益氣解毒方水提物對人結(jié)腸癌HCT-116細胞凋亡及其NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

羅歡 魏行云 劉靈 鄒攀 何迎春 江志超

〔摘要〕 目的 研究益氣解毒方水提物對結(jié)腸癌HCT116細胞凋亡及B細胞淋巴瘤-2相關(guān)X蛋白（Bax）、X連鎖凋亡抑制蛋白（XIAP）、生存素（Survivin）和NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達的影響。方法 采用噻唑藍（MTT）比色法檢測不同濃度（1，0.5，0.25，0.125 g·L-1）益氣解毒方水提物對HCT116細胞活性的影響;采用Hoechst 33342 染色法及流式細胞術(shù)檢測其對HCT116細胞凋亡的影響;采用蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測其對HCT116細胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、XIAP、Survivin及NF-κB通路相關(guān)蛋白NF-κB、IκK、IκB的影響。結(jié)果 MTT結(jié)果提示益氣解毒方水提物能抑制HCT116細胞活性，呈時間-劑量關(guān)系（P<0.01）;與對照組比較，Hoechst 33342染色及流式細胞術(shù)結(jié)果顯示益氣解毒方水提物處理后，凋亡率升高（P<0.01）;XIAP、Survivin表達下降（P<0.01），Bax表達上升（P<0.05，P<0.01），NF-κB、IκK、IκB表達均下降（P<0.05，P<0.01）。結(jié)論 益氣解毒方水提物可抑制結(jié)腸癌HCT116細胞增殖，誘導其凋亡，其機制可能與抑制NF-κB信號通路相關(guān)蛋白NF-κB、IκK、IκB表達，下調(diào)XIAP、Survivin表達，上調(diào)Bax表達有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 益氣解毒方;結(jié)腸癌;NF-κB;信號通路;細胞凋亡

〔中圖分類號〕R273 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.12.008

Effect of Aqueous Extract of Yiqi Jiedu Formula on Human Colon Cancer HCT-116 Cells Apoptosis and NF-κB Signaling Pathway Related Protein Expression

LUO Huan1， WEI Xingyun1， LIU Ling1， ZOU Pan1， HE Yingchun2，3， JIANG Zhichao3，4*

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Hunan Provincial Key Laboratory for the Prevention and Treatment of Ophthalmology and Otolaryngology Diseases with Traditional Chinese Medicine， Changsha， Hunan ?410208， China; 3. Hunan Provincial Ophthalmology and Otolaryngology Diseases Prevention and Treatment with Traditional Chinese Medicine and Visual Function Protection Engineering and Technological Research Center， Changsha， Hunan 410208， China;

4. Hunan Provincial Brain Hospital， The Second People’s Hospital of Hunan Province， Changsha， Hunan 410007， China）

〔Abstract〕 Objective To investigate the effect of aqueous extract of Yiqi Jiedu Formula on colon cancer HCT116 cells apoptosis and B-cell lymphoma-2 related X protein （Bax）， X-linked inhibitor of apoptosis protein （XIAP）， Survivin and the influence of NF-κB signaling pathway related protein expression. Methods The thiazole blue （MTT） colorimetric method was used to detect the effect of different concentrations （1， 0.5， 0.25， 0.125 g·L-1） of aqueous extract of Yiqi Jiedu Formula on the cell viability of HCT116; Hoechst 33342 staining method and flow cytometry were used to detect its effect on HCT116 cell apoptosis; Western blot was used to detect its effect on HCT116 cell apoptosis-related proteins Bax， XIAP， Survivin and NF-κB pathway related proteins NF-κB， IκK， IκB. Results Aqueous extract of Yiqi Jiedu Formula could inhibit the activity of HCT116 cells in a time-dose relationship （P<0.01）. Compared with the control group， Hoechst 33342 staining and flow cytometry results showed， after treatment with aqueous extract of Yiqi Jiedu Formula， the apoptosis rate increased （P<0.01）; the expression levels of XIAP and Survivin decreased （P<0.01）， the expression levels of Bax increased （P<0.05， P<0.01）， the expression levels of NF-κB， IκK and IκB decreased （P<0.05，

P<0.01）. Conclusion Aqueous extract of Yiqi Jiedu Formula can inhibit the proliferation of colon cancer HCT116 cells and induce their apoptosis. The mechanism may be related to inhibiting the expression of NF-κB signaling pathway related proteins NF-κB， IκK and IκB， down-regulating the expression of XIAP and Survivin， and up-regulating the expression of Bax.

