淚腺腺樣囊性癌中MYB蛋白表達(dá)及分子遺傳學(xué)特征分析

劉 輝，任雨潔，楊菁茹，李元朋，蔡鳳梅，夏益敏，王卉芳

腺樣囊性癌(adenoid cystic carcinoma, ACC)是好發(fā)于涎腺的惡性腫瘤[1]，淚腺ACC與涎腺ACC相比，臨床更為罕見。淚腺ACC?？汕址秆劭糁車M織，因眼眶解剖部位的特殊性，手術(shù)常無(wú)法完整切除且易發(fā)生局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，患者10年生存率約52%[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)在涎腺ACC中普遍存在MYB、MYBL1和NFIB基因易位[3-7]，且MYB蛋白在ACC中過(guò)表達(dá)，具有較高的敏感性和特異性。既往研究多集中在涎腺ACC，而淚腺ACC報(bào)道較少。本文收集16例淚腺ACC和20例淚腺非ACC，采用免疫組化EnVision法和FISH法檢測(cè)MYB蛋白表達(dá)及MYB基因易位，聯(lián)合MYB蛋白表達(dá)和分子遺傳學(xué)改變?yōu)闇I腺ACC的診斷提供更多病理學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料收集2010年9月～2020年9月陜西省西安市人民醫(yī)院(西安市第四醫(yī)院)手術(shù)切除淚腺ACC標(biāo)本16例和淚腺非ACC標(biāo)本20例(包括淚腺混合瘤12例、淚腺惡性混合瘤6例、淚腺腺癌1例、淚腺腺泡細(xì)胞癌1例)。所有病例均未行放、化療或其他針對(duì)腫瘤的治療，由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師重新閱片。根據(jù)ACC組織學(xué)類型對(duì)其進(jìn)行分級(jí)：Ⅰ級(jí)以管狀或篩狀結(jié)構(gòu)為主，無(wú)實(shí)性成分；Ⅱ級(jí)為管狀、篩狀和實(shí)性成分均有，且實(shí)性成分≤30%；Ⅲ級(jí)為管狀、篩狀和實(shí)性成分均有，且實(shí)性成分>30%。收集所有病例的臨床資料，隨訪截至2020年9月，時(shí)間為1個(gè)月～5年。

1.2 免疫組化檢測(cè)及結(jié)果判定免疫組化采用EnVision法染色，兔單克隆抗體MYB(1 ∶200)購(gòu)于美國(guó)Abcam公司，具體操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。MYB陽(yáng)性結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)：MYB陽(yáng)性定位于細(xì)胞核，呈棕黃色顆粒。(1)按陽(yáng)性細(xì)胞著色程度計(jì)分：未著色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；(2)按陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分：<10%為0分，10%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。將兩項(xiàng)評(píng)分相乘：0分為陰性，1～4分為弱陽(yáng)性，5～8分為中等陽(yáng)性，9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性。

1.3 FISH檢測(cè)及結(jié)果判定FISH檢測(cè)MYB基因易位：石蠟包埋組織，4 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟水化，晾干。雜交前處理，變性及雜交，探針為MYB(6q23)基因斷裂探針(廣州安必平公司)；雜交后洗滌，熒光顯微鏡下觀察切片，4 ℃保存切片等，實(shí)驗(yàn)流程按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。FISH結(jié)果判定：無(wú)MYB基因易位的細(xì)胞核中顯示2個(gè)緊密相鄰的紅、綠信號(hào)，或有疊加的部分呈黃色；有MYB基因易位的細(xì)胞核則顯示至少1對(duì)紅、綠分離信號(hào)，且紅、綠信號(hào)分離間距≥2個(gè)信號(hào)點(diǎn)直徑距離。由于切面原因，會(huì)出現(xiàn)部分信號(hào)丟失現(xiàn)象，因而只計(jì)數(shù)信號(hào)完整(2紅、2綠)的細(xì)胞。選取20個(gè)視野(1 000倍)，計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞核，陽(yáng)性細(xì)胞核比例≥30%時(shí)為陽(yáng)性；<10%時(shí)為陰性；≥10%且<30%時(shí)為不確定病例，需進(jìn)行其他驗(yàn)證。本組未見不確定病例。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料采用n(%)表示，組間總體分布趨勢(shì)比較采用χ2檢驗(yàn)及Fisher精確概率法，組間兩兩比較采用Bonferrion矯正法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征16例ACC患者年齡19～74歲，平均49歲，男女比為5 ∶11，腫瘤最大徑0.8～4.5 cm，平均2.6 cm。淚腺ACC患者臨床表現(xiàn)主要為眼部腫物，部分患者伴眼瞼水腫或疼痛流淚。影像學(xué)多表現(xiàn)為明顯的眼眶內(nèi)腫物，部分病例邊界不清，腫瘤組織破壞周圍骨組織呈侵襲性生長(zhǎng)，其中2例伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。隨訪時(shí)間1個(gè)月～5年，4例患者出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)，隨訪患者均無(wú)死亡(表1)。

