民族藥白桐樹干枝的化學成分研究

陳 飛， 賈歷力， 滕 飛， 王志堯

（1.河南省納普生物技術(shù)有限公司，鄭州 450002； 2.河南省科學院化學研究所有限公司，鄭州 450002；3.河南省科學院地理研究所，鄭州 450052）

白桐樹Claoxylon indicum（Reinw.ex Bl.）Hassk.，又名丟了棒、刁了棒、追風棍、咸魚頭大葉大青、趕風債、趕風柴、追風根、美巧懷，為大戟科（Euphorbiac eae）白桐樹屬（ClaoxylonA.Juss.）植物（見圖1），主產(chǎn)于廣東、海南、廣西、云南等地，味辛微苦，有小毒，性平，歸脾、腎經(jīng)，功效祛風除濕，消腫止痛，《生草藥性備要》記載其“祛風濕腳痛……. 敷跌打，消腫痛”，可用于風濕類風濕性關(guān)節(jié)炎，腰腿痛，跌打腫痛，腳氣水腫，還可以用于治療燒、燙傷，外傷出血，作為一種壯族藥物，在民間多用于風濕類風濕骨病的治療.《中國藥典（1977年版）》《廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標準》《湖南中藥飲片炮制規(guī)范（2010 年版）》《甘肅省中藥飲片炮制規(guī)范（1980 年版）》等法定規(guī)范中均有收載白桐樹作為臨床藥物使用，在治療風濕類風濕性關(guān)節(jié)炎及其骨病方面白桐樹均有使用，如中華跌打丸（中國藥典2010年版一部）、中華跌打酒（中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準——中藥成方制劑第十九冊）、傷筋正骨酊（國家中成藥標準匯編——骨傷科分冊）、新力正骨噴霧劑（國家中成藥標準匯編——骨傷科分冊）、駁骨水（中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準——中藥成方制劑第十一冊）等多種中成藥處方及許多壯族藥方［1-4］都運用了白桐樹這味藥.

圖1 白桐樹Fig.1 Claoxylon indicum（Reinw.ex Bl.）Hassk.

目前關(guān)于白桐樹的化學研究報道很少，文獻調(diào)研結(jié)果表明，白桐樹屬植物含酚類、生物堿、二萜、三萜、皂苷等化學成分，其中酚類（主要是木脂素、新木脂素、香豆素）是該屬植物主要成分，也是有效成分，且具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫等多種活性［5-9］. 但對白桐樹的化學成分及其現(xiàn)代藥理研究并不多，主要分離得一些倍半萜新木脂素類、二聚新脂素類、二酮呱嗓生物堿類和三萜類化合物［5，10-11］，其藥理學研究僅有解熱鎮(zhèn)痛、抑菌作用、抗腫瘤、抗氧化等生物活性，而有關(guān)白桐樹在抗風濕、類風濕性關(guān)節(jié)性的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制方面研究鮮見報道，這嚴重制約了常用民族藥白桐樹的廣泛臨床應(yīng)用，亟待加強該方面的研究工作，以利于白桐樹資源的充分開發(fā)和利用.

壯族是中國人口最多的少數(shù)民族，主要聚居于嶺南，特別是廣西一帶，氣候炎熱，多雨多濕，病多瘴毒時疫，風濕攣痹. 在遠古時期便萌發(fā)了的壯醫(yī)壯藥，積累了與風濕攣痹疾病做斗爭的一些有效方法和藥物. 我們前期研究了壯藥白桐樹對小鼠CIA膝骨關(guān)節(jié)炎疼痛模型的抗RA活性，發(fā)現(xiàn)白桐樹總酚類明顯可改善CIA模型小鼠的各種體征，并推測白桐樹酚類成分通過影響DC細胞，進行調(diào)節(jié)IL-27和OPN的表達分泌，進而改變滑膜組織IL-27/OPN調(diào)控軸，改善Th細胞極化及相關(guān)細胞因子偏移平衡而實現(xiàn)抗RA作用的. 為了進一步開發(fā)具有民族特色、地域特色的壯族藥用植物資源白桐樹，本課題組開展了基于共無定型固體分散技術(shù)的天然活性成分組增溶增效及其作用機制研究，在分析白桐樹抗類風濕性關(guān)節(jié)炎的酚類成分組時，得到6個化合物，經(jīng)鑒定分別是：6-姜烯酚（1）、6-姜酚（2）、cleomiscosin A（3）、cleomiscosin C（4）、羽扇豆醇（5）、莨菪亭（6），化合物物1-6均為首次從該屬中分離得到，以前未見諸報道，本論文為壯藥白桐樹抗類風濕的物質(zhì)基礎(chǔ)工作的一部分，為白桐樹資源的開發(fā)利用提供了參考.