〔Keywords〕 Yiqi Jiedu Formula; colon cancer; NF-κB; signal pathway; apoptosis

結(jié)直腸癌（colorectal cancer， CRC）已成為臨床上最常見的消化道惡性腫瘤之一，癌癥患者致死率在世界范圍內(nèi)位列第二[1]。盡管目前在手術(shù)、化療、放療以及靶向治療等治療手段上取得一定進展，但放化療的毒副作用、耐藥性，靶向藥物的安全性等問題仍未解決，故尋找安全、有效、不良反應小的治療藥物是結(jié)直腸癌治療中亟待解決的問題。益氣解毒方是田道法教授多年實踐的經(jīng)驗用方，由黃芪、黃連、黨參、白花蛇舌草、天花粉、茯苓、甘草組成，具有益氣解毒、扶正祛邪、生津潤燥之功效，能有效抑制體內(nèi)鼻咽癌瘤體的生長[2]，延長患者生存期，提高患者生存質(zhì)量。前期研究表明，益氣解毒方可有效抑制鼻咽癌細胞增殖[3-4]、遷移[5-6]，誘導凋亡[7]和自噬[8]，還可調(diào)節(jié)免疫活性，增強巨噬細胞的免疫功能[9]。本課題組前期研究提示[10-11]益氣解毒方對鼻咽癌細胞凋亡信號通路NF-κB途徑具有抑制作用，進一步誘導了病變鼻咽上皮細胞的凋亡活性，且NF-κB通路的活化水平與結(jié)直腸癌的發(fā)展進程也密切相關(guān)[12]。中醫(yī)學認為肺開竅于鼻，而“肺與大腸相表里”，在生理病理上相互影響，課題組預實驗研究表明，益氣解毒方能抑制結(jié)腸癌HCT116細胞活性。但其作用強度及機制尚不明確，本實驗以結(jié)腸癌HCT116細胞為研究對象，觀察益氣解毒方水提物（Yiqi Jiedu Formula， YQ）對結(jié)腸癌HCT116細胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白Bax、XIAP、Survivin和NF-κB信號通路相關(guān)蛋白的影響，初步探討其作用機制，為臨床結(jié)腸癌的治療提供實驗和理論依據(jù)。

1 材料

1.1 ?細胞株

人結(jié)腸癌細胞HCT116，購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，批號19071806。

1.2 ?藥物與試劑

益氣解毒方藥物組成：黃芪15 g，黃連10 g，黨參10 g，白花蛇舌草20 g，天花粉15 g，茯苓10 g，甘草6 g，購于湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥房。將中藥粉碎后浸泡過夜，加10倍量蒸餾水回流提取2次，沸騰后保持1 h，合并提取液后真空泵抽濾，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮藥液后，置于冷凍干燥機干燥得水提物，密封保存。適量水提物加入無菌培養(yǎng)基配制終質(zhì)量濃度為25 g·L-1益氣解毒方母液，使用0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌，于-80 ℃冰箱保存。RPMI 1640 培養(yǎng)基（美國Cytiva公司，批號AF29546230），胎牛血清（美國Gibco公司，批號42A0378K），Annexin V-FITC/碘化丙啶（propidium iodide， PI）細胞凋亡檢測試劑盒（美國BD公司，批號556547），Hoechst 33342（上海翊圣生物科技有限公司，批號 40731ES10），兔抗Bax、Survivn、XIAP、IκK，鼠抗NF-κB、IκB、β-actin，山羊抗兔、抗鼠二抗（美國CST公司，批號分別為5023，2808，14334，8943，6956，

4814，4970，7074，7076）。

1.3 ?儀器

ELX800酶標儀（美國BioTek公司）;倒置相差生物顯微鏡（日本Olympus公司）;CO2培養(yǎng)箱（美國賽默飛世爾公司）;熒光雙染流式細胞儀（美國Nexcelom公司）;高速冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）;CytationTM5細胞成像多功能檢測系統(tǒng)（美國BioTek公司）。

2 方法

2.1 ?細胞培養(yǎng)

將結(jié)腸癌HCT116細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，適時進行傳代，取對數(shù)生長期細胞待用。

