HPLC-RID法測定蘋果中果糖山梨醇葡萄糖和蔗糖

阿地拉·阿不都拉，蒲云峰，2，黨艷青

（1.塔里木大學生命科學學院，新疆阿拉爾843300；2.南疆特色農產(chǎn)品深加工兵團重點實驗室，新疆阿拉爾843300；3.塔里木大學植物科學學院，新疆阿拉爾843300）

0 引言

蘋果為薔薇科（Rosacea）蘋果屬（Malus Mill）多年生木本植物，是我國栽培面積最大、產(chǎn)量最高的果樹之一[1]。根據(jù)2020年《中國統(tǒng)計年鑒》和《中國農村統(tǒng)計年鑒》數(shù)據(jù)，截至2019年，我國蘋果總產(chǎn)量為4 242.5萬t，其中陜西、山東、山西、河南、甘肅、遼寧、河北和新疆蘋果產(chǎn)量分別占我國蘋果總產(chǎn)量的26.8%，22.4%，9.9%，9.6%，8.0%，5.8%，5.2%，4.0%。新疆蘋果產(chǎn)量全國排名第八，晝夜溫差大，光照充足，非常適宜蘋果生長，形成了“阿克蘇冰糖心”蘋果這一特色品牌。蘋果已成為新疆林果業(yè)發(fā)展的主要樹種之一，近年來其栽培面積和產(chǎn)量均保持以5%以上增長速率。

糖是蘋果重要風味成分和營養(yǎng)成分，其種類和含量是評價蘋果品質的重要指標，準確測定蘋果中糖的含量對于研究蘋果的品質和貯藏加工具有重要的意義[2]。水果中可溶性糖分的測定方法有化學分析法、分光光度法、氣色相色譜法、高效毛細管電泳法和高效液相色譜法等[3]，其中HPLC法因其具有快速、簡便、準確等優(yōu)點，常用于食品中糖類的檢測[4]。目前，已有大量文獻報道蘋果及其他水果中可溶性糖的測定，如熊仁次等人[5]分析了蘋果中可溶性糖，發(fā)現(xiàn)糖心部位山梨醇含量是非糖心部位的1.4倍。蒲小秋等人[3]采用HPLC-ELSD法測定鮮棗果實中可溶性糖，發(fā)現(xiàn)棗果中主要含有果糖、葡萄糖和蔗糖。然而，近年來文獻對樣品處理的溶劑選擇不夠嚴謹，熊仁次等人[5]和蒲小秋等人[3]處理樣品時溶劑為80%乙醇[6]或70%乙醇[7]，樣品處理程序繁雜，并且水果中可溶性糖（果糖、山梨醇、葡萄糖、蔗糖）為水溶性物質，根據(jù)相似相溶原理，以水為溶劑更為合理。也有大量文獻中報道以水為溶劑[8-10]，那么樣品處理時，應該選擇以水還是乙醇為溶劑呢？GB/T 5009.7—2016、GB/T 5009.8—2016和GB/T 5513—2019中均以水作為溶劑，而GB/T 37493—2019中以80%乙醇為溶劑，似乎用水和80%乙醇作為溶劑都可以，但從這些國標的適用范圍來看，GB/T 5009.7—2016、GB/T 5009.8—2016和GB/T 5513—2019適用于谷物類、乳制品、果蔬制品、蜂蜜、糖漿、飲料等食品中可溶性糖的測定，而GB/T 37493—2019適用于谷物和豆類。在傳統(tǒng)的樣品處理中，水提會使樣品中淀粉和糊精類物質溶出，影響測定，同時過濾也困難，用一定體積分數(shù)的乙醇浸提能夠解決這一問題。此外，針對富含水溶性蛋白的谷物和豆類樣品，以乙醇為溶劑，可以免去除蛋白的預處理步驟。綜合來看，測定蘋果中游離糖時，應該選擇水為溶劑。

