恩諾沙星注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查（凝膠法）方法學(xué)研究

康福忠，于小婷，王猛，楊雪，甄盼盼，程雪嬌

摘要：參照《中華人民共和國獸藥典》2015版一部附錄1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的有關(guān)規(guī)定，對(duì)恩諾沙星注射液內(nèi)毒素限度及檢查方法進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，恩諾沙星注射液稀釋到800倍及以上時(shí)，對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查無干擾，內(nèi)毒素限值確定為400EU/mL。對(duì)3批樣品進(jìn)行檢查，結(jié)果均符合規(guī)定。本研究建立的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法（凝膠法）可用于恩諾沙星注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

關(guān)鍵詞：恩諾沙星注射液;內(nèi)毒素檢查;凝膠法

恩諾沙星屬氟喹諾酮類畜禽專用的廣譜殺菌藥。對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、支原體、衣原體等均有良好作用，在獸醫(yī)臨床上被廣泛應(yīng)用。細(xì)菌內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁成分，可引起人和動(dòng)物發(fā)熱[1-3]。藥品如果被細(xì)菌內(nèi)毒素污染會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的安全問題，尤其是對(duì)身體機(jī)能較差的患病及幼齡動(dòng)物。因此，控制恩諾沙星注射液中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量對(duì)于保證產(chǎn)品的安全性非常有必要。筆者對(duì)恩諾沙注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法學(xué)進(jìn)行了研究，為該產(chǎn)品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查提供依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 儀器

單人凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司;

101型電熱鼓風(fēng)干燥箱，北京中興偉業(yè)世紀(jì)儀器有限公司;

QL-861型旋渦混合器，江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司;

DZKW-4恒溫水浴鍋，北京中興偉業(yè)儀器有限公司;

試驗(yàn)所用玻璃器皿經(jīng)250℃烘烤1h以上。

1.2 試驗(yàn)藥品

細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，批號(hào)：201784，規(guī)格：80EU/支，中國食品藥品檢定研究院;

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，批號(hào)：2010150，規(guī)格：5mL/支，湛江安度斯生物有限公司;

鱟試劑（TAL），批號(hào)：2008274，靈敏度：0.125EU/mL，規(guī)格：0.1mL/支，湛江安度斯生物有限公司;

鱟試劑（TAL），批號(hào)：2009213，靈敏度：0.125EU/mL，規(guī)格：0.1mL/支，湛江博康海洋生物有限公司;

恩諾沙星注射液，批號(hào)：20201001，20201002，20201003，規(guī)格：200mg/mL，天津市中升挑戰(zhàn)生物科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)

根據(jù)《中華人民共和國獸藥典》2015版附錄1143“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”[4]，進(jìn)行鱟試劑的標(biāo)示靈敏度復(fù)核。結(jié)果見表1。結(jié)果顯示2種不同廠家的鱟試劑的復(fù)核靈敏度λc均在0.5～2.0λ之間，符合規(guī)定。

2.2 細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）的確定

根據(jù)公式：L=K/M[5]，其中注射劑K=5EU/kg。M為每千克體重的最大供試品單次劑量，本藥品的推薦劑量為：一次量，每10kg體重，豬0.125mL，計(jì)算得出M為0.0125mL/kg，進(jìn)一步計(jì)算得出L=400EU/mL，故將恩諾沙星注射液的內(nèi)毒素限值確定為400EU/ml。

2.3 恩諾沙星注射液最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的確定

根據(jù)公式MVD=cL/λ，其中L為400EU/mL;c為供試品濃度1.0mL/mL（當(dāng)L以EU/mpL表示時(shí)，則c=1.0mL/mL）;λ為鱟試劑標(biāo)示靈敏度，根據(jù)市售鱟試劑現(xiàn)有規(guī)格，計(jì)算出恩諾沙星注射液MVD：MVD 0.5～MVD 0.03分別為800、1，600、3，200、6，400和12，800倍。

前期已進(jìn)行干擾預(yù)實(shí)驗(yàn)，供試品稀釋到800倍及以上稀釋倍數(shù)時(shí)，供試品溶液對(duì)鱟試劑反應(yīng)無干擾。因此，參考現(xiàn)有鱟試劑的規(guī)格（λ=0.125EU/mL），MVD為3，200。

2.4 正式干擾試驗(yàn)

現(xiàn)依法進(jìn)行正式干擾試驗(yàn)。取3批恩諾沙星注射液，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將供試品進(jìn)行3，200倍的稀釋（NPC），依法檢測，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示三批依法添加內(nèi)毒素的供試品溶液的反應(yīng)結(jié)果均在0.5～2.0λ之間，依據(jù)《中華人民共和國獸藥典》2015版附錄1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的要求，認(rèn)為供試品在該濃度下無干擾作用。

2.5 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

另取恩諾沙星注射液3批，依法進(jìn)行內(nèi)毒素檢測，結(jié)果見表3。結(jié)果表明3個(gè)批次的3，200倍稀釋的供試品溶液的內(nèi)毒素含量均小于0.125EU/mL，說明三批恩諾沙星注射液的內(nèi)毒素含量低于400EU/mL，符合要求。

3 討論

本試驗(yàn)用兩個(gè)廠家的鱟試劑對(duì)恩諾沙星注射液三個(gè)批次的樣品進(jìn)行了干擾試驗(yàn)，結(jié)果表明樣品稀釋至3，200倍的供試品溶液對(duì)鱟試劑反應(yīng)無干擾，確定所采用的方法可行。恩諾沙星注射液可適用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（凝膠法），用靈敏度為0.125EU/mL的鱟試劑按凝膠限度檢查法對(duì)另外3批樣品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，結(jié)果均符合規(guī)定。

本研究建立的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法適用于天津市中升挑戰(zhàn)生物科技有限公司生產(chǎn)的恩諾沙星注射液（20%），該產(chǎn)品為國家五類新獸藥，目前市場上未見其他廠家產(chǎn)品，由于不同廠家的處方工藝不盡相同，內(nèi)毒素檢查干擾因素也不相同，因此，未來其他獸藥廠家生產(chǎn)的恩諾沙星注射液（20%）應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況建立與其適應(yīng)的內(nèi)毒素檢查方法，以便于更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)：

[1] 朗青.無菌原料藥頭孢噻肟鈉細(xì)菌內(nèi)毒素的控制[J].煤炭與化工，2014，37（6）：41.

[2] 張虞婷，丁蘇蘇，李倚云.細(xì)菌內(nèi)毒素的研究進(jìn)展及其檢查法的應(yīng)用[J].天津藥學(xué)，2015，27（5）：66.

[3] 陳新宇，曹春然，孫圓媛.枸櫞酸細(xì)菌內(nèi)毒素檢查（凝膠法）方法學(xué)研究[J].中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2021，22（1）：61.

[4] 中華人民共和國獸藥典：一部[S].2015年版.2015：200.

[5] 中華人民共和國藥典：四部[S].2015年版.2015：154.