擾最小并且能有效提取目標(biāo)物。結(jié)果表明，采用30 mL 1.0%甲酸乙腈溶液提取時，提取溶劑用量不夠，回收率偏低。采用1.0%甲酸乙腈50 mL與1.0%甲酸乙腈溶液40 mL提取，回收率相差不大。乙腈具有一定的毒性，本著有機溶劑用量少、保護(hù)環(huán)境的原則選用1.0%甲酸乙腈溶液40 mL進(jìn)行提取。超聲提取次數(shù)的不同，可能會直接影響目標(biāo)物提取效率。研究表明，1次提取不完全，回收率偏低；2次提取，回收率約至80%以上，基本達(dá)到試驗?zāi)康?。但目?biāo)物添加含量高（100 μg/kg）時回收率降至60%左右，存在提取不完全現(xiàn)象。綜合考慮，采用3次提取，鮮葉和干茶回收率均可提高至95%以上。

不同提取條件茶葉中赤霉素回收率見圖1。

圖1 不同提取條件茶葉中赤霉素回收率

2.1.3 吸附劑的選擇

液液萃取法、QuEChERS法、固相萃取小柱法等是常用凈化的手段[17]。QuEChERS法簡單快速，一般先在提取液中加入一定量的無水硫酸鎂、無水乙酸鈉等去除水分和水溶性雜質(zhì)，促進(jìn)待測物向乙腈溶液中轉(zhuǎn)移。然后加入一定量的分散固相萃取劑，如十八烷基硅烷C18粉、N-丙基乙二胺PSA粉、石墨化碳黑GCB粉，以達(dá)到除雜凈化的作用。

不同吸附凈化劑的作用機理不同，試驗分別考查離子交換劑（PSA）、惰性吸附劑（石墨化炭黑GCB）、廣譜型凈化材料C18這3種常用吸附劑對樣品的凈化效果及回收率的影響。PSA主要作用力是極性相互作用及弱陰離子交換作用，對于脂肪酸、有機酸、有機碳水化合物等極性化合物有較好的吸附作用，因此對帶有羧基結(jié)構(gòu)的赤霉素有很大程度的吸附，明顯影響目標(biāo)物的回收效果。GCB粉作為吸附凈化劑可用于去除色素等干擾物，但同時對待測物也有明顯的吸附作用，回收率進(jìn)一步降低。C18具有強非極性作用，對極性較弱的烯烴類、色素等干擾物有較好的吸附效果。試驗采用C18作為吸附劑回收率及凈化效果明顯較好，試驗還同時比較了C18凈化粉的用量，隨著用量的增加，凈化效果顯著提高。在C18粉用量120 mg時，回收率可達(dá)90%以上，增加至250 mg時，回收率基本變化不大。因此，選擇C18粉120 mg作為試驗的吸附凈化劑。

不同吸附劑茶葉赤霉素回收率見圖2，C18吸附劑用量對赤霉素回收率的影響見圖3。

圖2 不同吸附劑茶葉赤霉素回收率

圖3 C18吸附劑用量對赤霉素回收率的影響

2.1.4 定容溶劑的優(yōu)化

為了提高赤霉素高效液相色譜－質(zhì)譜檢測過程中的靈敏度和色譜峰形，考查了0.1%甲酸乙腈（1∶1）溶液、乙腈、0.1%甲酸水溶液作為定溶溶劑時赤霉素的分離提取效果。結(jié)果表明，0.1%甲酸水溶液不能充分復(fù)溶目標(biāo)物導(dǎo)致回收率偏低；采用乙腈作為定容溶劑時，色譜峰分離效果差；采用0.1%甲酸乙腈（1∶1）溶液定容赤霉素色譜峰能夠有效分離，得到滿意的峰型且回收率較高。因此，試驗選用0.1%甲酸乙腈（1∶1）溶液作為定容溶劑。