2.2 ?用MTT法檢測細胞增殖

當結(jié)腸癌HCT116細胞處于對數(shù)生長期時，用不含EDTA胰蛋白酶消化，細胞計數(shù)以5×103個/孔種于96孔板中，待12 h后細胞貼壁，棄盡原培養(yǎng)基，分組如下：對照組、不同濃度（1，0. 5，0. 25，0.125 g·L-1）益氣解毒方水提物（Yiqi Jiedu Formula， YQ）組、5-氟尿嘧啶（5-FU）2 mg·L-1組。分別在作用24、36、48 h后每孔加入100 μL MTT溶液，37 ℃放置4 h，棄除所有液體后加入DMSO，避光震蕩10 min，用酶標儀在490 nm波長處檢測吸光值，計算出細胞增殖抑制率。

2.3 ?Hoechst 33342染色法觀察細胞凋亡形態(tài)

結(jié)腸癌HCT116細胞處于對數(shù)生長期時，常規(guī)方法消化，細胞計數(shù)以2×105個/孔種于6孔板中，分組如下：對照組、不同濃度（1，0.5 g·L-1）YQ組、5-FU 2 mg·L-1組待細胞貼壁后，加入不同濃度YQ，每個濃度設置3次復孔。處理48 h后，用PBS洗滌2次，每孔加入1 mL 10 mg·L-1的Hoechst 33342染色液，置于培養(yǎng)箱中避光孵育20 min，再用PBS洗滌3次，于CytationTM 5觀察拍照。重復3次。

2.4 ?流式細胞術(shù)檢測細胞的凋亡情況

當結(jié)腸癌HCT116細胞處于對數(shù)生長期時，常規(guī)方法消化，細胞計數(shù)以5×105個/孔種于60 mm培養(yǎng)皿中，分組同“2.3”。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，常規(guī)消化，收集細胞放入離心機中，以100×g的相對離心力進行離心，5 min后收集細胞，用4 ℃預冷的PBS洗滌細胞2次，每管加入100 μL 1×Binding Buffer進行重懸后，分別加入5 μL FITC和10 μL PI，混勻后室溫避光染色15 min，再加100 μL 1×Binding Buffer終止染色，30 min內(nèi)上機檢測細胞凋亡情況。

2.5 ?蛋白免疫印跡法（Western bolt）檢測細胞中Bax、XIAP、Survivin、NF-κB、IκK、IκB蛋白表達

取對數(shù)生長期細胞，常規(guī)方法消化，種于100 mm培養(yǎng)皿中，分組同“2.3”處理細胞48 h。收集細胞，用預冷的PBS清洗2次，濾紙將殘留PBS吸出后，各皿加入含1% PMSF的裂解液80 μL，在冰上裂解30 min，于4 ℃下以13 000×g的相對離心力離心10 min并取上清液收集蛋白，按照BCA蛋白定量試劑盒說明書測定蛋白濃度，取90 μg上樣，再經(jīng)電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，脫脂牛奶封閉1 h，孵一抗過夜后孵育二抗1 h，顯影，分析。

2.6 ?統(tǒng)計方法

采用SPSS 25.0進行統(tǒng)計分析，每組實驗重復3次，實驗數(shù)據(jù)用“x±s”表示，計量資料服從正態(tài)分布，采用單因素方差分析，滿足方差齊性，多重比較用LSD檢驗，方差不齊采用非參數(shù)檢驗。若計量資料不服從正態(tài)分布，則采用秩和檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 ?YQ對HCT116細胞增殖活性的影響

MTT法檢測結(jié)果顯示，不同濃度YQ處理 HCT116 細胞24、36、48 h后，與對照組相比，HCT116細胞增殖活性均受到抑制，且效應隨著時間增強，呈劑量依賴性（P<0.01）。見圖 1。

3.2 ?Hoechst 33342染色觀察YQ干預48 h后HCT116細胞形態(tài)

干預48 h后，對照組的細胞核呈均勻一致的淡藍色，熒光微弱，偶有亮藍色細胞核;不同濃度YQ處理后，顆粒狀亮藍色細胞明顯增多，細胞核呈不規(guī)則形態(tài)，有明顯的凋亡特征;5-FU處理后，細胞核熒光強度增強，有明顯的凋亡。見圖2。

3.3 ?流式細胞術(shù)檢測YQ干預48 h后HCT116細胞凋亡率

結(jié)果顯示，對照組與YQ 1.0 g·L-1組、YQ 0.5 g·L-1組、5-FU 2 mg·L-1組細胞凋亡率分別為（1.36±0.32）%、（56.67±1.04）%、（25.70±2.86）%、（40.37±1.79）%，與對照組比較，不同濃度YQ組處理HCT116細胞48 h后，細胞凋亡率均顯著上升（P<0.01）。見圖3-4。