因此，旨在對蘋果可溶性糖HPLC-RID法的樣品處理進行簡化，獲得一種簡單、可靠的蘋果樣品處理方法，并分析阿克蘇“冰糖心”蘋果的糖心和非糖心部位及全果中果糖、山梨醇、葡萄糖和蔗糖的含量，為了解阿克蘇“冰糖心”蘋果的品質特征提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

“冰糖心”蘋果，2020年10月下旬采摘于阿克蘇地區(qū)紅旗坡果園。

果糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇均為色譜純標準試劑，上海阿拉丁生化科技館股份有限公司提供；乙腈（色譜純），西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司提供。

1.2 試驗儀器

TGL-20M型臺式高速冷凍離心機，湖南湘儀離心機儀器有限公司產(chǎn)品；LC-20A型液相色譜、RID20A型檢測器。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理

選取果形大小、色澤基本一致，無明顯損傷的“冰糖心”蘋果15個，取其中10個蘋果沿果實中間部位分別橫切和縱切成4塊，分別挖去糖心部分和非糖心部位；剩余5個“冰糖心”蘋果去皮和果核部位后獲得“冰糖心”蘋果樣品。將獲得的樣品用組織勻漿機勻漿后，置于-20℃下貯藏備用。

稱取一定量的果肉，加蒸餾水攪拌均勻后，轉移至100 mL容量瓶定容，靜置過夜后，超聲處理30 min，然后以轉速9 000 r/min離心15 min，去上清液過0.22 μm針式濾膜，置于4℃下備用。

1.3.2 色譜條件

色譜柱Platisil NH2（250 mm×4.6 mm，i.d.）柱（天津迪馬），柱溫30℃，進樣量10 μL，流速0.8 mL/min，流動相乙腈∶水=70∶30（V/V）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)結果以x±SD表示，采用SPSS20.0進行方差分析，并進行Duncan's多重比較（p<0.05）。

2 結果與分析

2.1 糖標準品和蘋果樣品的色譜圖

糖標準品和蘋果樣品的HPLC圖見圖1。

圖1 糖標準品和蘋果樣品的HPLC圖

由圖1可以看出，混合糖標的HLC色譜圖中果糖、山梨醇、葡萄糖和蔗糖的保留時間分別為10.30，11.28，11.83，15.33 min，除山梨醇和葡萄糖的色譜峰有少量重疊外，其余色譜峰之間均能明顯區(qū)分。在蘋果樣品中，也主要存在果糖、山梨醇、葡萄糖和蔗糖游離糖，這與文獻報道一致[11-12]。

2.2 取樣量對峰面積的影響

分別稱取1，5，10，15，20 g蘋果果肉各5份，參照1.3.1的方法進行樣品制備，然后進樣分析。

取樣量對峰面積的影響見表1。

由表1中的RSD來看，取樣量對蘋果中山梨醇、葡萄糖和蔗糖峰面積的RSD影響較大而果糖峰面積的RSD相對穩(wěn)定。除果糖外，隨著取樣量的增加，色譜峰的RSD呈減小趨勢，由于取樣量過大，會增加樣品處理難度。因此，采用HPLC-RID法分析蘋果中糖的含量時，取樣量以10～15 g為宜。

表1 取樣量對峰面積的影響

2.3 穩(wěn)定性

稱取15 g蘋果果肉，參照1.3.1的方法進行樣品制備，離心后取上清液過0.22 μm針式濾膜，準備5份相同的樣品，分別在4℃的條件下放置0，0.5，1，3，5 d后進樣，每個樣品重復3次，并計算其平均值。

穩(wěn)定性試驗見表2。

由表2可以看出，各個糖的相對標準誤差（RSD）<5%，說明該分析條件下，樣品的穩(wěn)定性較好，即在4℃的條件下放置5 d內，樣品測定結果穩(wěn)定。

表2 穩(wěn)定性試驗

2.4 回收率

稱取15 g蘋果果肉5份，每份分別添加果糖、山梨醇、葡萄糖和蔗糖標準品1.10，0.30，0.40，0.50 g，參照1.3.1的方法進行樣品制備，然后進樣分析，根據(jù)峰面積計算。