表1 淚腺ACC臨床病理資料及免疫組化和FISH檢測(cè)

2.2 病理特征淚腺ACC組織主要由導(dǎo)管細(xì)胞和肌上皮細(xì)胞構(gòu)成，形成管狀、篩狀或?qū)嵭越Y(jié)構(gòu)，篩孔內(nèi)可見嗜堿性黏液樣物質(zhì)(圖1、2)，并可見神經(jīng)侵犯(圖3)。按病理學(xué)分級(jí)：16例淚腺ACC中Ⅰ級(jí)5例，以管狀或篩狀結(jié)構(gòu)為主，無(wú)實(shí)性成分；Ⅱ級(jí)9例，有管狀、篩狀和實(shí)性成分，且實(shí)性成分≤30%；Ⅲ級(jí)2例，有管狀、篩狀和實(shí)性成分，且實(shí)性成分>30%(表1)。部分病例腫瘤細(xì)胞也可見條索狀排列。

2.3 MYB蛋白表達(dá)免疫組化EnVision法檢測(cè)MYB蛋白在淚腺ACC組織中呈細(xì)胞核陽(yáng)性著色，16例淚腺ACC中強(qiáng)陽(yáng)性5例(表1，圖4、5)，中等陽(yáng)性11例(圖6)。淚腺ACC中MYB蛋白表達(dá)與腫瘤大小、病理分級(jí)、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后均無(wú)關(guān)(P>0.05)。MYB蛋白在淚腺ACC組和非ACC組中的陽(yáng)性率分別為100%(16/16)和0(0/20)，差異有顯著性(P<0.01)。

2.4 MYB基因易位FISH法檢測(cè)16例淚腺ACC組織中有14例標(biāo)本存在MYB基因易位(表1)，表現(xiàn)為紅綠信號(hào)分離(圖7)，陽(yáng)性率為87.5%(14/16)。2例患者FISH檢測(cè)陰性，但MYB蛋白免疫組化檢測(cè)均呈中等陽(yáng)性。淚腺ACC中MYB基因易位與腫瘤大小、病理分級(jí)、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后均無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05)。20例淚腺非ACC標(biāo)本中均未檢測(cè)到MYB基因易位，差異有顯著性(P<0.01)。

①②③④⑤⑥⑦圖1 腫瘤組織呈篩狀排列,腔內(nèi)可見嗜堿性分泌物,可見正常淚腺組織(箭頭) 圖2 淚腺ACC腫瘤細(xì)胞呈實(shí)性排列圖3 腫瘤細(xì)胞呈條索狀排列并侵犯神經(jīng)組織 圖4 MYB在ACC細(xì)胞核呈強(qiáng)陽(yáng)性,EnVision法 圖5 MYB在淚腺ACC組織中呈彌漫強(qiáng)陽(yáng)性,EnVision法 圖6 MYB在淚腺ACC部分腫瘤細(xì)胞呈中等陽(yáng)性,EnVision法 圖7 FISH檢測(cè)淚腺ACC中MYB發(fā)現(xiàn)基因斷裂

