羌活離體再生體系的建立

涂永燕， 肖小君， 鄒嘉慧， 李 強(qiáng)， 羅陳勇， 王 輝*

(1.內(nèi)江師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院， 四川 內(nèi)江 641100； 2.四川千草生物技術(shù)股份有限公司， 四川 內(nèi)江 641100)

0 引言

羌活(Notopterygiumincisum)，俗稱黑藥、大頭羌、蠶羌、退風(fēng)使者、川羌等，是傘形科(Umbelliferae) 芹亞科(Genus apium) 美味芹族 (Delectamentum familia apium )羌活屬(genusNotopterygium)多年生草本植物，是我國(guó)的特有屬，有6個(gè)種(寬葉羌活、羌活、羽苞羌活、瀾滄羌活、細(xì)葉羌活和卵葉羌活)[1-2].藥用羌活為羌活或?qū)捜~羌活的干燥根莖，是一種常用中藥材，主產(chǎn)于甘肅、四川、云南、青海等地[3].羌活的化學(xué)成分復(fù)雜，主要含香豆素類化合物、揮發(fā)油、有機(jī)酸等有效化學(xué)成分[4]，其味辛，性溫，被列為辛溫解表藥，具有散寒祛風(fēng)、祛濕止痛之功效，臨床用于感冒風(fēng)寒、頭痛身疼、風(fēng)寒濕痹、風(fēng)水浮腫、癰疽瘡毒等癥[4-5].研究結(jié)果表明：羌活中的主要化學(xué)成分之一紫花前胡苷具有改善大腦學(xué)習(xí)記憶障礙的功能，有望發(fā)展成為預(yù)防和治療健忘癥的新藥物[6].隨著市場(chǎng)需要量的不斷上升和價(jià)格上漲，在經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)動(dòng)下，人們對(duì)野生羌活的過度采挖，使羌活生境受到嚴(yán)重破壞，野生羌活資源蘊(yùn)藏量不斷下降[7].因此，加強(qiáng)對(duì)羌活資源保護(hù)和人工快速繁殖應(yīng)用研究就成為一個(gè)亟待解決的緊迫話題.

羌活由于種子具有休眠特性，發(fā)芽率較低，目前的研究主要集中在羌活的種類[1]、化學(xué)成分[4]、藥理作用[7]和種子繁殖[8]等方面.如張恩和等[9]研究表明，羌活種子先通過流水沖洗后，再采用赤霉素或赤霉素與細(xì)胞分裂素混合處理種子,可提前萌發(fā),提高發(fā)芽率.對(duì)于羌活組織培養(yǎng)方面的研究目前相對(duì)較少，如何詩(shī)虹等[10]研究不同植物激素對(duì)羌活愈傷組織形成、不定芽分化和生根形成完整植株的影響,篩選出最佳培養(yǎng)基配方.本文以羌活種子為材料，探究其無菌萌發(fā)的處理?xiàng)l件；并以萌發(fā)的無菌苗為外植體，探究不同激素配比對(duì)無菌幼苗增殖和生根的影響，以建立羌活離體再生體系，為羌活的快速繁殖和資源可持續(xù)利用提供技術(shù)支撐.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料

羌活種子，采自四川省阿壩州松潘縣.

1.1.2 藥品

試驗(yàn)所用NAA藥品為化學(xué)純，含量≥98.0%，成都科龍化工試劑廠生產(chǎn)；6-BA、KT、赤霉素為分析純藥品，含量≥98.0%，成都科龍化工試劑廠生產(chǎn)；IBA為分析純藥品，含量>98.0%，成都科龍化工試劑廠生產(chǎn).

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同處理方式對(duì)羌活種子萌芽的影響

選取成熟飽滿的羌活種子作為試驗(yàn)材料，先用流水沖洗30min，晾干后，裝入含有珍珠巖的尼龍網(wǎng)袋中，放置在25℃左右的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)儲(chǔ)存.取120粒飽滿成熟的種子各4份，去皮，分別編號(hào),如表1所示.