1 儀器與材料

儀器：Bruker DPX 400型核磁共振波譜儀；分析型Agilent 1260高效液相色譜儀；制備型Waters 600E高效液相色譜儀；天津博納艾杰爾FS-82000s中壓快速純化制備系統(tǒng).

材料：凝膠Sephadex LH-20（40～70 μm）為瑞典Amersham Pharmacia Biotech AB 公司產(chǎn)品；反相填充材料Lichroprep RP-18 gel（40～65 μm）為德國默克公司產(chǎn)品；MCI填充材料MCI-gel CHP-20為日本三菱公司生產(chǎn)；柱層析用硅膠（100～200 目和200～300 目）為青島海洋化工廠產(chǎn)品；分析型色譜柱為Zorbax Eclipse XDB-C18（Agilent，4.6 cm×150 cm）；制備型色譜柱為Sunfire C18 OBD Prep Column（Waters，10 mm×250 mm）；薄層層析硅膠GF254薄層預制板為青島海洋化工廠產(chǎn)品；顯色劑為3%的H2SO4-乙醇溶液（噴灑后110 ℃加熱15 min顯色）.

2 試劑與藥材

試劑：乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、丙酮、石油醚等試劑均為分析純；HPLC 用甲醇、乙腈均為色譜純.

藥材：實驗用白桐樹枝干購自云南省紅河州（原植物見圖1），經(jīng)河南中醫(yī)藥大學陳隨清教授鑒定為大戟科植物白桐樹Claoxylon indicum（Reinw.ex Bl.）Hassk.的干燥枝干，留樣（標本號：DLB-201604）存放于河南省納普生物技術(shù)有限公司.

3 提取與分離

白桐樹干燥枝（7.6 kg），切成小段后，粉碎，用8倍量75%乙醇水溶液浸提3次，每次72 h，合并提取液，過濾，減壓濃縮至2 L，用同等體積的乙酸乙酯萃取5次，減壓回收乙酸乙酯，得浸膏83 g，通過硅膠柱層析，以二氯甲烷-丙酮溶液梯度（10∶1、8∶2、6∶4、1∶1）洗脫，共劃分為4個極性部分（Fr10∶1、Fr8∶2、Fr6∶4、Fr1∶1），通過MCI填料中壓柱除去Fr8∶2的色素，以甲醇-水溶液梯度洗脫，得到4個餾分（Fr8∶2-1、Fr8∶2-2、Fr8∶2-3、Fr8∶2-4）. 通過MCI 填料中壓柱除去Fr6∶4 的色素，以甲醇-水溶液梯度洗脫，得到4 個餾分（Fr6∶4-1、Fr6∶4-2、Fr6∶4-3、Fr6∶4-4）. 選擇Fr6∶4-3通過RP-C18中壓柱層析，梯度洗脫，收集了5個餾分（Fr6∶4-3-1～Fr6∶4-3-5）. 樣品Fr6∶4-3-1-7通過凝膠柱色譜層析，以甲醇洗脫，得到2個餾分（Fr6∶4-3-1-1和Fr6∶4-3-1-2）.樣品Fr6∶4-3-1-8 通過反相C18 柱層析，以40%～50%甲醇-水洗脫，收集得到10 個餾分（Fr6∶4-3-1-8-1～Fr6∶4-3-1-8-10）. 樣品Fr6∶4-3-1-9經(jīng)半制備HPLC純化得到化合物1. 樣品Fr6∶4-3-1-1/2/3經(jīng)半制備HPLC純化，得到化合物2和化合物3. 樣品Fr6∶4-3-1-8-6經(jīng)半制備HPLC純化得到化合物4. 樣品Fr8∶2-3-4-4經(jīng)半制備HPLC純化得到化合物5. 樣品Fr6∶4-3-1-2經(jīng)半制備HPLC純化得到化合物6，如圖2所示.

