基于MGB1-TLR4-NF-κB信號通路分析右美托咪定對膿毒癥小鼠急性肺損傷的保護(hù)作用

吳華兵，肖秀英，詹瑋瑋，隗莉，胥春梅

膿毒癥(sepsis)是由機(jī)體對感染的異常反應(yīng)引起的器官功能障礙綜合征，臨床表現(xiàn)為體溫升高或降低、心悸氣短、寒戰(zhàn)及精神萎靡。全世界每年感染膿毒癥人數(shù)超過3 000萬，且發(fā)病率和病死率仍在上升，是世界范圍內(nèi)危重癥患者死亡的主要原因之一[1]。嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷、腹膜炎等原因引起的感染均有可能導(dǎo)致膿毒癥的發(fā)生，臨床住院患者中膿毒癥的發(fā)病率可達(dá)1%～2%[2]。右美托咪定(dexmedetomidine，Dex)是高選擇性的α2腎上腺素受體激動劑，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮、抗交感神經(jīng)和減少阿片類藥物不良反應(yīng)的作用[3]，最新研究證實，Dex治療膿毒癥的效果良好，可顯著抑制患者的炎性反應(yīng)，降低病死率，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)活性[4]。本實驗探究Dex對膿毒癥小鼠急性肺損傷的保護(hù)作用，并進(jìn)一步了解其潛在調(diào)控機(jī)制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 (1)實驗動物：雄性BALB/c小鼠36只，購自武漢大學(xué)動物實驗中心(合格證號：2016SY03245)，4～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，飼養(yǎng)于無特殊病原體的飼養(yǎng)箱內(nèi)，保持飼養(yǎng)箱內(nèi)環(huán)境安靜，給予充足的光照和水源，維持室溫及50%空氣濕度，實驗小鼠均經(jīng)動物保護(hù)學(xué)科委員會同意。(2)試劑、藥物：右美托咪定(上海源葉生物科技有限公司)，脂多糖(lipopolysaccharides，LPS，美國Sigma公司)，髓過氧化物酶(MPO)、白介素-6 (IL-6)、IL-1β、腫瘤壞死因子(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)，BCA試劑盒(上海齊源生物科技有限公司)，MGB1、TLR4、NF-κB、β-actin一抗[中國艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司] 。(3)儀器設(shè)備：電子天平(型號 H0503，邢臺智冠機(jī)械科技有限公司)，高溫烤箱(型號 JY-KX-150，東莞市精域環(huán)境測試設(shè)備有限公司)，組織勻漿機(jī)(型號 JJ-2，常州金壇良友儀器有限公司)，離心機(jī)(型號 TG18KR，上海舜制儀器制造有限公司)。

1.2 實驗方法 2017年8—12月于三峽大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院動物實驗中心進(jìn)行實驗。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，按照完全隨機(jī)法分為空白對照組、模型組及右美托咪定(Dex)組，每組12只。模型組和Dex組小鼠按照LPS 20 mg/kg腹腔注射，以構(gòu)建膿毒癥小鼠模型，當(dāng)小鼠出現(xiàn)寒戰(zhàn)發(fā)抖、抱團(tuán)取暖、呼吸頻率加快、口唇發(fā)紫發(fā)青、抓取時反抗無力時視為造模成功，空白對照組小鼠腹腔注射等量生理鹽水。造模成功后Dex組小鼠腹腔注射Dex 40 μg/kg，24 h后斷頭處死各組小鼠，沿胸線逐層分開組織，打開腹腔及胸膜，取出肺組織于-80℃的液氮中保存待用。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 肺組織病理切片染色：將各組小鼠肺組織切片脫蠟后，乙醇脫水處理，加入蒸餾水后用蘇木精水溶液進(jìn)行染色，持續(xù)數(shù)分鐘，再用氨水進(jìn)行分色處理，沖洗1 h加入蒸餾水，乙醇再次脫水10 min，伊紅溶液進(jìn)行染色，持續(xù)2～3 min，乙醇脫水后透明封片，觀察各組小鼠肺組織標(biāo)本染色情況;并根據(jù)肺泡浸潤、出血、間隔水腫及纖維蛋白沉積程度進(jìn)行肺損傷評分[5]:肺泡浸潤、出血、間隔水腫及纖維蛋白沉積程度每項計0～3分，無為0分，輕微為1分，中度為2分，重度為3分，總分為各項得分累加，總分越高，肺損傷程度越重。

