超聲輔助常溫水浴提取長山藥多糖的工藝研究

李玉娥，馬 玲，陳振家

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 晉中030801）

山藥是塊莖植物，我國常見的有5個(gè)品種，即鐵棍山藥、太谷山藥、山薯、褐苞薯、參薯。山藥的活性成分黏液質(zhì)里蛋白質(zhì)占47.6%[1]，多糖占52.4%[2]，其中黏多糖占0.06%～1.09%[3-4]。據(jù)資料記載，山藥中的多糖具有抗腫瘤[5]、調(diào)節(jié)免疫[6-7]、抗糖尿病[8]、抗突變[9]等活性。有關(guān)山藥多糖的提取報(bào)道較多，王曉敏等人[10]報(bào)道料液比1∶10，超聲功率800 W下溫度60℃，水浴浸提30 min為最佳的淮山藥多糖提取工藝，同濃度下此多糖的抗氧化活性高于維C。王珺等人[11]報(bào)道微波輔助酶法提取懷山藥多糖最佳條件為料水比1∶5.5，微波功率825 W，85℃下處理4 h。高行恩等人[12]對(duì)水提法、超聲法、微波法和酶法提取山藥多糖的抗氧化活性進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)酶法提取多糖的得率和抗氧化活性都較高。劉杭達(dá)等人[13]發(fā)現(xiàn)，在料液比1∶15，溫度55℃下提取2 h得到的紫山藥粗多糖含量較高。王彥平等人[14]報(bào)道在加酶量1.5%，料液比1∶10，200 W超聲功率下提取25 min得到的紫山藥多糖含量較高。楊帆等人[15]確定山藥多糖的最優(yōu)工藝參數(shù)為在分析純酒精體積分?jǐn)?shù)60%，溫度49℃，超聲功率803 W下提取61 min。研究人員發(fā)現(xiàn)，麻山藥多糖對(duì)DPPH·清除率顯高，鐵棍山藥對(duì)·OH清除率顯高，而鐵棍山藥對(duì)O2-·清除率顯高。

已報(bào)道的山藥多糖提取大多采用熱水浸提，在高溫下會(huì)破壞多糖的結(jié)構(gòu)，而有關(guān)常溫水浴浸提山藥多糖的報(bào)道較少，試驗(yàn)采取常溫水浴結(jié)合超聲法進(jìn)行山藥多糖的提取，對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)對(duì)得到多糖樣進(jìn)行初步分離、純化，并對(duì)各純化組分進(jìn)行基本成分的分析，為豐富山藥多糖的提取及活性提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

長山藥，產(chǎn)于山西省晉中市太谷區(qū)；分析純酒精、1-丁醇、三氯甲烷、硫酸、苯酚、葡萄糖，所有試劑均為分析純，國藥集團(tuán)提供。

1.2 儀器

DHG-9245型電熱鼓風(fēng)干燥箱，新苗醫(yī)療器械制造（上海）產(chǎn)品；SHZ-B型恒溫水浴振蕩器，躍進(jìn)醫(yī)療器械廠（上海）產(chǎn)品；SY-2000型真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；分光光度計(jì)，上海美普達(dá)儀器有限公司產(chǎn)品；JA5003N型電子分析天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；LXG64-01型離心機(jī)，河北吳橋電機(jī)廠產(chǎn)品；MP220 pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器有限公司產(chǎn)品；真空冷凍干燥機(jī)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 多糖提取

山藥→脫脂→干燥→山藥粉→加水（料水比為1∶25（g∶mL））→超聲浸提→過濾→減壓濃縮→離心（以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心10 min）→上清液中加入3倍體積分析純酒精→輕輕攪拌→靜置過夜（溫度4℃）→離心（以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心10 min）→收集沉淀→溶于水中→除蛋白（Savage法）→3 500 Da透析→真空冷凍干燥→提取粗多糖。

1.3.2 分離、純化

將粗多糖在DEAE-cellulose纖維柱上進(jìn)行分離、純化，分別以濃度0.1，0.5，1.0 mol/L氯化鈉溶液進(jìn)行洗脫，收集得到3個(gè)主要的組分，將分離得到的3個(gè)組分在Sephadex G-100用超純水進(jìn)行洗脫以進(jìn)一步純化。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

在一些因素不變的情況下，分別將料水比、超聲功率、超聲時(shí)間對(duì)山藥粗多糖提取率的影響進(jìn)行研究，然后在此基礎(chǔ)上做正交試驗(yàn)，優(yōu)化提取工藝參數(shù)。

1.3.4 正交試驗(yàn)

在單因素確定最優(yōu)水平范圍基礎(chǔ)上采用L9（34）進(jìn)行正交試驗(yàn)。

正交因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交因素與水平設(shè)計(jì)

1.3.5 指標(biāo)測定

多糖含量的測定采用硫酸苯酚法，蛋白質(zhì)含量的測定采用考馬斯亮藍(lán)法，糖醛酸的測定采用咔唑比色法，硫酸基的測定采用明膠—氯化鋇法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同料液比對(duì)多糖得率的影響