圖2 化合物1～6的結(jié)構(gòu)式Fig.2 Structures of compounds 1-6

4 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物（1）：無色透明油狀物，1H NMR（400 MHz，CDCl3）δH：6.82（1H，dt，J=16.0，8.0 Hz，H-4），6.81（1H，d，J=8.0 Hz，H-5′），6.70（1H，d，J=2.0 Hz，H-2′），6.68（1H，dd，J=2.0，8.0 Hz，H-6′），6.09（1H，dt，J=16.0，1.6 Hz，H-5），3.84（3H，s，-OCH3），2.82（2H，m，H-1），2.72（2H，m，H-2），2.53（2H，m，H-4），1.23～1.56（8H，m，H-6，H-7，H-8，H-9），0.89（3H，t，J=6.8 Hz，H-10）.13C-及DEPT NMR（100 MHz，CDCl3）δC：29.9（C-1），42.0（C-2），199.9（C-3），130.3（C-4），147.9（C-5），32.5（C-6），23.8（C-7），31.3（C-8），22.4（C-9），14.0（C-10），133.2（C-1′），111.1（C-2′），146.4（C-3′），143.9（C-4′），114.3（C-5′），120.8（C-6′），55.9（-OCH3）. 上述數(shù)據(jù)與文獻對照一致［12］，并通過DEPT、1H-1H COSY、HSQC、HMBC等1D、2D NMR技術(shù)對其所有NMR信號進行詳細解析和全歸屬，故化合物（1）鑒定為6-姜烯酚，結(jié)構(gòu)式見圖2（1）.

化合物（2）：無色透明油狀物，1H NMR（400 MHz，CDCl3）δH：6.81（1H，d，J=8.0 Hz，H-5′），6.70（1H，d，J=2.0 Hz，H-2′），6.68（1H，dd，J=2.0，8.0 Hz，H-6′），3.86（3H，s，-OCH3），2.81～2.89（4H，m，H-1，H-2），2.19（2H，dt，J=7.2，1.4 Hz，H-6），1.44（2H，m，H-4），1.23～1.36（4H，m，H-8，H-9），0.89（3H，t，J=6.8 Hz，H-10）.13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δC：36.4（C-1），31.7（C-2），211.5（C-3），49.3（C-4），67.7（C-5），45.4（C-6），25.1（C-7），29.2（C-8），22.6（C-9），14.0（C-10），132.6（C-1′），111.1（C-2′），146.6（C-3′），144.0（C-4′），114.5（C-5′），120.7（C-6′），55.8（-OCH3）. 上述數(shù)據(jù)與文獻對照一致［13］，并通過DEPT、1H-1H COSY、HSQC、HMBC 等1D、2D NMR技術(shù)對其所有NMR信號進行詳細解析和全歸屬，故化合物（2）鑒定為6-姜酚，結(jié)構(gòu)式見圖2（2）.

化合物（3）：白色粉末，1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δH：9.20（1H，br s，OH-4′），7.97（1H，d，J=9.6 Hz，H-4），6.84（1H，s，H-5），7.03（1H，d，J=1.6 Hz，H-2′），6.88（1H，dd，J=8.4，1.6 Hz，H-6′），6.84（1H，s，H-5），6.83（1H，d，J=8.4 Hz，H-5′），6.34（1H，d，J=9.6 Hz，H-3），5.10（1H，br s，OH-9′），4.99（1H，d，J=8.0 Hz，H-7′），4.25（1H，m，H-8′），3.82（3H，s，OCH3-6），3.81（3H，s，OCH3-3′），3.45（1H，m，H-9′a），3.78（1H，m，H-9′b），0.89（3H，t，J=6.8 Hz，H-10）.13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）δC：160.0（C-2），113.2（C-3），144.8（C-4），100.7（C-5），145.2（C-6），137.0（C-7），131.7（C-8），138.0（C-9），111.2（C-10），126.2（C-1′），112.0（C-2′），147.6（C-3′），147.2（C-4′），115.3（C-5′），120.8（C-6′），76.2（C-7′），77.8（C-8′），59.8（C-9′），55.7（OCH3-6），55.8（OCH3-5′）. 上述數(shù)據(jù)與文獻對照一致［14］，故化合物（3）鑒定為Cleomiscosin C，結(jié)構(gòu)式見圖2（3）.