1.3.2 肺組織濕干重比(W/D)檢測：將小鼠肺組織擦干后用電子天平稱重，得到肺組織濕重(wet weight，W)，再將肺組織置于高溫烤箱中烘烤至干透后再次稱重，得到肺組織干重(dry weight，D)，計算W/D。

1.3.3 肺組織炎性因子檢測：小鼠肺組織稱重后，加入裂解液進(jìn)行裂解，4℃下離心取上清液。采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒檢測IL-6、IL-1β和TNF-α、MPO，嚴(yán)格按試劑盒要求操作。

1.3.4 肺組織MGB1-TLR4-NF-κB信號通路蛋白檢測：采用Western-blot法檢測。小鼠肺組織經(jīng)勻漿機(jī)處理后離心，棄上清液，加入含有1%苯甲基磺酰氟(PMSF)的裂解液(RIPA)1 000 μl，冰上裂解30 min，4℃下離心收集總蛋白，根據(jù)BCA試劑盒說明書測量各組乳腺球蛋白(mammaglobin，MGB1)-Toll樣受體4(toll-like receptor 4，TLR4)-核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號通路的蛋白表達(dá)。取各組蛋白30 mg共20 μl進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳后電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，脫脂奶粉封膜1 h后，再與MGB1、TLR4、NF-κB、β-actin一抗在4℃下孵育過夜(抗體濃度為1∶1 000)。用磷酸鹽緩沖液洗膜多次，加入稀釋比為1∶2 000的羊抗兔二抗共同孵育1 h，洗膜3次后曝光成像，Image J軟件分析各組MGB1-TLR4-NF-κB蛋白的灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠肺組織病理形態(tài)變化 空白對照組小鼠肺組織染色均勻且清晰可見，結(jié)構(gòu)完整，排列緊密且有序，無明顯炎性反應(yīng)浸潤；模型組肺組織染色較深，邊緣模糊，形態(tài)結(jié)構(gòu)不完整，排列雜亂，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損出血，肺泡空腔內(nèi)觀察到大量炎性反應(yīng)浸潤；Dex組肺組織較為清晰，結(jié)構(gòu)相對完整，排列較為整齊，較模型組炎性反應(yīng)程度顯著減輕，且無彌漫性出血，見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織病理形態(tài)變化比較(HE染色，×200)

2.2 各組小鼠肺損傷指標(biāo)比較 與空白對照組比較，模型組小鼠W/D比值、肺損傷評分顯著升高(t=14.587、15.013，P均<0.01)；與模型組比較，Dex組小鼠W/D比值、肺損傷評分均顯著降低(t=12.405、7.696，P均<0.01)，見表1。

表1 各組小鼠肺損傷相關(guān)指標(biāo)比較

2.3 各組小鼠肺組織內(nèi)炎性因子水平比較 與空白對照組比較，模型組IL-6、IL-1β、TNF-α和MPO水平顯著升高(t=98.601、18.049、33.506、5.929,P均<0.01)；與模型組比較，Dex組L-6、IL-1β、TNF-α和MPO水平顯著降低(t=50.881、9.054、9.490、4.515,P均<0.01)，見表2。

表2 各組小鼠肺組織內(nèi)炎性因子水平比較

2.4 各組小鼠肺組織內(nèi)MGB1-TLR4-NF-κB通路蛋白表達(dá)比較 與空白對照組比較，模型組MGB1-TLR4-NF-κB通路的蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(t=24.779、22.033、22.642,P均<0.01)；與模型組比較，Dex組上述分子的蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)(t=21.394、18.644、17.781,P均<0.01)，見圖2、圖3。