3 討論

MYB屬于原癌基因，編碼核轉(zhuǎn)錄因子c-MYB，文獻(xiàn)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)MYBL1(a-MYB)和MYBL2(b-MYB)，三者均為MYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員。研究發(fā)現(xiàn)MYB在細(xì)胞增殖、分化和血管生成等方面發(fā)揮重要作用[8]，c-MYB在白血病、結(jié)腸癌、乳腺癌和肝癌中均存在過(guò)表達(dá)。目前，研究顯示ACC常發(fā)生t(6；9)(q22-23；p23-24)染色體易位，MYB和NFIB發(fā)生融合，形成MYB-NFIB融合基因，參與ACC的發(fā)生、發(fā)展[3-7]。WHO(2017)頭頸部腫瘤分類將t(6；9)(q22-23；p23-24)染色體易位作為涎腺ACC特征性的分子遺傳學(xué)改變，在涎腺ACC診斷中具有較高的敏感性和特異性。

ACC多見于涎腺，也可發(fā)生于淚腺、乳腺、肺和皮膚等部位[9-11]。既往研究多集中在涎腺和乳腺等常見部位的ACC，淚腺和肺等少見部位ACC分子改變報(bào)道較少[3,11-14]。淚腺ACC常需與淚腺部位其他腫瘤鑒別，特別是淚腺多形性腺瘤、上皮-肌上皮癌和癌在多形性腺瘤等，可利用MYB基因易位在ACC中的高敏感性和特異性進(jìn)行鑒別診斷。Chen等[12]收集12例淚腺ACC和25例非ACC良性唾液腺組織，在淚腺ACC中MYB基因易位陽(yáng)性率為58%(7/12)，在非ACC組織中并未發(fā)現(xiàn)MYB基因易位。von Holstein等[3]采用分離探針檢測(cè)14例淚腺原發(fā)ACC和19例非ACC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)7例淚腺ACC存在MYB基因易位，陽(yáng)性率為50%，非ACC中并未檢測(cè)到MYB基因易位。Andreasen等[13]收集64例涎腺、淚腺和乳腺ACC，其中9例淚腺ACC經(jīng)FISH檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)5例存在MYB-NFIB融合基因。MYB基因易位在淚腺ACC中具有較高的敏感性和特異性，由于其病例數(shù)較少，尚需積累更多病例進(jìn)一步分析。本組收集16例淚腺ACC，采用MYB斷裂基因進(jìn)行FISH檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其陽(yáng)性率為87.5%(14/16)，在20例淚腺非ACC中并未檢測(cè)MYB易位，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

雖然MYB基因易位在ACC中具有較高的敏感性和特異性，但分子遺傳學(xué)檢測(cè)MYB陰性的病例并不能完全除外ACC。近年研究顯示ACC中還有其它融合基因[6,11,15-19]，同時(shí)不同檢測(cè)材料和方法也影響檢測(cè)結(jié)果。Brill等[14]通過(guò)RT-PCR法檢測(cè)MYB-NFIB融合基因在頭頸部ACC中的陽(yáng)性率，在石蠟組織和冷凍組織中的陽(yáng)性率分別為44%(14/32)和86%(25/29)。Togashi等[16]采用FISH、RT-PCR和RNA Sequence等方法檢測(cè)100例ACC，結(jié)果顯示其中73例存在MYB基因易位，24例存在MYBL1基因易位，陽(yáng)性率為97%(97/100)，作者發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性病例表現(xiàn)形式多樣，如果僅使用斷裂探針檢測(cè)陽(yáng)性率僅為87%(87/100)，MYB斷裂探針和MYB-NFIB融合探針雙陽(yáng)性57例，MYB斷裂探針陽(yáng)性而MYB-NFIB融合探針陰性12例，MYB-NFIB融合探針陽(yáng)性而MYB斷裂探針陰性3例。此外，還發(fā)現(xiàn)在MYBL1陽(yáng)性病例中MYBL1斷裂探針和MYBL1-NFIB融合探針雙陽(yáng)性18例，MYBL1斷裂探針陽(yáng)性而MYBL1-NFIB融合探針陰性5例，MYBL1斷裂探針陰性而MYBL1-NFIB融合探針陽(yáng)性2例。Fujii等[19]采用斷裂探針和融合探針檢測(cè)33例ACC，其中16例MYB-NFIB、4例MYB-X、2例MYBL1-NFIB、1例MYBL1-X、6例NFIB-X和4例陰性，陽(yáng)性率為88%(29/33)。Pei等[11]收集7例氣管支氣管部位ACC，并采用RNA Sequence檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MYB-NFIB、MYBL1-NFIB、MYBL1-RAD51B融合基因。由此可見，雖然MYB在ACC中具有較高的特異性，但仍有MYBL1等其他基因突變，且突變的表現(xiàn)形式多樣，特別是對(duì)于MYB基因易位陰性的病例，仍不能完全排除ACC的可能性，需要檢測(cè)其他可能存在的基因突變。