3.4 ?YQ對HCT116細胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、XIAP、Survivin及NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

與對照組比較，經(jīng)YQ干預后，Bax蛋白表達顯著上調(diào)，Bax蛋白表達顯著上調(diào)（P<0.05，P<0.01），XIAP、Survivin、IκB、NF-κB、IκK蛋白表達顯著下調(diào)（P<0.05，P<0.01）。見圖5-6。

4 討論

結(jié)直腸癌歸屬于中醫(yī)學“臟毒”“積聚”“腸蕈”等，病位在腸，與脾、肝、腎密切相關(guān)，病性總屬本虛標實，正氣虧虛為其本，邪實積聚為其標，進一步加重氣血不暢，癌毒蘊結(jié)而成，故臨床上中醫(yī)藥治療結(jié)腸癌多采用扶正祛邪的組方策略，在延長生存期、提高患者生活質(zhì)量方面可能存在一定優(yōu)勢[13]。

癌癥的生長速率取決于腫瘤細胞的增殖活性和死亡率，細胞凋亡的功能缺陷可能導致細胞活性異常，凋亡與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[14]。為探索益氣解毒方對結(jié)腸癌細胞凋亡的作用，本研究先采用MTT法觀察發(fā)現(xiàn)益氣解毒方不同濃度對HCT116細胞的體外增殖活性均有抑制作用，且作用呈劑量依賴性（P<0.01）。為進一步驗證益氣解毒方對結(jié)腸癌細胞凋亡的影響，采用Hoechst 33342染色法及流式細胞術(shù)等檢測凋亡較為理想的方法。Hoechst 33342染色結(jié)果顯示，對照組呈均勻一致的淡藍色，益氣解毒方干預后細胞呈顆粒狀亮藍色，同時伴有細胞邊界不齊、細胞核碎裂等凋亡特征。Annexin V-FITC/PI雙染后通過流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，結(jié)果顯示，與對照組相比，細胞凋亡率顯著上升（P<0.01）。XIAP在結(jié)腸癌中高表達[15]，可通過結(jié)合抑制Caspase蛋白活性阻止細胞凋亡[16-17];Bax為細胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子，促進癌細胞凋亡[18];Survivin具有明顯的介導細胞增殖，阻斷凋亡信號傳導的作用，與腫瘤細胞的增殖凋亡關(guān)系密切[19-20]。本實驗蛋白免疫印記法結(jié)果顯示，益氣解毒方可下調(diào)結(jié)腸癌HCT116細胞XIAP、Survivin表達（P<0.01），上調(diào)Bax蛋白表達（P<0.05，P<0.01），提示這可能是益氣解毒方誘導結(jié)腸癌HCT116細胞凋亡的機制之一。

NF-κB指的是Rel家族的核轉(zhuǎn)錄因子，其通常在結(jié)直腸癌中處于過表達狀態(tài)[21]，通常情況下NF-κB與IκB結(jié)合以復合物的形式存在于胞質(zhì)中，當NF-κB信號通路被激活，其具有負向調(diào)控活性的IκB被IκK磷酸化，隨后NF-κB從復合物中釋放并易位至細胞核，通過激活眾多靶基因的轉(zhuǎn)錄，介導免疫、炎癥、凋亡、增殖、血管生成及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等生物學過程[22]。研究表明，活化的NF-κB信號通路可上調(diào)Survivin、XIAP，下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達，從而發(fā)揮減少細胞凋亡的作用，促進結(jié)直腸癌發(fā)展進程[23]。本研究顯示，益氣解毒方作用于結(jié)腸癌細胞后，NF-κB、IκK、IκB蛋白表達均顯著下調(diào)（P<0.05，P<0.01），說明益氣解毒方可下調(diào)NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達水平，對結(jié)腸癌HCT116細胞凋亡信號通路NF-κB途徑具有抑制作用。

綜上所述，本研究表明，YQ有抑制結(jié)腸癌HCT116細胞增殖活性，促進凋亡的作用，其機制可能與上調(diào)Bax，下調(diào)XIAP、Survivin、NF-κB、IκK、IκB的表達有關(guān)，本研究結(jié)果為后續(xù)益氣解毒方抗結(jié)腸癌的臨床研究奠定了一定的實驗基礎(chǔ)和理論支持。

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