表1 羌活種子的不同處理方式

將上述處理的種子先用鑷子取出，置于吸水紙上，待種子晾干后轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)，用體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精消毒20 s后無菌水潤(rùn)洗3次，再用0.1%的升汞溶液消毒8～10 min，最后用無菌水潤(rùn)洗5～6次后進(jìn)行接種，處理過程中，不斷搖動(dòng)燒杯.將消毒好的羌活種子接種在MS+KT0.5 mg/L+NAA0.5 mg/L+AC1 g/L+蔗糖30 g/L+瓊脂條7 g/L的培養(yǎng)基上，每個(gè)編號(hào)接種20瓶，每瓶接種6粒.接種完成后將培養(yǎng)瓶置于光照培養(yǎng)箱中，其培養(yǎng)條件：溫度20℃，濕度(70±5)%，光照周期8 h/16 h，光照強(qiáng)度為2000 lx.

接種完成后，3～5 d觀察羌活種子污染狀況，之后每隔半個(gè)月查看羌活種子萌芽狀況.30 d后觀察并統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，計(jì)算萌芽率和污染率.

萌芽率=(萌發(fā)種子數(shù)/接種總數(shù))×100%； 污染率=(污染種子數(shù)/接種總數(shù))×100%.

1.2.2 不同濃度的激素對(duì)羌活試管苗增殖的影響

將1.2.1試驗(yàn)中發(fā)芽的種子轉(zhuǎn)接到配方為MS+6-BA2.0 mg/L+NAA0.2 mg/L+AC1 g/L+蔗糖30 g/L+瓊脂條7 g/L的培養(yǎng)基上，待萌發(fā)的幼苗長(zhǎng)到3 cm～4 cm左右.選取長(zhǎng)勢(shì)一致的羌活種子萌發(fā)幼苗，完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用無菌操作技術(shù)將其接種在表2中的培養(yǎng)基，每個(gè)配方接種5瓶，每瓶5株試管苗，重復(fù)3次.將接種好的試管苗放置在溫度為(25±2)℃，光照周期14 h/10 h，光照強(qiáng)度為2000 lx的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)30 d.

試驗(yàn)配方：以MS+蔗糖30 g/L+瓊脂條7 g/L為基本培養(yǎng)基，添加激素濃度見表2.

培養(yǎng)期間每隔7 d觀察羌活試管苗的生長(zhǎng)狀況，30 d后觀察并記錄數(shù)據(jù)，計(jì)算羌活試管苗的增殖率.

增殖率=[(增殖后總植株數(shù)-接種總數(shù))/接種總數(shù)] ×100 %.

表2 羌活試管苗增殖培養(yǎng)基配方 單位：mg/L

1.2.3 不同處理方式及不同培養(yǎng)基配方對(duì)羌活增殖苗生根的影響

試驗(yàn)配方：以1/2 MS +蔗糖40 g/L+瓊脂條7 g/L 為基本培養(yǎng)基，添加激素濃度和不同處理方式見表3.

表3 生根培養(yǎng)基配方 單位:mg/L

用1.2.2獲得的羌活增殖苗為試材，選取莖粗壯、葉片顏色濃綠的增殖苗，完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在超凈工作臺(tái)上，將2～3單株增殖苗為一叢，去掉黃化的葉片和纖細(xì)的莖稈，分別轉(zhuǎn)入上述培養(yǎng)基中.其中和處理需先將試管苗在無菌的100 mg/L的NAA溶液中浸泡10 min，再接種至對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基中.每處理接種5瓶，每瓶3叢試管苗，重復(fù)3次.將接種好的試管苗放置在溫度為(25±2)℃，光照周期14 h/10 h，光照強(qiáng)度為2000 lx的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)30 d.培養(yǎng)期間每7 d觀察羌活試管苗的生根狀況，30 d后觀察并記錄數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)羌活試管苗生根情況(試管苗根有4條，長(zhǎng)為1.5 cm時(shí)，視為生根).

生根率=(生根的試管苗數(shù)/接種的試管苗數(shù)) ×100%.

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行處理，用SPSS 17.0進(jìn)行方差分析，用Duncan新復(fù)極差法檢驗(yàn)差異顯著性.