3 討 論

近些年來，膿毒癥已經(jīng)成為全球性的公共衛(wèi)生問題，也是現(xiàn)階段臨床感染致死的主要原因之一，病死率高達(dá)40%[6]。膿毒癥是由細(xì)菌、真菌及病毒引起的，其發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，包括機(jī)體炎性反應(yīng)失衡、凝血及免疫障礙、線粒體功能受損及自噬等病理生理過程，最終引發(fā)全身性循環(huán)及器官功能障礙，甚至可進(jìn)一步進(jìn)展為膿毒性休克，對患者生命安全造成極大威脅[7]。肺部是人體重要免疫器官，通過先天免疫細(xì)胞和適應(yīng)性免疫細(xì)胞誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。肺部是多種空氣傳播病原體、氣溶膠及炎性反應(yīng)過敏原的主要靶器官，可致肺炎、急性呼吸窘迫綜合征、急性肺損傷(ALI)，膿毒癥患者幾乎都伴有ALI[8-9]，減輕ALI已成為治療膿毒癥的關(guān)鍵步驟。目前針對膿毒癥缺乏專門的治療方案，主要通過加強(qiáng)疾病源頭控制、抗生素及器官功能支持來避免感染[10]。膿毒癥患者機(jī)體內(nèi)的炎性因子大量釋放，肺內(nèi)組織液生成及回流失調(diào)，從毛細(xì)血管內(nèi)外滲，積聚于肺泡及肺間質(zhì)內(nèi)，引起肺組織水腫，同時血氧飽和度迅速下降，引起呼吸衰竭及心臟驟停等嚴(yán)重后果[11-12]。因此，抑制炎性反應(yīng)，減輕急性肺損傷對于膿毒癥患者的臨床治療十分關(guān)鍵。

注：A.空白對照組；B.模型組；C.Dex組

注：與空白對照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01

右美托咪定常用于兒科鎮(zhèn)靜，臨床效果較好，且安全性較高，對于外周血管收縮及交感神經(jīng)溶解也有較好的促進(jìn)作用[13]。證據(jù)表明，Dex等α2腎上腺素受體激動劑可抑制膿毒癥等需要體外循環(huán)支持患者的炎性反應(yīng)及交感神經(jīng)過度興奮，從而保護(hù)心血管、肺臟、腎臟及大腦等重要器官[14]，減輕膿毒癥患者急性肺損傷。本結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Dex可顯著抑制膿毒癥模型小鼠肺組織內(nèi)的炎性因子水平，減輕炎性反應(yīng)，改善肺損傷。Dex對模型小鼠炎性反應(yīng)的抑制和對肺損傷的保護(hù)作用原因可能在于Dex優(yōu)異的抗炎生物活性及器官保護(hù)作用。IL-6、IL-1β、TNF-α和MPO是經(jīng)典的炎性因子標(biāo)志物，Dex通過抑制IL-6、TNF-α和MPO等炎性介質(zhì)的過度表達(dá)，抑制炎性反應(yīng)的激活，阻斷炎性級聯(lián)放大效應(yīng)，避免因膿毒癥導(dǎo)致的器官損傷，發(fā)揮保護(hù)肺功能的作用[15-17]。Meng等[18]研究發(fā)現(xiàn)，Dex可顯著抑制脂多糖誘導(dǎo)的全身性炎性反應(yīng)，降低肺損傷評分和肺組織濕干重比，減輕膿毒癥大鼠的急性肺損傷，這也與本結(jié)果相符。

MGB1作為乳腺和腫瘤特異性標(biāo)志物，參與介導(dǎo)乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，同樣也是炎性級聯(lián)反應(yīng)中的重要蛋白質(zhì)，在膿毒癥等炎性反應(yīng)中高表達(dá)[19]。TLR4-NF-κB則是經(jīng)典的炎性反應(yīng)通路，可調(diào)節(jié)IL-1β、TNF-α和MPO等多種炎性因子的水平，參與調(diào)控炎性反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致膿毒癥等炎性反應(yīng)性疾病的發(fā)生[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，Dex可抑制MGB1-TLR4-NF-κB信號通路的激活，抑制膿毒癥小鼠的炎性反應(yīng)，下調(diào)IL-6、IL-1β、TNF-α和MPO等炎性介質(zhì)的表達(dá)水平。

綜上所述，Dex通過抑制MGB1-TLR4-NF-κB信號通路的激活，減輕膿毒癥小鼠肺組織炎性細(xì)胞浸潤等炎性反應(yīng)，對膿毒癥小鼠急性肺損傷起到良好的保護(hù)效果，提示MGB1-TLR4-NF-κB通路可能與膿毒癥急性肺損傷有關(guān)，為Dex臨床治療膿毒癥急性肺損傷的可行性提供了更多數(shù)據(jù)支撐。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

吳華兵：設(shè)計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；肖秀英、詹瑋瑋：提出研究思路，分析試驗數(shù)據(jù)，論文審核;隗莉、胥春梅：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改