關(guān)于淚腺ACC是否也具有以上各種基因易位情況，由于標(biāo)本量少，目前僅有少量相關(guān)研究。Andreasen等[13]認(rèn)為淚腺ACC的基因突變高度集中于MYB和NFIB，而MYBL1則主要發(fā)生于唾液腺ACC中。Togashi等[16]收集4例淚腺ACC，在其中1例中發(fā)現(xiàn)MYBL1斷裂探針陰性而MYBL1-NFIB融合基因陽(yáng)性。Pei等[11]報(bào)道7例氣管支氣管部位ACC中發(fā)現(xiàn)MYBL1-NFIB和MYBL1-RAD51B融合基因。Chen等[12]用MYB斷裂基因FISH法檢測(cè)淚腺ACC，作者認(rèn)為陰性病例仍不能除外ACC可能性。本實(shí)驗(yàn)中用MYB斷裂基因檢測(cè)的16例淚腺ACC有14例陽(yáng)性，2例陰性，但不能完全除外ACC。目前，多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道認(rèn)為MYB的免疫組化法檢測(cè)比分子檢測(cè)具有更高的敏感性，部分分子檢測(cè)陰性的ACC也存在MYB蛋白過(guò)表達(dá)。本組中2例FISH檢測(cè)MYB陰性的病例也出現(xiàn)了MYB蛋白中等陽(yáng)性，與既往報(bào)道一致。也有研究顯示部分非ACC中也出現(xiàn)MYB蛋白的表達(dá)[14,20-21]。本組20例淚腺非ACC組織中，并未發(fā)現(xiàn)MYB蛋白強(qiáng)陽(yáng)性，ACC的診斷仍應(yīng)結(jié)合MYB免疫組化和分子檢測(cè)結(jié)果綜合分析。對(duì)于ACC分子遺傳學(xué)改變與病理分級(jí)和臨床特征之間的相關(guān)性，仍存在爭(zhēng)議。Chen等[12]認(rèn)為淚腺ACC中MYB基因易位與病理特征及患者預(yù)后無(wú)關(guān)，而Togashi等[16]研究顯示MYB/MYBL1基因易位與病理分級(jí)有相關(guān)性。淚腺ACC中的研究因局限于少數(shù)病例，并無(wú)大樣本分析，缺乏有力證據(jù)。本實(shí)驗(yàn)有16例患者FISH檢測(cè)MYB基因易位結(jié)果，與患者年齡、性別、腫瘤最大徑、病理學(xué)分級(jí)和預(yù)后均無(wú)相關(guān)性。

淚腺ACC比涎腺ACC臨床更為少見，但同樣具有特異性的MYB基因易位和MYB蛋白高表達(dá)，需聯(lián)合免疫組化和FISH檢測(cè)進(jìn)行診斷。本組淚腺非ACC的惡性腫瘤較少，特別是淚腺腺癌及淚腺腺泡細(xì)胞癌均為1例，不能完全除外其他非ACC的淚腺惡性上皮性腫瘤也有MYB蛋白表達(dá)或FISH檢測(cè)MYB基因易位的可能，需進(jìn)一步分析。同時(shí)，F(xiàn)ISH檢測(cè)只采用了斷裂探針，并未同時(shí)檢測(cè)其他可能存在的融合基因，不能除外其他基因易位的可能性，具有一定局限性。