1.2.4 馴化移栽

選取20瓶根系生長(zhǎng)良好的羌活試管苗為試材，置于組培架上，在光照強(qiáng)度2000 lx，溫度為(22±3)℃，每天補(bǔ)光10 h環(huán)境下煉苗10 d[11].移栽時(shí)，用鑷子輕輕將羌活試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，去除黃葉，清水輕輕沖洗苗上粘有的培養(yǎng)基，再用800倍多菌靈溶液浸泡2～3 min后，按株行距6 cm×6 cm栽種到以園土+營(yíng)養(yǎng)土+珍珠巖(2∶1∶1)混合的高溫滅菌過的基質(zhì)中[12]，澆透水后，覆上保鮮膜.

培養(yǎng)期間，每天揭開育苗盤保鮮膜1.5 h，每隔5 d，用灑水壺補(bǔ)1次水，30 d天后觀察羌活幼苗的生長(zhǎng)情況.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理方式對(duì)羌活種子萌芽的影響

接種培養(yǎng)后觀察，在接種10 d以后，少量種子膨大，出現(xiàn)白色芽點(diǎn)，長(zhǎng)0.5 cm～1 cm，為種子的胚根 (見圖1a).表4顯示：種子不經(jīng)任何處理，直接接種到培養(yǎng)基上，萌發(fā)率較低，為5.00%；種子經(jīng)過室內(nèi)干藏，用500 mg/L赤霉素浸泡有利于提高種子的萌發(fā)率，其中④處理方式比③處理方式更有利于種子的萌發(fā)，萌芽率可達(dá)17.50%.本試驗(yàn)結(jié)果表明室內(nèi)干藏后的羌活種子，經(jīng)0～4℃的清水中浸泡24 h，再用500 mg/L赤霉素浸泡24 h的處理后，有利于種子的萌發(fā)，且試管苗在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)健壯、葉色濃綠.

表4 不同處理方式對(duì)羌活種子萌芽的影響

圖1 羌活種子萌發(fā)及生長(zhǎng)情況

2.2 不同濃度的激素對(duì)羌活試管苗增殖的影響

表5顯示：添加不同濃度的KT對(duì)羌活試管苗增殖有顯著效果.與對(duì)照相比，隨KT濃度的增加，羌活試管苗增殖數(shù)呈先上升后降低的趨勢(shì).在KT濃度為1.0 mg/L時(shí)增殖后株數(shù)達(dá)最大值，增殖率為280.00%，羌活試管苗芽叢密集、葉色濃綠、幼苗粗壯、長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)(見圖2c).隨著KT濃度上升，試管苗死亡率逐漸增加，增殖率下降，表現(xiàn)為葉片黃化，試管苗萎蔫.在KT濃度為4.0 mg/L時(shí)，試管苗葉片老化，開始出現(xiàn)死亡，死亡率為24.00%(見圖2f).當(dāng)KT濃度為0.5 mg/L時(shí)，增殖率為248.00%，但與KT1.0 mg/L相比，增殖苗莖干細(xì)弱，葉色嫩綠，不利于后期生根研究.綜上所述，改變KT濃度對(duì)羌活試管苗增殖有一定影響，綜合增殖率、死亡率和生長(zhǎng)狀況考慮，較適宜的增殖培養(yǎng)基配方為MS +6-BA2.0 mg/L+KT1.0 mg/L+NAA0.2 mg/L +瓊脂條7 g/L+蔗糖30 g/L.

表5 不同濃度的激素對(duì)羌活試管苗增殖的影響

圖2 羌活試管苗增殖情況

2.3 不同處理方式及不同培養(yǎng)基配方對(duì)羌活增殖苗生根的影響

綜合考慮，經(jīng)無菌100 mg/L NAA溶液浸泡的試管苗接種到1/2MS+NAA0.5 mg/L的培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，效果較佳.

表6 不同處理方式及不同培養(yǎng)基配方對(duì)羌活 試管苗生根的影響

2.4 馴化移栽

由圖4可知，羌活試管苗經(jīng)馴化處理，移栽到以園土+營(yíng)養(yǎng)土+珍珠巖(2∶1∶1)混合的高溫滅菌過的基質(zhì)中 ，培養(yǎng)30 d后，羌活幼苗能存活，且生長(zhǎng)狀況良好.