2.2 流動相優(yōu)化

流動相對目標(biāo)物的峰形、靈敏度及分離度有較大的影響。試驗初期，采用甲醇和純水作為流動相，響應(yīng)偏低、靈敏度不高、重復(fù)性差，可能是由于赤霉素在水溶液中不穩(wěn)定容易分解有關(guān)。目前，植物生長調(diào)節(jié)劑殘留檢測大多應(yīng)用有機溶劑配合酸類或鹽類物質(zhì)配比作為流動相。把流動相中的純水換成0.1%甲酸水（V/V），響應(yīng)和穩(wěn)定性提高。這是因為赤霉素在酸性條件下穩(wěn)定，流動相中的酸能促進(jìn)增強負(fù)離子模式下的赤霉素分子離子化的結(jié)果。而采用5 mmol/L乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸）和乙腈作為流動相時，流動相的離子強度進(jìn)一步增加，目標(biāo)物質(zhì)響應(yīng)值達(dá)到理想，響應(yīng)值及峰形有明顯改善。

2.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

赤霉素中含有羧基，采用ESI負(fù)離子掃描模式，有利于獲得更好的離子化效率。采0.10 μg/mL的赤霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)真泵注射進(jìn)樣，得到赤霉素準(zhǔn)分子離子峰m/z345.1。以m/z345.1為母離子，通過子離子掃描得到赤霉素子離子主要是m/z239.0和m/z143.0，子離子m/z239.0豐度最大。因此，可以確定質(zhì)譜分析赤霉素時，定量離子對為m/z345.1>239.0，定性離子對為m/z345.1>239.0，m/z345.1>143.0。然后再對錐孔電壓和毛細(xì)管電壓等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，使分子離子和特征碎片離子強度達(dá)到最大，確定最佳質(zhì)譜參數(shù)。按照試驗確定的條件得到赤霉素標(biāo)準(zhǔn)圖譜。

赤霉素標(biāo)品色譜圖（100 ng/mL）見附圖4。

圖4 赤霉素標(biāo)品色譜圖（100 ng/mL）

2.4 工作曲線、線性范圍及檢出限的確認(rèn)

空白基質(zhì)樣品前處理后，配制成質(zhì)量濃度為10.0～800 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)基質(zhì)工作系列，在此范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。實際方法驗證過程以10.0～200 ng/mL范圍的標(biāo)準(zhǔn)基質(zhì)工作溶液為標(biāo)準(zhǔn)系列，以工作液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到赤霉素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限。結(jié)果表明，鮮葉赤霉素在10.0～200 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 8；干茶赤霉素在10.0～200 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 8。采用空白基質(zhì)中添加目標(biāo)組分，前處理后上機，信噪比法確定方法檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。鮮葉中赤霉素的LOD和LOQ為0.99，3.31 μg/kg；干茶中赤霉素的LOD和LOQ為0.26，0.88 μg/kg。

赤霉素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限（LOD）、定量限（LOQ）見表2。

表2 赤霉素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限（LOD）、定量限（LOQ）

2.5 準(zhǔn)確度和重復(fù)性

選用鮮葉與干茶作為空白基質(zhì)，進(jìn)行加標(biāo)回收和精密度試驗。樣品添加量為10，20，100 μg/kg 3個質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)，每種質(zhì)量濃度平行測定6次，鮮葉赤霉素加標(biāo)回收率為80.5%～98.5%，干茶赤霉素加標(biāo)回收率在85.0%～106.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%，方法的回收率和精密度滿足檢測要求。因此，該方法適用于茶葉中赤霉素的測定。

茶葉中赤霉素的加標(biāo)回收率及精密度（n=6）見表3。

表3 茶葉中赤霉素的加標(biāo)回收率及精密度（n=6）

3 結(jié)論

根據(jù)赤霉素化學(xué)性質(zhì)，建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測茶葉中赤霉素的方法。該方法通過對前處理過程和色譜質(zhì)譜條件優(yōu)化，較好地控制了基質(zhì)干擾，靈敏度高，方法的線性關(guān)系、回收率良好，精密度和準(zhǔn)確度較高。采用該方法對從市場上隨機購買的春季綠茶樣品進(jìn)行檢測，含量為0.94～371 μg/kg。適用于茶葉中赤霉素殘留的檢測，具有較高的實際應(yīng)用價值。