利多卡因?qū)Υ笫笾刖W(wǎng)膜下腔出血后遲發(fā)性腦血管痙攣的影響及腦保護(hù)作用機(jī)制研究

蘇飛，陳博文，李向男，劉佳琦，陳揚(yáng)

蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)是一種臨床較為常見的腦血管意外，約占急性腦卒中發(fā)病率的10%，多由動(dòng)脈瘤破裂、腦血管畸形、血管炎等引起[1]。腦血管痙攣(cerebral vasospasm，CVS)是動(dòng)脈瘤破裂后SAH的常見并發(fā)癥之一，臨床主要表現(xiàn)為意識障礙和神經(jīng)功能受損，是導(dǎo)致SAH患者死亡和致殘的重要原因[2]。SAH后CVS發(fā)生的機(jī)制尚不明確，可能與內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)產(chǎn)生、炎性反應(yīng)、血管收縮/舒張功能障礙等有關(guān)[3-4]。目前，SAH患者主要通過術(shù)中應(yīng)用溶栓劑、術(shù)后應(yīng)用血管擴(kuò)張劑、抗炎治療等預(yù)防和治療CVS，取得了一定的療效，但仍有部分患者的療效不理想[5]。利多卡因是一種酰胺類局麻藥，臨床常用于局部麻醉和抗心律失常[6]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，利多卡因可以保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞離子通道，調(diào)節(jié)腦組織氧自由基能量代謝，發(fā)揮腦保護(hù)作用，對大鼠SAH后遲發(fā)性CVS具有一定的保護(hù)作用，但其作用機(jī)制尚未明確[7]。因此，本研究觀察了利多卡因?qū)Υ笫骃AH后遲發(fā)性CVS的影響，并進(jìn)一步分析了其腦保護(hù)作用的可能機(jī)制，旨在為SAH后遲發(fā)性CVS的防治提供一定的理論依據(jù)，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與動(dòng)物 SPF級SD雄性大鼠54只，體質(zhì)量180～220 g，由北京北方艾特生物科技有限公司提供[動(dòng)物許可證號SCXK(京)2020-0005]，室溫下自由攝食與飲水。利多卡因購于國藥集團(tuán)容生制藥有限公司；TUNEL組織細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自艾美捷科技有限公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、ET-1和一氧化氮(nitric oxide，NO)檢測試劑盒，均購自上海雅吉生物科技有限公司；p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase，p38MAPK)、p-p38MAPK、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)、p-eNOS抗體和辣根過氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記羊抗兔IgG均購于美國Santa Cruz公司。

1.2 動(dòng)物造模及分組 實(shí)驗(yàn)于2019年2-5月于華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。大鼠預(yù)飼養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、SAH組、利多卡因組，每組18只。SAH組和利多卡因組大鼠采用枕大池注血法復(fù)制SAH模型[8]，腹腔注射2.5%戊巴比妥鈉麻醉，以枕外隆凸為中點(diǎn)行約1.0 cm切口，逐層分離，初步定位枕骨、環(huán)椎及環(huán)枕膜。分離暴露左側(cè)股動(dòng)脈，抽取股動(dòng)脈血0.3 ml，然后將注射器針頭沿枕骨下滑至枕骨大孔，并向前推進(jìn)至枕大池，將0.3 ml血液緩緩注入枕大池，保持俯臥位頭低腳高約30 min，縫合切口，并用碘伏進(jìn)行消毒。48 h后采用同樣的方法抽取0.3 ml右側(cè)股動(dòng)脈血注入枕大池，若造模后大鼠基底動(dòng)脈管腔縮小，管壁增厚則為造模成功。其中假手術(shù)組大鼠暴露股動(dòng)脈后，將0.3 ml生理鹽水緩慢注入枕大池，采取同樣的方法注入2次，然后縫合傷口。第二次枕大池注血后30 min，利多卡因組大鼠向枕大池注入2%的利多卡因0.1 ml，SAH組和假手術(shù)組注入等體積生理鹽水。

1.3 檢測指標(biāo)與方法 造模后3 d、5 d和7 d，每組各取6只大鼠進(jìn)行組織取材，常規(guī)麻醉，經(jīng)枕骨大孔抽取腦脊液，暫存于-80℃冰箱，向升主動(dòng)脈插管灌注4%多聚甲醛PBS溶液，分離基底動(dòng)脈，置入4%多聚甲醛中固定；取腦皮質(zhì)及海馬組織，一部分置于4%多聚甲醛中固定，一部分暫存于-80℃冰箱待測。