不同料液比對(duì)多糖得率的影響見圖1。

圖1 不同料液比對(duì)多糖得率的影響

由圖1可知，隨著料液比的提高，多糖得率也提高，當(dāng)料液比達(dá)到1∶25時(shí)達(dá)到最大值，而料液比為1∶30得率最少。適度的料液比對(duì)于提取多糖至關(guān)重要，當(dāng)加入溶劑不足時(shí)，由于料液濃度大，黏度就大，分離困難，很難保證將多糖溶出；相反，加入溶劑較多，料液比相差較大，傳質(zhì)推動(dòng)力增加，一些雜質(zhì)也隨糖被推出。在醇沉試驗(yàn)時(shí)，少部分多糖會(huì)殘留在醇液中，同時(shí)當(dāng)提取劑量大時(shí)會(huì)影響超聲的空化作用和機(jī)械振動(dòng)原因，得率也會(huì)下降[16]。因此，選擇1∶25為提取山藥多糖的最佳料液比。

2.2 不同超聲功率對(duì)多糖得率的影響

不同超聲功率對(duì)多糖得率的影響見圖2。

圖2 不同超聲功率對(duì)多糖得率的影響

由圖2可知，在超聲功率100～250 W，山藥多糖得率隨著超聲功率的不斷增加而不斷上升，這與超聲的空化效應(yīng)隨超聲功率的增加有關(guān)，空化作用會(huì)破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)多糖的溶出。當(dāng)超聲功率為250 W時(shí)，得率最高，此后再增加功率得率反而下降，可能由于功率達(dá)到一定程度后盡管增加了提取液和原料的有效接觸，但超聲作用于物料的時(shí)間相對(duì)減少，因而原料細(xì)胞壁被破壞的程度不夠，胞內(nèi)多糖溶出減少[17]，同時(shí)，較大功率下的超聲波剪切作用較強(qiáng)，會(huì)導(dǎo)致部分多糖的化學(xué)鍵斷裂，進(jìn)而影響多糖得率[17]。因此，最佳超聲功率選取250 W。

2.3 不同超聲時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

不同超聲時(shí)間對(duì)多糖得率的影響見圖3。

由圖3可知，隨著超聲時(shí)間的延長，多糖的得率不斷增加，超聲時(shí)間達(dá)到50 min時(shí)，山藥多糖得率比較平穩(wěn)；可能在低于50 min時(shí)，超聲對(duì)細(xì)胞壁的破壞較小，多糖得率便低；而當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到50 min時(shí)對(duì)山藥細(xì)胞壁破壞嚴(yán)重，多糖得率較高。綜合分析得率和效率，最佳超聲時(shí)間為50 min。

圖3 不同超聲時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

2.4 正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2分析可知，比較3個(gè)因素的極差R值，RA>RB>RC>R空，可知影響山藥多糖提取得率影響的主要因素為料水比，其次為超聲功率、超聲時(shí)間，而空列的極差值最小，說明試驗(yàn)控制較好。通過理論分析可知各因素的最佳水平組合為A3B3C3，而9個(gè)試驗(yàn)中得率最高的一組為第7組，即A3B1C3，二者不一致，經(jīng)過對(duì)比試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)A3B3C3好于A3B1C3，因而最終確定超聲輔助冷水提取山藥多糖的最優(yōu)工藝條件為料液比1∶30，在超聲功率300 W下提取60 min。

2.5 分離純化多糖組分的組成

山藥多糖純化組分組成見表3。

表3 山藥多糖純化組分組成/%

分離純化后得到的3個(gè)山藥多糖的組分其基本的組成如表3所示，多糖Ⅰ和多糖Ⅱ呈微黃色海綿狀，易溶于水，溶液呈淺黃色，而多糖Ⅲ為白色疏松絮狀，易溶于水，溶液透明無色。3個(gè)組分中的多糖含量都較高，組分Ⅱ的多糖含量測得值為83.38%，3個(gè)組分中都會(huì)有部分蛋白質(zhì)，可能在前體除蛋白不夠徹底，也可能3個(gè)組分中都含有部分糖蛋白。多糖中的糖醛酸具有免疫調(diào)節(jié)和抗病毒等作用，而硫酸基含量與多糖生物活性與功能密切相關(guān)，因而一般對(duì)多糖中的糖醛酸和硫酸基含量進(jìn)行分析，3個(gè)組分中都含有的糖醛酸和硫酸基，多糖Ⅱ中的糖醛酸含量較高，而多糖Ⅰ中的硫酸基含量較高。

3 結(jié)論

采用常溫水浴結(jié)合超聲提取山藥多糖，采用正交試驗(yàn)獲得最優(yōu)工藝條件為料液比1∶30，于超聲功率300 W下提取60 min，在此條件下得到的多糖得率較高，可以達(dá)到5.14%。對(duì)粗多糖實(shí)施分離純化，結(jié)果分3個(gè)組分，其中組分Ⅱ的糖醛酸和多糖含量成分高，而組分Ⅰ的硫酸基成分高。