化合物（4）：白色粉末，1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δH：8.50（1H，s，OH-4′），7.88（1H，d，J=9.6 Hz，H-4），6.74（2H，s，H-2′，6′），6.81（1H，s，H-5），6.28（1H，d，J=9.6 Hz，H-3），5.12（1H，br s，OH-9′），5.00（1H，d，J=8.0 Hz，H-7′），4.25（1H，m，H-8′），3.83（3H，s，OCH3-6），3.82（6H，s，OCH3-3′，5′），3.78（1H，m，H-9′b），3.45（1H，m，H-9′a），3.51（1H，s）.13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）δC：160.0（C-2），114.0（C-3），144.8（C-4），100.7（C-5），145.2（C-6，4′），137.0（C-7），131.6（C-8），138.0（C-9），111.2（C-10），125.7（C-1′），105.6（C-2′，6′），147.9（C-3′，5′），136.2（C-4′），76.5（C-7′），77.8（C-8′），59.8（C-9′），55.8（OCH3-6），56.4（OCH3-3′，5′）.上述數(shù)據(jù)與文獻對照一致［15］，故化合物（4）鑒定為Cleomiscosin A，結(jié)構(gòu)式見圖2（4）.

化合物（5）：白色粉末，1H NMR（400 MHz，CDCl3）δH：4.69（1H，d，J=2.2 Hz，H-29a），4.57（1H，d，J=2.2 Hz，H-29b），3，19（1H，dd，J=5.1，11.3 Hz，H-3），2.38（1H，td，J=11.1，5.8 Hz，H-19），1.68（3H，s，H-30），1.03（3H，s，H-26），0.97（3H，s，H-23），0.94（3H，s，H-27），0.83（3H，s，H-25），0.79（3H，s，H-28），0.76（3H，s，H-24）.13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δC：38.7（C-1），27.5（C-2），70.9（C-3），38.9（C-4），55.3（C-5），18.3（C-6），34.3（C-7），40.8（C-8），50.4（C-9），37.2（C-10），20.9（C-11），25.1（C-12），38.1（C-13），42.8（C-14），27.4（C-15），35.6（C-16），43.0（C-17），48.3（C-18），48.0（C-19），151.0（C-20），29.8（C-21），40.0（C-22），28.0（C-23），15.4（C-24），16.1（C-25），16.0（C-26），14.6（C-27），18.0（C-28），109.3（C-19），19.3（C-30）. 上述數(shù)據(jù)與文獻對照一致［16-18］，故化合物（5）鑒定為羽扇豆醇，并通過DEPT、1H-1H COSY、HSQC、HMBC等1D、2D NMR技術(shù)對其所有NMR信號進行詳細解析和全歸屬，結(jié)構(gòu)式見圖2（5）.

化合物（6）：白色粉末，1H NMR（400 MHz，CDCl3）δH：3.95（3H，s，7-OCH3），6.27（1H，d，J=9.5 Hz，H-3），6.85（1H，s，H-8），6.92（1H，s，H-5），7.61（1H，d，J=9.5 Hz，H-4）.13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δC：161.5（C-2），113.4（C-3），143.3（C-4），107.5（C-5），149.7（C-6），150.3（C-7），103.2（C-8），144.0（C-9），111.5（C-10），56.4（6-OCH3），上述數(shù)據(jù)與文獻對照一致［19］，故化合物（6）鑒定為Scoploetin，結(jié)構(gòu)式見圖2（6）.

致謝：鄭州大學分析測試中心的朱衛(wèi)國及康建勛兩位老師幫助進行核磁共振儀樣品測試，河南省科學院天然產(chǎn)物重點實驗室的趙天增研究員對樣品核磁共振圖譜數(shù)據(jù)解析方面給予指導，在此特致謝意！