回收率試驗見表3。

表3 回收率試驗

由表3可以看出，各個糖的回收率為93.59%～99.76%，回收率均超過90%，說明該方法分析蘋果中糖含量的回收率較好。

2.5 標準曲線

稱取一定量的標準品配制成不同質量濃度的標準品溶液，然后參照1.3.2的色譜條件分析，以峰面積為縱坐標，質量濃度為橫坐標繪制標準曲線，果糖、山梨醇、葡萄糖和蔗糖的標準曲線、相關系數(shù)（R2）和線性范圍。以質量濃度最小的標準溶液逐級稀釋，然后進樣分析，通過信噪比的計算獲得檢測限（LOD，S/N=3）和定量限（LOQ，S/N=10）。

標準曲線見表4。

表4 標準曲線

由表4可以看出，各個糖的標準曲線的相關系數(shù)（R2）均為0.999 9，表明在0.5～30 mg/mL質量濃度范圍內的線性關系較好。從檢測限（LOD）和定量限（LOQ）來看，該方法的靈敏度也較好，能夠滿足蘋果樣品中游離糖含量的測定，但該方法的檢測限（LOD）和定量限（LOQ）遠高于一些文獻報道[3，7]，主要原因是他們采用的檢測器為蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD），其靈敏度遠遠高于示差檢測器（RID），這也說明對于游離糖含量較低的樣品分析時，選擇蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）較好。

2.6 蘋果樣品中游離糖的測定

稱取一定量的蘋果樣品，參照1.3.1的方法樣品制備，然后參照1.3.2的方法進樣分析，每個處理重復3次，以峰面積計算樣品中游離糖含量。

蘋果中游離糖含量見表5。

由表5可以看出，果糖是蘋果中含量最高的游離糖，約占總游離糖的50%；其次是蔗糖，含量約占總游離糖含量20%；而葡萄糖和山梨醇的含量較低。全果與非糖心果肉中游離糖無顯著差異（p>0.05），然而糖心果肉的總游離糖、果糖、蔗糖和葡萄糖均顯著低于全果和非糖心果肉（p<0.05），山梨醇顯著高于全果和非糖心的果肉（p<0.05）。Aprea E等人[13]分析了40個蘋果樣品（來源于17個品種），發(fā)現(xiàn)蘋果汁中總游離糖的含量為74.7～142.9 mg/g，此次分析的結果接近其上限，可能是由于阿克蘇地區(qū)光照充足、晝夜溫差大，有利于蘋果中糖類物質的積累。此外，阿克蘇“冰糖心”蘋果的山梨醇含量為16.53±0.03 mg/g，遠遠高于其他地區(qū)蘋果中山梨醇的含量[14]。有文獻報道，山梨醇不僅為植物生長發(fā)育提供能量和碳骨架，而且它也作為信號分子參與調節(jié)植物生長、發(fā)育和環(huán)境脅迫響應[15]，阿克蘇地區(qū)10月份夜間溫度常在-5℃以下[16]，說明阿克蘇紅富士蘋果在成熟過程中受到冷脅迫，引起山梨醇的積累，說明山梨醇與阿克蘇蘋果的“冰糖心”形成密切相關。

表5 蘋果中游離糖含量 /mg·g-1

3 結論

優(yōu)化了蘋果中游離糖測定樣品處理方法，取10～15 g勻漿后的果肉，用蒸餾水攪拌均勻后，定容至100 mL，室溫超聲30 min，能夠充分提取出果肉中游離糖。然后，建立了HPLC-RID法測定蘋果中果糖、山梨醇、葡糖糖和蔗糖的方法，該方法具有靈敏度高、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性好、簡便、快速等優(yōu)點，為蘋果和其他果品中游離糖提供準確、可靠的分析方法。此外，通過分析阿克蘇“冰糖心”蘋果的游離糖組成，發(fā)現(xiàn)阿克蘇“冰糖心”蘋果中游離糖含量較高外，其山梨醇含量也很高，可能是因低溫脅迫引起山梨醇積累。在今后研究中，山梨醇應作為阿克蘇“冰糖心”蘋果的一個重要品質特征指標。