外源EBR對NaCl脅迫下顛茄幼苗光合色素含量及熒光特性的調(diào)節(jié)

辛正琦， 何會流

(1.西南大學 a.生命科學學院 b.三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室， 重慶 400715； 2.重慶城市管理職業(yè)學院， 重慶 401331)

0 引言

顛茄(AtropabelladonnaL.)是茄科顛茄屬多年生草本植物，整株均可入藥，藥材氣微辛，味微苦.在臨床上，顛茄的次生代謝物被廣泛作為一種抗膽堿類藥物，靶向作用于副交感神經(jīng)系統(tǒng)，在市場上缺口較大，商業(yè)價值高[1].在中國，顛茄主要種植在山東、上海和浙江等國內(nèi)沿海大中城市和地區(qū)，而上述區(qū)域由于地理因素影響土地鹽漬化程度廣泛，對顛茄的生長發(fā)育帶來了很大的危害.

鹽脅迫下植物生長發(fā)育會被抑制，一般認為是由于鹽脅迫導(dǎo)致了光合作用效率的降低而造成的.鹽脅迫能夠破壞PEP羧化酶和RuBP羧化酶的活性，從而造成葉片中葉綠體結(jié)構(gòu)受損，不利光合色素的合成與積累，進而影響光合作用的進行[2].植物將自然界的光能轉(zhuǎn)化為自身的化學能，主要是利用光系統(tǒng)Ⅰ(PSⅠ)和光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)發(fā)揮的作用，其中光系統(tǒng)Ⅱ表現(xiàn)出對NaCl脅迫更加敏感，故常作為研究人員研究植物響應(yīng)鹽脅迫的重點[3].李陽等[4]發(fā)現(xiàn)NaCl脅迫處理后，棉花葉片凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、qP、Fv/Fm等均顯著下降，表明鹽脅迫會導(dǎo)致PSⅡ受損，從而影響植物的光合作用.

油菜素內(nèi)酯(brassionolide，BR)作為一種新型植物生長調(diào)節(jié)劑，在植物生長發(fā)育以及對逆境脅迫響應(yīng)等方面具有重要作用，因此在農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中被廣泛使用[5].2,4-表油菜素內(nèi)脂(EBR)是常見的人工合成高活性油菜素內(nèi)酯類似物.科學研究已經(jīng)表明，BR可以穩(wěn)定保持植物植株內(nèi)的葉綠素濃度處于較高水平，從而有效提高植物葉片的光合速率[6]，且EBR對鹽脅迫下刺槐和香樟[7]、垂絲海棠[8]等植物的光合能力具有積極的調(diào)節(jié)作用.但是目前關(guān)于外源EBR是否能調(diào)節(jié)鹽脅迫下顛茄的光合能力尚未有報道.本實驗以顛茄為實驗對象，在室內(nèi)模擬NaCl脅迫環(huán)境，設(shè)置4種不同濃度的外源EBR，研究在NaCl脅迫下外源EBR對顛茄的葉綠素含量及熒光特性的影響，探討EBR在鹽脅迫下對顛茄幼苗光化學反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用，為拓展對EBR生物學功能的認知以及農(nóng)林栽培中改善鹽害問題提供一定的理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料及處理

試驗于西南大學生命科學學院進行，顛茄(AtropabelladonnaL.)種子購自湖南省永州市.篩選飽滿、健康的種子，用0.05 mol·L-1赤霉素浸泡2 d，再均勻灑在濕潤的濾紙上，使其萌發(fā).種子萌發(fā)約2周后，移栽到裝有土、珍珠巖、蛭石(比例為3∶1∶1)的盆缽中生長，每個處理組6缽，每缽2、3株幼苗.待顛茄幼苗株高達到10 cm左右時進行鹽脅迫試驗.

取一定量NaCl固體，溶于稀釋十倍的MS營養(yǎng)液中，配置為100 mmol·L-1NaCl溶液，每7 d澆灌一次土壤以模擬鹽脅迫環(huán)境條件.不同濃度的EBR處理采用對顛茄葉面噴施的方式，每日固定時間噴灑.本實驗中，設(shè)置6個處理組：CK(0 mmol·L-1NaCl+H2O)、T0(100 mmol·L-1NaCl+H2O)、B1(100 mmol·L-1NaCl+0.05 mg·L-1EBR)、B2(100 mmol·L-1NaCl+0.1 mg·L-1EBR)、B3(100 mmol·L-1NaCl+0.2 mg·L-1EBR)、B4(100 mmol·L-1NaCl+0.4 mg·L-1EBR).每個處理組設(shè)置3個重復(fù)，處理第5 d，10 d，15 d時，進行下列指標的測定.