圖3 羌活試管苗的生根情況 注：a、b、c、d分別表示在號(hào)、號(hào)、號(hào)、號(hào)培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d的生根情況.

圖4 羌活試管苗移栽生長(zhǎng)情況 注：a羌活試管苗移栽5 d的生長(zhǎng)情況；b羌活試管苗移栽30 d后生長(zhǎng)情況.

3 討論

自然環(huán)境下野生羌活以有性繁殖為主，由于種子具有雙重性休眠特性，導(dǎo)致自然繁殖率極低，萌芽率僅為0.52%[13].影響種子萌發(fā)的外界條件中，溫度是關(guān)鍵因子[9]，因此，種子萌發(fā)前，經(jīng)低溫處理，再恒溫處理，可有效打破種子休眠[14].此外，用赤霉素浸泡種子可替代低溫而打破休眠[15]，這主要是因?yàn)槌嗝顾馗淖兞饲蓟罘N子內(nèi)的激素比例，有利于休眠狀態(tài)下的種子胚恢復(fù)發(fā)育，當(dāng)種胚長(zhǎng)度充滿整個(gè)胚腔時(shí)，種皮裂開，種子萌發(fā)[9].在處理羌活種子試驗(yàn)中，應(yīng)當(dāng)舍棄漂浮在清水面上的種子，挑選飽滿、大粒的種子為材料.接種時(shí)，種子凸面背對(duì)培養(yǎng)基，凹面接觸培養(yǎng)基，這與羌活種子形態(tài)結(jié)構(gòu)有關(guān)(羌活種子為雙懸果，扁橢圓形，表面棕褐色，背面有縱棱 3—4 條，常延伸成淡棕色的翅，腹面微凹，中央常存一細(xì)線狀懸果柄，與果實(shí)頂端相連)，胚細(xì)小，埋生于種仁基部[16].

繼代轉(zhuǎn)接試管苗時(shí)，應(yīng)用鑷子和解剖刀將增殖苗的葉子和黃化部位切除，保留生長(zhǎng)點(diǎn)和2 cm～3 cm長(zhǎng)的莖，不要損傷生長(zhǎng)點(diǎn)，否則后期培養(yǎng)芽很快死亡.在羌活試管苗增殖培養(yǎng)試驗(yàn)中，增殖培養(yǎng)的最佳時(shí)間為30～35 d，培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)，易造成試管苗出現(xiàn)黃化現(xiàn)象.在工業(yè)化大量育苗中，若想使羌活試管苗無限次繼代下去，應(yīng)及時(shí)更新復(fù)壯材料，維持良好芽苗的穩(wěn)定增殖生長(zhǎng)[17].

在羌活試管苗生根培養(yǎng)中，培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基量為70 mL～80 mL，定植類型及密度為每叢2—3株，每瓶3叢時(shí)生根效果較佳.本試驗(yàn)結(jié)果表明：羌活試管苗根部經(jīng)過NAA浸泡，有利于其生根.這主要是因?yàn)镹AA不僅有利于根原基的誘導(dǎo)，而且能促進(jìn)不定根的發(fā)育和生長(zhǎng)[18].同時(shí)，也可能是由于NAA 解除了基因的抑制，提高mRNA的合成，從而促進(jìn)多種酶的合成，誘導(dǎo)根原基的發(fā)端[19].

4 結(jié)論

研究結(jié)果表明添加一定配比的6-BA、KT、NAA三種激素有利于羌活試管苗增殖分化.因羌活是喜陰植物，強(qiáng)光、高溫會(huì)抑制其生長(zhǎng)，所以馴化移栽時(shí)要?jiǎng)?chuàng)建一個(gè)濕度較高、避免強(qiáng)光直射的環(huán)境.在研究過程中發(fā)現(xiàn)，不同季節(jié)對(duì)羌活試管苗的污染有較明顯的影響，夏季污染率高，秋冬季污染率極低，工業(yè)化擴(kuò)繁羌活試管苗的最佳時(shí)間為秋季，馴化移栽時(shí)間應(yīng)選擇在春季進(jìn)行.