1.3.1 基底動(dòng)脈和腦組織的病理變化觀察：取4%多聚甲醛固定的基底動(dòng)脈組織，進(jìn)行常規(guī)切片制作和HE染色，光鏡下(×100)觀察基底動(dòng)脈組織病理變化，隨機(jī)選取5個(gè)視野，采用Image J圖像分析系統(tǒng)測量基底動(dòng)脈管徑周長和管壁厚度。取4%多聚甲醛固定的腦海馬組織，進(jìn)行常規(guī)切片制作和焦油紫染色，光鏡下(×200)觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.3.2 TUNEL法檢測各組大鼠腦組織凋亡情況：取4%多聚甲醛固定的腦海馬組織，進(jìn)行常規(guī)切片制作和TUNEL染色，光學(xué)顯微鏡下(×200)觀察神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況，隨機(jī)選取10個(gè)視野，采用ImageJ圖像分析系統(tǒng)計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.3.3 腦脊液中氧化應(yīng)激和血管收縮因子水平檢測：取暫存于-80℃冰箱的腦脊液，采用相應(yīng)試劑盒測定腦脊液SOD、MDA、GSH-Px、NO和ET-1水平，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.4 Western Blot測定腦組織中p38MAPK、eNOS蛋白表達(dá)：取大鼠腦皮質(zhì)及海馬組織，勻漿，加入1 ml細(xì)胞裂解液提取總蛋白，經(jīng)BCA法蛋白定量，依次進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗p38MAPK(1∶1 000)、p-p38MAPK(1∶1 000)、eNOS(1∶1 000)、p-eNOS(1∶1 000)，以β-actin(1∶500)為內(nèi)參，4℃下孵育過夜，加HRP標(biāo)記的二抗(1∶1 000)，37℃下孵育2 h，顯影，Image J圖像分析系統(tǒng)分析蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠基底動(dòng)脈和腦組織損傷比較 HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠基底動(dòng)脈管腔呈圓形或橢圓形，均未見明顯異常；SAH組大鼠基底動(dòng)脈管腔不規(guī)則，管壁增厚，管腔面積縮小，且隨時(shí)間延長，病變越明顯；利多卡因組大鼠基底動(dòng)脈管腔較規(guī)則，有收縮，但相較于SAH組病變明顯減輕，見圖1。

圖1 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)基底動(dòng)脈病理特征比較(HE染色，×100)

焦油紫染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列整齊形態(tài)，未見明顯異常；SAH組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)固縮變性，細(xì)胞間隙增加，胞漿呈深紫色，且隨時(shí)間延長，病變越明顯；利多卡因組海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)少量細(xì)胞固縮變性，病變較SAH組顯著減輕，見圖2。

圖2 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)海馬CA1區(qū)病理特征比較(焦油紫染色，×200)

2.2 各組大鼠基底動(dòng)脈管徑和管壁厚度的比較 相應(yīng)干預(yù)后第3 d、5 d和7 d，SAH組大鼠基底動(dòng)脈內(nèi)徑周長小于假手術(shù)組，基底動(dòng)脈壁厚度大于假手術(shù)組(P<0.05)；干預(yù)后第5、7 d ，利多卡因組大鼠基底動(dòng)脈內(nèi)徑周長大于SAH組，基底動(dòng)脈壁厚度小于SAH組(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠基底動(dòng)脈管徑和管壁厚度比較

2.3 各組大鼠海馬組織細(xì)胞凋亡的比較 各組大鼠予相應(yīng)干預(yù)后第3 d、5 d和7 d，SAH組大鼠海馬組織細(xì)胞凋亡率均高于假手術(shù)組(P<0.05)；利多卡因組大鼠海馬組織細(xì)胞凋亡率均低于SAH組(P<0.05)，見圖3、表2。

表2 各組大鼠海馬組織細(xì)胞凋亡率比較

圖3 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)海馬組織細(xì)胞凋亡情況比較(TUNEL染色，×200)

2.4 各組大鼠腦脊液氧化應(yīng)激和血管收縮因子水平比較 各組大鼠予相應(yīng)干預(yù)后第7d，SAH組大鼠腦脊液SOD、GSH-Px和NO水平低于假手術(shù)組，MDA和ET-1水平高于假手術(shù)組(P<0.05)；利多卡因組大鼠腦脊液SOD、GSH-Px和NO水平高于SAH組，MDA和ET-1水平低于SAH組(P<0.05)，見表3。

表3 各組SAH大鼠腦脊液氧化應(yīng)激和血管收縮因子水平比較

2.5 各組大鼠腦組織p38MAPK及eNOS表達(dá)的比較 各組大鼠予相應(yīng)干預(yù)后第7d，SAH組大鼠腦組織p-p38MAPK/p38MAPK蛋白表達(dá)高于假手術(shù)組(P<0.05)，p-eNOS/eNOS蛋白表達(dá)低于假手術(shù)組(P<0.05)；利多卡因組p-p38MAPK/p38MAPK蛋白表達(dá)低于SAH組(P<0.05)，p-eNOS/eNOS蛋白表達(dá)高于SAH組(P<0.05)。見圖4。