1.2 相關(guān)指標的測定

1.2.1 葉片光合色素的測定

參考張憲政[9]的試驗方法，步驟略微有改動:用電子天平準確稱取0.2 g顛茄葉片，置于試管中，加入10 mL的無水乙醇、丙酮混合液(比例為1∶1)，密封避光保存48 h后，至所有顛茄葉片完全呈現(xiàn)白色，可用于后續(xù)的測定.取3 ml上清液，用紫外分光光度計測定其663、645、470 nm處的吸光值，再利用公式可得出顛茄葉片中葉綠素a、葉綠素b及類胡蘿卜素的含量.

1.2.2 葉綠素熒光動力學參數(shù)的測定

葉綠素熒光參數(shù)通過PAM-2100便攜式葉綠素熒光儀檢測.測定之前，顛茄植株須預(yù)先進行2～3 h的黑暗處理.測定于較暗的環(huán)境中進行，選擇暗適應(yīng)完全，顛茄完整、平展的葉片，放在儀器上進行最小熒光(F0)、非光化學熒光猝滅系數(shù)(NPQ)、光化學熒光猝滅系數(shù)(qP)、光系統(tǒng)Ⅱ?qū)嶋H量子產(chǎn)量(Yield)、最大量子產(chǎn)量(Fv/Fm)的測定，每個處理組進行3次重復(fù)平行試驗，用3次試驗結(jié)果的平均值進行最終的數(shù)據(jù)分析.

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Excel和SPSS對數(shù)據(jù)進行整理和統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析和Duncon多重比較及差異顯著性分析，所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標準誤差”表示.

2 結(jié)果與分析

2.1 外源EBR對鹽脅迫下顛茄葉片光合色素含量的影響

植物葉片中光合色素含量是體現(xiàn)植物光合能力的一項主要指標，環(huán)境因子的變化也會導(dǎo)致光合色素含量的改變，從而影響植物光合作用的進行[10].鹽脅迫處理后，各個處理時間段內(nèi)，顛茄葉中光合色素含量變化如表1所示，均明顯降低，在15 d時，T0組葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量分別較對照組下降了38.483%，31.807%，36.259%，37.471%.表明鹽脅迫抑制了顛茄葉片光合色素的合成.

為研究鹽脅迫條件下，外源EBR對顛茄葉光合色素水平的調(diào)節(jié)作用，通過應(yīng)用不同濃度的EBR進行實驗，結(jié)果表明，與T0組相比，外源EBR的參與使葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量及類胡蘿卜素的含量都保持在較高的水平上，且在相同處理天數(shù)時，隨著EBR濃度的提高，處理效果呈現(xiàn)先升后降的趨勢.處理到10 d時，B3組中顛茄葉片的葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量及類胡蘿卜素的含量相較于脅迫組(T0)分別升高了28.841%、30.753%、29.322%、45.635%.第15 d時，當EBR濃度為0.1 mg·L-1時，即B2組中顛茄葉片中葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素、類胡蘿卜素含量相較于T0組分別升高了32.785%、42.049%、35.779%、22.794%，總體效果最好，但光合色素含量仍顯著低于對照組.說明適宜濃度的外源EBR可以減少鹽脅迫對顛茄光合性能的損害，提高光合色素含量.

表1 不同處理方式對NaCl脅迫下顛茄葉光合色素含量的影響

2.2 外源EBR對鹽脅迫下顛茄葉片葉綠素熒光參數(shù)的影響

2.2.1 對暗適應(yīng)熒光參數(shù)的影響

葉綠素熒光參數(shù)可以直接在生長中的植物葉片上檢測，而不影響植物的正常生長，并且可以在短時間內(nèi)得到大量信息，用以分析植株的光合結(jié)構(gòu)及其功能.因此，葉綠素熒光參數(shù)是理想的光合作用探針，被廣泛應(yīng)用于植物抗逆抗病研究[11].初始熒光參數(shù)F0表示光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心處于完全開放時的熒光產(chǎn)量.植物葉片中的葉綠體類囊體薄膜遭到損傷時，F(xiàn)0的值會增大(見圖1).

圖1 不同濃度EBR處理對NaCl脅迫下顛茄葉片暗適應(yīng)熒光參數(shù)的影響

如圖1(a)所示，在各個處理階段內(nèi)，相較于CK組，T0組中鹽脅迫處理均導(dǎo)致F0值大幅增加.表明顛茄光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心遭受鹽脅迫的破壞，光合作用因而遭到抑制.結(jié)果還表明：在各個處理時間內(nèi)，外源EBR的加入緩解了F0的升高.處理第5 d時，隨著EBR濃度的升高，F(xiàn)0逐漸降低.處理后期(10～15 d時)，B2—B4組F0值相較于T0組均顯著降低.表明長期鹽脅迫處理時，較高濃度的EBR能夠顯著降低F0，有效緩解鹽脅迫造成的PSⅡ反應(yīng)中心損傷和光抑制.

Fv/Fm表示暗適應(yīng)樣品中光系統(tǒng)Ⅱ的最大量子產(chǎn)量，F(xiàn)v/Fm在植物葉片受到明顯光抑制時會顯著降低，是一個反映植物光系統(tǒng)損傷程度的常用指標[12].如圖1(b)所示，鹽脅迫處理后，隨著時間的增加，F(xiàn)v/Fm逐步降低.處理第5、10和15 d時，T0組Fv/Fm相較于對照組分別下降了7.602%、13.254%和16.510%.而不同濃度外源EBR的應(yīng)用，均提高了鹽脅迫下Fv/Fm值.其中，B2和B3處理組的作用效果較好，且二者幾乎不存在顯著性差異.以上結(jié)果表明，NaCl脅迫能夠引起Fv/Fm顯著降低，顛茄葉片光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心的量子產(chǎn)量逐漸下降，顛茄葉片光合能力可能受到了抑制.而噴施0.1 mg·L-1和0.2 mg·L-1外源EBR，則可以有效緩解這一現(xiàn)象，從而提高顛茄的光合效率.

2.2.2 對光適應(yīng)熒光參數(shù)的影響

光化學熒光猝滅系數(shù)qP，代表的是光系統(tǒng)Ⅱ中的色素所吸收的光能被用于光化學反應(yīng)電子傳遞的效率，qP值越大，表明光系統(tǒng)Ⅱ中的電子傳遞活躍度就越高[13].非光化學熒光猝滅系數(shù)NPQ，表示在綠色植物進行光合作用時，由熱耗散所產(chǎn)生的熒光猝滅，反映了植物把過剩的光能轉(zhuǎn)化為熱能的能力[14](見圖2).

圖2 不同濃度EBR處理對NaCl脅迫下 顛茄光適應(yīng)熒光參數(shù)的影響

從圖2(a)中可知，NaCl脅迫條件下，qP顯著降低，且隨著處理天數(shù)的增多，降低幅度也越來越大.說明當植物遭受鹽脅迫時，qP值會顯著降低，且隨著脅迫持續(xù)時間的增長影響也越來越大.不同濃度EBR應(yīng)用后，在各處理組中qP值均有增加.如圖2(b)所顯示，在鹽脅迫條件下，T0組NPQ較CK組明顯升高，且在整個處理期內(nèi)持續(xù)升高.15 d時，T0組中NPQ達到最高，比CK組明顯提高了16.724%.經(jīng)不同濃度EBR處理后，NPQ值顯著減小.除第5 d以外，NPQ隨外源EBR濃度增加呈現(xiàn)先降后升的現(xiàn)象.到15 d時，當EBR濃度為0.1mg·L-1時NPQ值最小，與對照組并無顯著性區(qū)別，相較于T0組降低了12.715%.表明在鹽脅迫期間，葉片光能熱耗散量加大，葉片可能利用非光化學猝滅提高熱耗散能力來消耗過多的激發(fā)能以適應(yīng)鹽脅迫環(huán)境條件.0.1 mg·L-1EBR能夠顯著消除鹽脅迫下NPQ的升高，降低了鹽脅迫對光合機構(gòu)造成的危害.

Yield代表的是植物葉片中光系統(tǒng)Ⅱ的實際量子產(chǎn)量，也反映了光系統(tǒng)Ⅱ在部分反應(yīng)中心關(guān)閉的情況下，植物葉片實際的光能捕獲效率[15].如圖2(c)所顯示的，在不同時期內(nèi)，CK組Yield數(shù)值的高低變動不大，在鹽脅迫條件下，T0組Yield遠遠低于CK組.外加不同濃度EBR處理后，Yield均有不同程度的提高.總體來說，在各處理時段內(nèi)，B2和B3處理效果更為理想.以上結(jié)果表明，鹽脅迫導(dǎo)致了顛茄葉片的原初光能捕獲效率大大降低，EBR的加入可以有效減弱這一現(xiàn)象，在EBR濃度為0.1 mg·L-1和0.2 mg·L-1時效果最好.總之，EBR的加入能夠有效增加植物吸收的光能中用于光化學的比例，加快鹽脅迫下顛茄葉片PSⅡ中的電子傳遞速率，從而提高了植物對鹽脅迫的適應(yīng)能力.

3 討論

植物在生長發(fā)育的過程中，會遭受到不同的環(huán)境脅迫，例如鹽堿脅迫、過度紫外線輻射、低溫、高溫、干旱、重金屬和機械損傷等等，從而產(chǎn)生了一系列復(fù)雜的防護機制，來識別和適應(yīng)自身所處的自然環(huán)境[16-17].所以，認識植物生長發(fā)育中的各種生理過程和防護機制對植物科學發(fā)展有著重大的意義[17].鹽是植物生長過程中常常遇到的非生物脅迫因子，也是影響植物生長發(fā)育和生理代謝的一種非常重要的因素[18-19].