3 討 論

SAH后CVS是多種因素作用導(dǎo)致血管平滑肌收縮異常的結(jié)果，臨床多采用鈣離子通道阻滯劑、ET拮抗劑、他汀類藥物等治療，以調(diào)節(jié)血管收縮和血管炎性反應(yīng)，達(dá)到治療效果[9]。利多卡因是近年來發(fā)現(xiàn)的一種腦保護(hù)劑。既往多項(xiàng)研究顯示，利多卡因可以阻斷神經(jīng)細(xì)胞Na+、K+、Ca2+離子通道，調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平，改善腦組織能量代謝，發(fā)揮腦保護(hù)作用[10-11]。本研究中，SAH組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞病變明顯，基底動(dòng)脈管腔周長明顯縮短，動(dòng)脈壁厚度明顯增厚，經(jīng)利多卡因干預(yù)后，神經(jīng)細(xì)胞病變明顯減輕，基底動(dòng)脈管腔周長延長，動(dòng)脈壁厚度減小，提示SAH大鼠出現(xiàn)明顯腦組織損傷和CVS，而利多卡因干預(yù)可明顯減輕腦組織損傷，緩解CVS的發(fā)生。且本研究發(fā)現(xiàn)，SAH組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明顯升高，而利多卡因干預(yù)可以明顯抑制腦組織細(xì)胞凋亡發(fā)生。

注：與假手術(shù)組相比，aP<0.05；與SAH組相比，bP<0.05

SOD和GSH-Px是機(jī)體重要的抗氧化酶，可以清除機(jī)體過多的氧自由基，降低過氧化中間產(chǎn)物MDA水平[12]。已有研究顯示，SAH大鼠產(chǎn)生的過多氧自由基可以破壞線粒體結(jié)構(gòu)，激活Bax/Bcl-2凋亡途徑，引起線粒體能量代謝障礙，導(dǎo)致腦組織損傷[13-15]。本研究中，利多卡因干預(yù)可以升高SAH大鼠腦脊液中的SOD和GSH-Px活性，降低MDA水平，提示利多卡因干預(yù)可能通過降低SAH大鼠的氧化應(yīng)激水平，清除腦組織過量的氧自由基，減輕腦組織損傷。NO是一種氣態(tài)自由基，可以激活細(xì)胞內(nèi)鈣泵，減少細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+，舒張血管，還可以通過多種途徑抑制ET-1的分泌，抑制血管平滑肌細(xì)胞收縮，在SAH后CVS的發(fā)生中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[16-17]。ET-1是一種主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成的強(qiáng)效血管收縮因子，可以促進(jìn)血管平滑肌增殖，還可以抑制eNOS表達(dá)，抑制NO合成，促進(jìn)SAH后CVS的發(fā)生[18-19]。Munakata等[20]研究亦顯示，NO和ET-1是調(diào)控SAH后CVS發(fā)生的關(guān)鍵細(xì)胞因子。本研究中，利多卡因干預(yù)可以升高SAH大鼠腦脊液中的NO水平，降低ET-1水平。提示利多卡因可能通過調(diào)節(jié)NO和ET-1釋放，抑制SAH后CVS的發(fā)生。

已有多項(xiàng)研究顯示，p38 MAPK信號通路激活可以調(diào)節(jié)eNOS-NO系統(tǒng)的表達(dá)，磷酸化的p38 MAPK可以抑制eNOS的磷酸化，抑制NO的合成和分泌，調(diào)節(jié)血管收縮功能，參與調(diào)控SAH后CVS的發(fā)生發(fā)展[21-22]。Jiang等[23]的研究顯示，利多卡因可以抑制p38 MAPK的磷酸化，減輕腦缺血再灌注大鼠的腦組織損傷。本研究結(jié)果表明，利多卡因可能通過抑制p38 MAPK的磷酸化，促進(jìn)eNOS的表達(dá)，調(diào)節(jié)NO和ET-1釋放，緩解SAH后CVS的進(jìn)展。

綜上所述，利多卡因可能通過抑制p38 MAPK的磷酸化，促進(jìn)eNOS-NO表達(dá)，抑制ET-1的分泌，調(diào)節(jié)血管收縮功能，緩解SAH后CVS的發(fā)生發(fā)展，還可以抑制腦組織細(xì)胞凋亡，減輕腦組織損傷，有望應(yīng)用于臨床SAH后CVS的防治。但本研究尚處于探索階段，其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

蘇飛：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過程，資料搜集整理，論文撰寫；陳博文、李向男、劉佳琦：設(shè)計(jì)研究方案，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文修改，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；陳揚(yáng)：提出研究思路，實(shí)施研究過程，論文審核