光合作用作為綠色植物機體內(nèi)主要的新陳代謝過程，能夠影響植物生根發(fā)芽、開花結(jié)果、產(chǎn)出及對周圍環(huán)境的適應(yīng)性.光合色素作為植物光合作用的載體，其含量的多少體現(xiàn)出植物進行光合作用效率的高低，直接影響光合速率和光合產(chǎn)物的積累[20].環(huán)境因子的改變也會引起光合色素含量改變.本研究中，鹽脅迫導(dǎo)致顛茄幼苗葉片中葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素降解加速或合成遭到抑制，特別是葉綠素b對脅迫反應(yīng)更為敏感.光合色素含量顯著降低，從而影響了光合作用的正常進行.這和鹽脅迫下半夏[21]、玉米[22]和沙棗苗木[23]的研究基本一致.光合色素主要存在葉綠體的基粒中，層層堆疊的基粒片層是類囊體的重要組成部分，在本試驗中，EBR能夠有效促進顛茄葉片光合色素含量增加，表明外源EBR有助于緩解鹽脅迫對葉綠體膜系統(tǒng)的傷害，提高光合色素的合成效率，減少光合色素的分解，減緩葉綠體老化、基粒片層數(shù)目減少，保證葉綠體結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性，有效提高了顛茄的光合效率及其耐鹽性.這和EBR處理紫花苜蓿[24]、樟樹[25]后的結(jié)果一致.

葉綠素熒光參數(shù)是植物體內(nèi)葉綠素含量變化的重要指標，它和植物光合中的各項化學反應(yīng)變化有關(guān)聯(lián)，涉及多種光合作用信息，非常容易受到植物逆境脅迫的影響.由于葉綠素的含量也影響著PSⅡ的光能利用效率[26]，所以鹽脅迫在影響植物葉綠素含量的同時，也對其葉綠素熒光參數(shù)產(chǎn)生了相應(yīng)的影響.鹽脅迫條件下，植物葉綠體光合機構(gòu)會遭到損傷，PSⅡ光能利用率減小且PSⅡ的潛在活性被抑制[27].本研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫使得顛茄葉片F(xiàn)v/Fm降低，意味著發(fā)生了光抑制.F0升高、qP、Yield降低，表明葉綠體類囊體薄膜和PSⅡ反應(yīng)中心發(fā)生了損害，電子傳遞功能被嚴重抑制.應(yīng)用一定濃度的外源EBR后，F(xiàn)v/Fm、Yield和qP明顯增加，F(xiàn)0降低，說明外源EBR可以減弱鹽脅迫條件下顛茄幼苗葉片光合機構(gòu)和PSⅡ反應(yīng)中心受到的影響，從而提高葉片中電子傳遞速率，改善光合作用效果.同時，鹽脅迫導(dǎo)致NPQ顯著升高，這是由于逆境脅迫使得PSⅡ反應(yīng)中心受損，光合效率降低，進而導(dǎo)致光合色素吸收的光能用于光化學反應(yīng)的份額減少，更多的光能被熱耗散掉，這種耗散機制可能是顛茄對鹽脅迫的一種防御響應(yīng).另外周丹丹[28]通過研究鹽脅迫對樸樹和速生白榆的葉綠素熒光特性的影響得出了相似的結(jié)論.而EBR處理后NPQ顯著降低，表明外源EBR能夠有效減少逆境脅迫下顛茄葉片中光能的熱耗散，有利于光合作用的正常進行.這與王舒甜等[29]在香樟葉片中的研究結(jié)論基本一致.

4 結(jié)論

綜上所述，NaCl脅迫使顛茄葉片中光合機構(gòu)受到破壞，光合色素含量明顯減少，同時葉綠素熒光參數(shù)F0、NPQ明顯增加，而Fv/Fm、qP、Yield則明顯下降.0.1 mg·L-1EBR處理，可以有效提高顛茄葉片光合色素的產(chǎn)生和積累，減少鹽脅迫條件對PSⅡ反應(yīng)中心造成的損傷，從而提高植物的光合能力，增加植物的耐鹽性，進而減少鹽脅迫對顛茄生長發(fā)育的抑制.在實際生產(chǎn)過程中，也可以考慮外施適宜濃度的EBR，來處理顛茄栽培過程中可能出現(xiàn)的鹽害問題，從而增加其抗逆能力，保護植物正常生長.但是，關(guān)于外源EBR對顛茄幼苗鹽脅迫的內(nèi)部反應(yīng)機制的作用還需進一步研究.